Apelin在急性腎損傷中對(duì)腎小管上皮線粒體的保護(hù)作用

王麗妍 關(guān)毅鳴 刁宗禮 劉文虎

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是導(dǎo)致終末期腎病的重要因素[1]。腎小管上皮細(xì)胞損傷是急性腎損傷的核心病理環(huán)節(jié)，而線粒體損傷近年來被認(rèn)為是疾病的使動(dòng)因素[2,3]。Sirt3作為線粒體重要的去乙?；?，參與維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定[4]。Apelin是新近發(fā)現(xiàn)的生物活性肽，其受體APJ屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族[5]。Apelin/APJ系統(tǒng)在腎臟的各部位均有分布，參與調(diào)節(jié)腎臟的正常生理功能。在腎病綜合征、糖尿病腎病、高血壓腎損害等疾病狀態(tài)下，Apelin表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變，可能在一定程度上參與疾病的進(jìn)展[6]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Apelin可以延緩腎臟纖維化的進(jìn)展，但在急性腎損傷中的作用尚不清楚。本課題采用順鉑刺激體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞模型，圍繞Apelin/APJ受體——Sirt3相關(guān)信號(hào)通路，檢測(cè)其對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)的影響；采用順鉑誘導(dǎo)小鼠AKI模型，外源性補(bǔ)充Apelin，檢測(cè)腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而驗(yàn)證上述假設(shè)。該研究為探索AKI的新治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.試劑與儀器：順鉑(美國(guó)Sigma公司)、Apelin-13(英國(guó)Bachem公司)、Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)、Power SYBR green PCR Master Mix反應(yīng)液(瑞士Roche公司)、兔抗人乙?；嚢彼峥贵w(美國(guó)Cell Signaling公司)、鼠抗人動(dòng)力相關(guān)蛋白1抗體(英國(guó)Abcam公司)、鼠抗人視神經(jīng)萎縮蛋白1抗體(英國(guó)Abcam公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG抗體(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、ELISA試劑盒(南京建成生物工程公司)。ABI Prism 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)、EM UC6超薄切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)、透射電子顯微鏡Tecnai Spirit 120kV(美國(guó)FEI公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：原代人腎小管上皮細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司，經(jīng)復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，取第3～5代用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，用含5%胎牛血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)棄去培養(yǎng)基，換用含有5μmol/L順鉑和(或)1μmol/L Apelin-13的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24h。最后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

3.動(dòng)物模型的建立：8周齡雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量23±2g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22±1℃, 相對(duì)濕度(55±5)% 的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。通過一次性腹腔注射順鉑(20mg/kg)誘導(dǎo)AKI，從順鉑注射的次日起，每日腹腔注射Apelin-13(0.1μmol/kg)或等量0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)進(jìn)行干預(yù)。設(shè)立3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：正常對(duì)照組，不給予任何藥物干預(yù)；順鉑+生理鹽水組，實(shí)驗(yàn)第1天給予腹腔注射順鉑1次，實(shí)驗(yàn)第2～4天給予腹腔注射生理鹽水，每日1次；順鉑+Apelin組，實(shí)驗(yàn)第1天給予腹腔注射順鉑1次，實(shí)驗(yàn)第2～4天給予腹腔注射Apelin-13，每日1次。實(shí)驗(yàn)第4天結(jié)束，給予小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，摘眼球取血，膀胱穿刺留取尿液標(biāo)本，最后將小鼠處死，取腎臟標(biāo)本，用戊二醛固定。

4.RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞去乙酰化酶Sirt3的表達(dá)：采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按說明書進(jìn)行。引物由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成(正向引物：5′-ACCCAGTGGCATTCCAGAC-3′，反向引物：5′-GGCTTGGGGTTGTGAAAGAAG-3′)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μl，前后引物各1μl (10pmol/μl)，Power SYBR green PCR Master Mix反應(yīng)液10μl，加入去離子水至反應(yīng)總體積20μl。在ABI Prism 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)置程序，反應(yīng)參數(shù)：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為對(duì)照。

5.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞線粒體蛋白的表達(dá)：將細(xì)胞用冷的PBS洗滌，加入組織裂解液，于4℃、12000×g離心30min，BCA法測(cè)定蛋白含量。取100μg蛋白行12% SDS-PAGE電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用5% BSA-PBST封閉1h。分別用兔抗人乙?；嚢彼峥贵w(1∶1000)，鼠抗人動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1, Drpl)抗體(1∶800)、鼠抗人視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy 1, OPA1)抗體(1∶500)，于4℃孵育過夜。再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3000)于室溫孵育1h。洗膜后用ECL法顯色并曝光成像，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)軟件對(duì)特異性條帶做吸光度定量，以電壓依賴性陰離子通道蛋白(voltage-dependent anion channel of mitochondrial outer membrane, VDAC)作內(nèi)參，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

6.電鏡觀察小鼠腎臟線粒體形態(tài)：將腎臟標(biāo)本放入2.5%戊二醛中固定過夜，之后加入1%四氧化鋨固定2h。用新鮮的丙酮進(jìn)行梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋。將聚合好的包埋塊修塊，然后用EM UC6超薄切片機(jī)切片，每片厚度為70nm。用鋪有Formvar膜的載網(wǎng)將切片帶撈起，晾干后，用2%醋酸雙氧鈾溶液染色20min，再用2%檸檬酸鉛溶液染色5min，最后用蒸餾水沖洗，晾干。將制備好的超薄切片載網(wǎng)在透射電子顯微鏡中進(jìn)行觀察。

7.ELISA法檢測(cè)小鼠血漿和尿液腎損傷標(biāo)志物含量：采用摘眼球法取小鼠血液標(biāo)本，置于EDTA抗凝的真空采血管內(nèi)，膀胱穿刺法取小鼠尿液標(biāo)本。分別于4000×g離心15min，收集上清液，置于-80℃冰箱中保存。用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血漿Cr、BUN以及尿液Kim-1、NGAL含量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié) 果

1.Apelin拮抗順鉑對(duì)腎小管上皮細(xì)胞去乙?；窼irt3表達(dá)的抑制作用：采用RT-PCR檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞去乙?；窼irt3 mRNA的表達(dá)量，可見與正常對(duì)照組比較，順鉑組Sirt3的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，順鉑+Apelin組Sirt3的表達(dá)較順鉑組明顯升高(75.8%±8.3% vs 42.6%±9.4%,P<0.05)。采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞乙?；鞍椎乃剑c正常對(duì)照組比較，順鉑組細(xì)胞的乙酰化蛋白含量明顯升高，順鉑 +Apelin組乙?；鞍椎暮康陀陧樸K組(圖1)。

圖1 Apelin對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞Sirt3表達(dá)量和線粒體蛋白乙?；降挠绊懪c正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05

2.Apelin改善順鉑對(duì)腎小管上皮細(xì)胞線粒體蛋白表達(dá)的影響：采用Western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞線粒體分裂蛋白Drp1和線粒體融合蛋白OPA1的表達(dá)量。順鉑刺激細(xì)胞24h，可以使Drp1的表達(dá)量約增加至對(duì)照組的214%(P<0.05)，OPA1的表達(dá)量約減少至對(duì)照組的48%(P<0.05)。Apelin可以明顯抑制順鉑上調(diào)Drp1表達(dá)(152.7%±16.0% vs 214.3%±34.0%,P<0.05)、下調(diào)OPA1表達(dá)的效應(yīng)(76.1%±12.9% vs 47.9%±6.0%,P<0.05，圖2)。提示Apelin具體穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)的作用。

圖2 Apelim對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白OPA1和Drp1表達(dá)量的影響

3.Apelin對(duì)順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠腎臟線粒體形態(tài)的保護(hù)作用：采用透射電鏡觀察小鼠近端腎小管上皮線粒體形態(tài)，可見對(duì)照組線粒體大部分膜完整，內(nèi)嵴清晰，排列整齊。順鉑+生理鹽水組線粒體數(shù)量顯著減少，形態(tài)扭曲伴空泡變，大部分膜不完整，嵴的結(jié)構(gòu)斷裂甚至消失。而順鉑+Apelin組線粒體的病變程度輕于順鉑+生理鹽水組，可見線粒體的數(shù)量有所減少，部分線粒體膜尚完整，內(nèi)嵴尚清楚，但排列不整齊，部分線粒體發(fā)生空泡變(圖3)。

圖3 Apelin對(duì)順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠近端腎小管線粒體形態(tài)的影響(透射電鏡，×8000)A.正常對(duì)照組；B.順鉑+生理鹽水組；C.順鉑+Apelin組

4.Apelin減輕順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠的腎損傷：對(duì)小鼠血漿的ELISA檢測(cè)顯示，順鉑+生理鹽水組Cr、BUN的含量明顯高于對(duì)照組，分別為Cr (80.35±7.52μmol/L vs 15.18±1.50μmol/L,P<0.05)，BUN(30.70±2.42mmol/L vs 9.28±1.42mmol/L,P<0.05)。外源性補(bǔ)充Apelin可以使順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠腎功能有所改善，血漿Cr、BUN的含量顯著降低，分別為Cr 33.70±4.65μmol/L，BUN 22.07±1.87mmol/L，與順鉑+生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。對(duì)小鼠尿液的檢測(cè)顯示，順鉑+生理鹽水組Kim-1、NGAL的含量明顯高于對(duì)照組，分別為Kim-1(88.11±6.22μg/L vs 16.85±0.99μg/L,P<0.05)，NGAL (112.81±15.26μg/L vs 12.67±1.02μg/L,P<0.05)。外源性補(bǔ)充Apelin可以使順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠腎損傷標(biāo)志物的含量降低，分別為Kim-1 54.82±8.24μg/L，NGAL 58.53±7.09μg/L，與順鉑+生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表1)。

表1 各組小鼠腎損傷標(biāo)志物水平的比較

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與順鉑+生理鹽水組比較，#P<0.05

討 論

Apelin是新近發(fā)現(xiàn)的活性肽，它的受體APJ屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族。它的原前體肽由77個(gè)氨基酸組成，被分解后以多種形式的肽片段存在于體內(nèi)，其中Apelin-36、Apelin-13和Apelin-12最常見。針對(duì)正常大鼠腎臟的研究顯示，Apelin可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的釋放，起到舒張入球和出球小動(dòng)脈的作用，參與腎臟血流量的調(diào)節(jié)；它還能直接作用于集合管的抗利尿激素受體，參與體液平衡的調(diào)節(jié)[7]。目前，有報(bào)道顯示Apelin/APJ系統(tǒng)可以保護(hù)線粒體，因而在一些器官損傷中發(fā)揮有益作用[8, 9]。對(duì)缺氧/復(fù)氧刺激的心肌細(xì)胞給予Apelin類似物，可以減少線粒體活性氧的產(chǎn)生，抑制心肌細(xì)胞凋亡[10]。同樣，在心臟缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型中，外源性補(bǔ)充Apelin可以延遲線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，起到保護(hù)心肌的作用[11]。但在不同組織器官或不同病理狀態(tài)下，Apelin/APJ系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)存在差異，有時(shí)甚至起到完全相反的作用。針對(duì)器官纖維化的研究曾發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)會(huì)促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生，而對(duì)心肌纖維化具有抑制作用。

筆者既往的研究證實(shí)了Apelin通過激活蛋白激酶Cε(protein kinase Cε, PKCε)，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β, TGF-β)/Smads信號(hào)通路，可以減輕腎臟纖維化[12]。然而，最近有文獻(xiàn)報(bào)道，在急性腎缺血的動(dòng)物模型中，PKCε的活化可能是導(dǎo)致線粒體損傷的因素[13]。由于臨床上很多CKD是由AKI轉(zhuǎn)化而來的，但AKI的致病因素又和CKD不同，往往是較為短暫而強(qiáng)烈的刺激，其病理機(jī)制也不同于慢性纖維化時(shí)腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，而是以近端腎小管的線粒體損傷為核心環(huán)節(jié)。因此，AKI時(shí)Apelin能否保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞線粒體，起到減輕腎損傷的作用，目前尚無明確報(bào)道。

本研究建立了順鉑誘導(dǎo)AKI的小鼠模型，該模型是研究非免疫性急性腎損傷的成熟動(dòng)物模型。在注射順鉑后，可以觀察到實(shí)驗(yàn)組小鼠近端腎小管上皮線粒體出現(xiàn)明顯的損傷表現(xiàn)，數(shù)量顯著減少且形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，與既往的研究結(jié)果一致[14]。而每日腹腔注射Apelin能減輕上述病理變化，提示Apelin在AKI時(shí)對(duì)線粒體具有一定的保護(hù)作用。通過對(duì)小鼠血漿、尿液標(biāo)志物的檢測(cè)，筆者觀察到順鉑組小鼠血漿中反應(yīng)腎功能的Cr、BUN明顯升高，尿液中提示早期腎損傷的Kim-1、NGAL也明顯高于正常對(duì)照組。通過外源性補(bǔ)充Apelin能夠改善上述指標(biāo)的變化，因此可以認(rèn)為AKI時(shí)Apelin在整體水平具有減輕腎臟損傷的生物學(xué)效應(yīng)。

通過順鉑刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞模型，筆者對(duì)Apelin保護(hù)線粒體的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。目前研究認(rèn)為，線粒體作為一種雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，不斷進(jìn)行著分裂和融合，其動(dòng)態(tài)平衡會(huì)影響線粒體的功能[15, 16]。在橫紋肌溶解致AKI的大鼠模型中觀察到，腎小管上皮細(xì)胞分裂蛋白Drp1的聚集增多，伴隨線粒體斷裂、ATP生成減少和ROS的釋放，給予線粒體分裂抑制劑1(Mdivi-1)可以有效抑制Drp1的聚集，維持線粒體的正常功能[17]。而線粒體蛋白的翻譯后修飾與線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其中去乙酰化酶Sirt3發(fā)揮著重要的作用。它是哺乳動(dòng)物Sirtuin蛋白家族成員，屬于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙?；割?。目前共發(fā)現(xiàn)7個(gè)Sirtuin家族成員(Sirt1～7)，其中Sirt3主要定位于線粒體。Sirt3基因敲除小鼠線粒體多種蛋白的乙?；皆黾?，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，最終引起細(xì)胞凋亡和組織損傷[18]。本研究觀察到，向體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中加入順鉑，會(huì)顯著降低Sirt3的表達(dá)，引起細(xì)胞乙?；鞍姿皆黾樱M(jìn)而使線粒體分裂蛋白Drp1表達(dá)增加，線粒體融合蛋白OPA1表達(dá)降低，提示線粒體損傷的發(fā)生。當(dāng)給予Apelin共同孵育時(shí)，順鉑下調(diào)Sirt3表達(dá)的作用受到抑制，細(xì)胞乙?；鞍椎乃揭灿兴档?，Drp1和OPA1的表達(dá)趨于正常。上述結(jié)果證明，Apelin通過促進(jìn)去乙酰化酶Sirt3的表達(dá)，維持線粒體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而拮抗順鉑對(duì)線粒體的損傷。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，活化G蛋白偶聯(lián)受體——膽汁酸受體TGR5，可以增加過氧化物酶體增生物激活受體 γ 輔激活因子-1α(PGC-1α)和雌激素相關(guān)受體α(ERRα)的表達(dá)，二者均為 Sirt3的上游信號(hào)分子。ERRα能結(jié)合到Sirt3的啟動(dòng)子區(qū)，且PGC-1α可以增強(qiáng)其結(jié)合能力，它們協(xié)同作用能夠促進(jìn)Sirt3的表達(dá)[19]。由此筆者推測(cè)，同樣屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的APJ，在AKI時(shí)Apelin可能也通過活化上述信號(hào)通路增加Sitr3的表達(dá)，進(jìn)而起到保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞線粒體、減輕腎損傷的作用。由于人體是十分復(fù)雜的有機(jī)體，僅憑上述簡(jiǎn)單的細(xì)胞和動(dòng)物模型無法完全了解Apelin/APJ系統(tǒng)與AKI發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系，尚需開展進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)機(jī)制做深入探討。

綜上所述，本研究證實(shí)了多肽Apelin在順鉑誘導(dǎo)的AKI中具有一定的腎臟保護(hù)作用，并初步闡明Apelin通過調(diào)節(jié)去乙酰化酶Sirt3，維持腎小管上皮細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)，從而減輕腎臟損傷的分子生物學(xué)機(jī)制。