38種中草藥對(duì)大菱鲆源副溶血弧菌的抑殺效果

任 海，華智杰，魏云卓，王 宇，靳曉敏

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

弧菌病(Vibriosis)是世界各國海水養(yǎng)殖魚、蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)動(dòng)物危害最大的疾病，常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的打擊[1]?；【?Vibrio)是海洋環(huán)境中最常見一類條件致病菌，是水產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一。目前，國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的弧菌病病原主要有鰻弧菌(V.anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、擬態(tài)弧菌(V.mimicus)和創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)等[2]。其中，副溶血弧菌為革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，無莢膜及芽孢，廣泛存在于養(yǎng)殖水域中，是海洋動(dòng)物主要條件致病菌之一[3]，能夠引起包括魚、蝦、蟹、貝等多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病，給水產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。另外，該菌屬于人畜共患病原菌，能夠通過食源污染影響人類健康，常引起人體患急性腸胃炎并會(huì)伴有腹瀉、嘔吐、腹部痙攣等癥狀，嚴(yán)重者能夠?qū)е氯梭w死亡[5]。近年來，已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道副溶血弧菌可以侵染大黃魚[6]、三斑鲹[5]、半滑舌鰨[7]、凡納濱對(duì)蝦[8]和九孔鮑[9]等多種水產(chǎn)動(dòng)物。

目前對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病防治方面，以使用化學(xué)合成藥物和抗生素類藥物為主。隨著抗生素的頻繁使用，許多細(xì)菌已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性問題，而且產(chǎn)生多重耐藥菌株，細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，致使臨床感染死亡率不斷增高[10,11]。在長期的使用過程中，人們逐漸認(rèn)識(shí)到這些藥物的不足之處，如預(yù)防作用弱，易產(chǎn)生耐藥性，抗菌譜窄，污染水環(huán)境等[1]。我國中草藥種類繁多，大部分價(jià)格低廉、來源方便、無毒副作用或者毒副作用低且不易產(chǎn)生耐藥性，還具有提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力，提高其抗應(yīng)激能力等多重功效[12]。研究顯示，很多具有清熱、抗炎和解毒的中草藥均具有抗菌作用[13]。王玉娥等[14]測定了10種常用中草藥對(duì)5種海洋致病弧菌的抑菌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五倍子和黃連可作為防治水產(chǎn)動(dòng)物弧菌病的首選藥物；王洪彬等[15]報(bào)道16種常用中草藥對(duì)4種水產(chǎn)動(dòng)物致病菌體外抑菌效果的研究中發(fā)現(xiàn)，蘇木、女貞子、夏枯草、青皮均具有很好的抑菌作用。鄭天倫等[16]研究了15種中草藥對(duì)大黃魚源溶藻弧菌的體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石榴皮、地榆、五味子和大黃的抑菌能力最強(qiáng)。目前，副溶血弧菌對(duì)大菱鲆的危害已有相關(guān)報(bào)道[17]，但是對(duì)于中草藥對(duì)大菱鲆源副溶血弧菌抑殺效果未見相關(guān)報(bào)道。為此，筆者針對(duì)副溶血弧菌選擇了38種中草藥，確定其抗菌作用，以期為大菱鲆養(yǎng)殖過程中防治副溶血弧菌病的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株來源于河北科技師范學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室，分離于秦皇島某養(yǎng)殖場患病大菱鲆，并經(jīng)過形態(tài)特征、理化特點(diǎn)、致病性以及分子生物學(xué)鑒定證實(shí)為致病性副溶血弧菌。

1.2 中草藥及其來源

選擇的38種中草藥為：大黃、郁金、柴胡、五倍子、車前子、紫錐菊、蘇木、當(dāng)歸、梔子、青蒿、魚腥草、黃芩、虎杖、貫眾、苦參、淫羊藿、黃連、黃芪、黃柏、大青葉、連翹、白頭翁、烏梅、穿心蓮、地錦草、益母草、何首烏、甘草、地榆、秦皮、石榴皮、丁香、地丁、女貞子、川棘子、赤芍、茵陳、訶子，均購自河北省昌黎縣百草堂藥店。

1.3 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂，營養(yǎng)肉湯，96孔酶標(biāo)板均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，其他試劑均由水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 主要儀器

電子天平CP224C，奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)ZRJH-C1112B，上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)；全溫振蕩培養(yǎng)箱BSD-100，電熱恒溫培養(yǎng)箱HPX-9082MBE，電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9076MBE，均為上海博迅醫(yī)療生物股份有限公司生產(chǎn)；高壓蒸汽滅菌器MLS-3751L-PC，日本Panasonic公司生產(chǎn)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1中草藥藥液的制備 將上述38種中草藥分別稱取10 g放到400mL燒杯中，用蒸餾水浸泡3 h后用大火煮至沸騰，文火煎1 h，第一次煎煮藥物時(shí)需要加入400 mL蒸餾水，然后再用6層紗布過濾，過濾后的藥渣中再加入200 mL的蒸餾水用文火煮大約1 h，消毒紗布過濾后，將兩次所得藥液定容至50 mL，制成200 g/L[10,11]的中草藥原藥液，裝瓶、高壓滅菌后置于冰箱4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2牛津杯打孔培養(yǎng)基的制作 將固體培養(yǎng)基從高壓蒸汽滅菌器內(nèi)拿出，放到超凈工作臺(tái)內(nèi)，待冷卻到大約60 ℃，搖勻后倒入到玻璃平板一層，使液體培養(yǎng)基均勻覆蓋玻璃平板底部即可，待冷卻凝固后小心放入牛津杯，每個(gè)玻璃平板均勻放置5個(gè)牛津杯，然后再緩緩倒入第二層培養(yǎng)基，厚度大約為整個(gè)平板的2/3即可，待培養(yǎng)基冷卻凝固后小心取出牛津杯，將平板置于冰箱4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3菌種的活化 將副溶血弧菌置于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，整個(gè)過程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作。

1.5.4試驗(yàn)菌液的制備 取出活化好的副溶血弧菌平板，用接種環(huán)在無菌條件下挑取菌落，將菌落溶解到1 mL無菌生理鹽水中制成菌懸液，參照麥?zhǔn)媳葷峁苁蛊錆舛冗_(dá)到1×1011cfu/L。

1.5.5抑菌效果判定 采用牛津杯打孔培養(yǎng)基進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)測定，每種中草藥重復(fù)測定3次，取其平均值作為最終抑菌直徑。具體為：首先把菌液用滅菌棉簽均勻涂布于打孔培養(yǎng)基上，然后將中草藥藥液分別加入到每個(gè)孔內(nèi)，以加滿而不溢出孔外為宜，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)以抑菌圈直徑≥20 mm判定為高度敏感(HS)，在10～19 mm判定為敏感(S)，<10 mm判定為耐藥(R)。

1.5.6最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用菌液涂布法和改良微量二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，具體操作參考任海等[12]和張?jiān)露鸬萚14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 38種中草藥對(duì)副溶血弧菌的抑菌作用

副溶血弧菌對(duì)38種中草藥敏感程度的試驗(yàn)結(jié)果表明：大菱鲆源副溶血弧菌對(duì)訶子、秦皮、石榴皮、黃連、黃芩、五倍子高度敏感，其抑菌圈直徑為20～27 mm(表1)，其中五倍子的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為27 mm；其次為石榴皮和黃連，抑菌圈直徑為25 mm；對(duì)淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、梔子、連翹、蘇木、烏梅、赤芍、地錦草、女貞子、黃柏、虎杖、白頭翁、川棘子敏感，其抑菌圈直徑為11～19 mm；對(duì)益母草、貫眾、甘草、大黃、大青葉、茵陳、郁金、當(dāng)歸、黃芪、柴胡、何首烏和穿心蓮不敏感。

表1 38種中草藥對(duì)副溶血弧菌的抑菌作用 mm

注：敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)以抑菌圈直徑≥20 mm判定為高度敏感(HS)；抑菌圈直徑10～19 mm判定為敏感(S)；抑菌圈直徑<10 mm的判定為耐藥(R)；無抑菌圈形成記作0。

2.2 21種對(duì)副溶血弧菌有抑菌作用的中草藥對(duì)副溶血弧菌的MIC

由表1結(jié)果中選取具有抑菌作用的21種中草藥進(jìn)行副溶血弧菌的MIC測定。結(jié)果表明：21種中草藥對(duì)副溶血弧菌有不同程度的抑菌作用(表2)。其中抑菌效果最好的為五倍子、秦皮、黃連、黃芩、訶子和石榴皮，對(duì)副溶血弧菌抑菌效價(jià)均達(dá)到1∶128，即MIC為1.56 g/L；其次為淫羊藿、丁香、地榆、梔子、連翹、地錦草、蘇木、赤芍、烏梅和青蒿，抑菌效價(jià)為1∶64，即MIC為3.13 g/L；女貞子、黃柏、虎杖和川棘子的抑菌效價(jià)為1∶16，即MIC為12.50 g/L；白頭翁抑菌效價(jià)最低，為1∶8，即MIC為25.00 g/L。

2.3 21種對(duì)副溶血弧菌有抑菌作用的中草藥對(duì)副溶血弧菌的MBC

由表1結(jié)果中選取具有抑菌作用的21種中草藥進(jìn)行副溶血弧菌的MBC測定。結(jié)果表明：21種中草藥對(duì)副溶血弧菌有不同程度的殺菌效果(表3)。其中以秦皮、五倍子、黃連、石榴皮、訶子、黃芩的殺菌效果最好，對(duì)副溶血弧菌的殺菌效價(jià)均達(dá)到了1∶64，即MBC為3.13 g/L；其次為淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、梔子、連翹、地錦草、蘇木、烏梅和赤芍，殺菌效價(jià)均達(dá)到1∶32，即MBC為6.25 g/L；女貞子、黃柏、虎杖和川棘子的殺菌效價(jià)均達(dá)到1∶8，即MBC為25.00 g/L；白頭翁殺菌效價(jià)最低，為1∶4，即MBC為50.00 g/L。

3 討 論

近年來，中草藥被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治中。有關(guān)中草藥防治不同水產(chǎn)動(dòng)物來源的副溶血弧菌病已經(jīng)有過多篇記載和報(bào)道。梁利國等[18]研究常用中草藥對(duì)4種病原弧菌體外抗菌效果中發(fā)現(xiàn)，五倍子、蘇木、黃芩、地錦草和石榴皮等對(duì)副溶血弧菌具有較好的抑菌效果；王玉娥等[14]研究副溶血弧菌對(duì)34種中草藥的敏感性測定試驗(yàn)中的結(jié)果表明，副溶血弧菌對(duì)五倍子、黃連和烏梅等具有比較高的敏感性；毛芝娟等[19]的試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，五倍子煎煮液對(duì)溶藻弧菌和副溶血弧菌均有很強(qiáng)的抑菌活性；侯竹美[20]研究證實(shí)，五倍子和石榴皮對(duì)副溶血弧菌有較強(qiáng)抑菌作用；李華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，五倍子、石榴皮、黃芩、黃連和烏梅的對(duì)副溶血弧菌的抑殺效果較為明顯。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，大菱鲆源副溶血弧菌對(duì)黃連、五倍子、秦皮、訶子、石榴皮、黃芩、蘇木、烏梅、連翹和黃柏等均具有很強(qiáng)的敏感性，抑菌直徑達(dá)到20 mm以上，其中五倍子、黃連和石榴皮對(duì)副溶血弧菌均具有高度的敏感性，抑菌直徑達(dá)到25 mm以上，本次試驗(yàn)結(jié)果與上述研究者的研究結(jié)果相似。另外，本次試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃、當(dāng)歸和穿心蓮對(duì)副溶血弧菌無抑菌作用，該結(jié)果與毛芝娟等[19]研究的大黃對(duì)鋸緣青蟹源副溶血弧菌具有強(qiáng)的抗菌性結(jié)果相反，出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于中草藥和供試菌株的不同來源導(dǎo)致藥物對(duì)其敏感性存在差異[22]。藥物對(duì)弧菌的作用有選擇性的，而不同來源的弧菌對(duì)不同藥物的敏感性也是有差異的。因此，在殺滅不同來源弧菌時(shí)選擇敏感的藥物顯得尤為重要。

筆者利用微量二倍稀釋法和液體涂布法，進(jìn)一步確定了本次試驗(yàn)中具有抑菌效果的21種中草藥對(duì)大菱鲆源副溶血弧菌的MIC和MBC。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五倍子、秦皮、黃連、黃芩、訶子和石榴皮的MIC和MBC最好，抑菌和殺菌效價(jià)分別達(dá)到了1∶128和1∶64，即MIC和MBC分別為1.56 g/L和3.12 g/L。毛芝娟等[19]研究了石榴皮、五倍子、穿心蓮、大黃等中草藥對(duì)副溶血弧菌的抑菌和殺菌作用，發(fā)現(xiàn)五倍子煎煮液對(duì)副溶血弧菌有很強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，MIC和MBC均達(dá)到1.56 g/L和3.12 g/L。本次試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)五倍子對(duì)副溶血弧菌敏感性最好。李華等[21]研究幾種中草藥對(duì)海水養(yǎng)殖中常見病原菌的抗菌作用中也發(fā)現(xiàn)，五倍子和石榴皮的抑菌殺菌效果最好，而白頭翁效果一般。王玉娥等[14]的研究結(jié)果證實(shí)，白頭翁對(duì)副溶血弧菌效果差。本次試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，白頭翁的MIC和MBC最差，與上述學(xué)者研究結(jié)果相似。另外，本次試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大菱鲆源副溶血弧菌與其他水產(chǎn)動(dòng)物來源的副溶血弧菌，抑菌殺菌敏感中草藥的種類具有很高的相似性。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中可以考慮選用敏感中草藥作為防治不同動(dòng)物源副溶血弧菌的藥物。

表2 21種中草藥對(duì)副溶血弧菌的MIC g/L

注：“-”表示平板上無菌生長或少量菌生長；

“+”表示平板上有大量菌生長。

表3 21種中草藥對(duì)副溶血弧菌的MBC g/L

注：“-”表示平板上無菌生長；“+”表示平板上有菌生長。

4 結(jié)論與建議

本次試驗(yàn)采用38種中草藥對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行體外抑菌效果測定，結(jié)果表明，石榴皮、黃芩、訶子、五倍子、黃連等中草藥的抑菌和殺菌能力最強(qiáng)，其抑菌直徑20～27 mm，MIC和MBC分別為1.56 g/L和3.13 g/L；其次是淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、梔子等，抑菌直徑為11～19 mm，其MIC和MBC分別為3.13 g/L和6.25 g/L。在實(shí)際生產(chǎn)中建議用價(jià)格相對(duì)較低，抑菌效果較好的石榴皮、五倍子、黃芩和丁香對(duì)大菱鲆源副溶血弧菌進(jìn)行抑殺。