桃果實(shí)縫合線部位軟化相關(guān)基因PpPME48的克隆與分析

劉璐琪，石天磊，申艷紅，武軍凱，王海靜，張立彬

(河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島，066000)

桃(Prunuspersica(L.)Batsch)原產(chǎn)中國(guó)，是薔薇科中重要果樹(shù)之一，也是中國(guó)最古老的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)之一，在我國(guó)栽培歷史悠久，種植面積大，分布廣泛[1]。但是，桃果實(shí)采后迅速軟化、腐爛變質(zhì)，影響其銷(xiāo)售與貯運(yùn)[2]。尤其是有些桃品種出現(xiàn)縫合線處局部變軟的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益，若提前采摘又會(huì)影響果實(shí)品質(zhì)。果實(shí)軟化過(guò)程中質(zhì)地的變化主要是果膠降解導(dǎo)致細(xì)胞壁的降解，同時(shí)也與纖維素和半纖維素的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[3]。其中，果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)在果實(shí)軟化中起著關(guān)鍵作用，它主要存在于高等植物以及一些細(xì)胞壁降解的微生物中，屬于水解酶類，是一種糖蛋白，能水解水溶性果膠分子中甲氧基(-OCH2)與半乳糖醛酸之間的酯鍵，從而形成果膠酸和甲醇，再經(jīng)過(guò)PG(Polygalacturonase)作用形成游離的半乳糖醛酸[4,5]。目前，在番茄[6]、菠蘿蜜[7]、柑橘[8]、樹(shù)莓[9]、杏[10]和櫻桃番茄[11]等果實(shí)中都已證明PME對(duì)果實(shí)軟化的作用。同時(shí)許多研究表明，一些PMEs基因表達(dá)不受空間、時(shí)間的影響，在植株的整個(gè)生命歷程中均持續(xù)表達(dá)[12]，另一些則只在根發(fā)育時(shí)期、莖伸長(zhǎng)時(shí)期、果實(shí)成熟時(shí)期或花芽和花粉管等器官組織中特異性表達(dá)[13～16]。為探討PpPME48基因與桃果實(shí)縫合線部位軟化的相關(guān)性，筆者試驗(yàn)克隆桃PpPME48基因并分析其在不同品種、不同部位中的表達(dá)特性，旨在為研究PpPME48基因在桃軟化方面的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本課題組發(fā)現(xiàn)撫寧區(qū)代莊村的北京2號(hào)突變體枝條所結(jié)果實(shí)比野生型枝條所結(jié)果實(shí)晚熟，且縫合線處果肉易變軟。各取3個(gè)果，切取其縫合線和對(duì)應(yīng)果面的果肉，取樣后用液氮快速冷凍，置-80 ℃保存。共得到4個(gè)樣品：分別記為WSP(野生型縫合線果肉)、WP(野生型果面果肉)、MSP(突變體縫合線果肉)、MP(突變體果面果肉)，送廣州基迪奧生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

采用桃品種燕紅和晚久保進(jìn)行驗(yàn)證，燕紅縫合線處易變軟，晚久?？p合線處不易變軟。這2個(gè)桃品種采摘于秦皇島市昌黎縣兩山鄉(xiāng)種植園，在果實(shí)八成熟時(shí)，采收大小一致，無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)置于25 ℃室溫下貯藏。在采收后當(dāng)天、第3天、第5天選取3個(gè)果實(shí)分別切取縫合線和果面部位果肉，分別切碎混勻，于液氮中迅速冷凍，置-80 ℃低溫保存。燕紅與晚久保共獲得以下12份樣品：LF1與WF1，LF2與WF2，LF3與WF3，分別為燕紅與晚久保采收當(dāng)天、第3天與第5天縫合線果肉；LG1與WG1，LG2與WG2，LG3與WG3，分別為采收當(dāng)天、第3天與第5天果面果肉。這些樣品用于RNA的提取及熒光定量PCR進(jìn)行基因表達(dá)定量分析。

1.2 方法

1.2.1桃PpPME48基因的克隆 按照植物RNA提取試劑盒(博邁德生物)說(shuō)明書(shū)提取燕紅果肉總RNA，使用超微量分光光度計(jì)(BioDrop)檢測(cè)濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，按照Invitrogen GenRacerTMKit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以桃果肉RNA(1 000 ng)為模板得到雙鏈 cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

在測(cè)得的桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢測(cè)到PME基因家族17個(gè)基因成員，在桃基因組中找到PpPME48基因序列，利用DNAMAN軟件在該序列兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PME48-F：5′-CCCTTCCCATCCATCAATC-3′；PME48-R：5′-CTGCAGAACCGGC TTTGTTA-3′。由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成引物。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL：10×ExBuffer：2 μL，dNTP：1.5 μL，ExTaq酶：0.1 μL，cDNA：1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O：14.4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，循環(huán)34次，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用質(zhì)量濃度為12.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化目的條帶，回收產(chǎn)物與PMD19-T vector載體連接，轉(zhuǎn)化Super DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂到加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14 h，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，隨機(jī)挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯和同源序列分析，利用NCBI Blastp搜索同源基因和蛋白序列；利用MEGA 5.10軟件的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)等在線工具進(jìn)行氨基酸基本理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)網(wǎng)站對(duì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);利用SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)分別進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.2.3桃PpPME48基因的表達(dá)分析 利用DNAMAN軟件在PpPME48基因的非保守區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，RT-PME48-F:5′-CACTCTGAGCGCGACAAG-3′；RT-PME48-R:5′-CCGATGAAGAAGCAAAGCC-3′。引物合成由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成。提取采后不同時(shí)期燕紅和晚久?？p合線及果面部位的果肉RNA，分別將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以稀釋1倍的cDNA作為RT-qPCR的模板，使用購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)有限公司的Bio-Rad CF CONNECTTMReal-Time System熒光定量PCR儀檢測(cè)基因的表達(dá)量。參考佟兆國(guó)[17]篩選的桃內(nèi)參基因TEF2設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，TEF2-F：5′-GGTGTGACGATGAAGAGTGATG-3′；TEF2-R：5′-TGAAGGAGAGGGA AGGTGAAAG-3′。RT-qPCR反應(yīng)體系為10 μL體系：SYBR Mix：5 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA：1 μL，ddH2O：2 μL。兩步法擴(kuò)增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，39次循環(huán)。采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法[18]進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)測(cè)定，然后利用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

分別提取燕紅和晚久保在采后當(dāng)天、第3天和第5天的縫合線和果面處果肉提取RNA，超微量分光光度計(jì)(BioDrop)檢測(cè)OD260/OD280比值均在2.0以上，表明提取的RNA無(wú)降解，質(zhì)量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖1，RNA條帶清晰無(wú)彌散，28 s RNA條帶亮度約為18 s RNA條帶的2倍，檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明所提RNA質(zhì)量良好可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 桃PpPME48基因的篩選和克隆

將從實(shí)驗(yàn)室已完成的桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出15個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證(圖2)。15個(gè)差異基因的表達(dá)趨勢(shì)均與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，這證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)到24個(gè)的PME基因，表達(dá)量見(jiàn)表1，刪除部分部位表達(dá)量為0的基因，剩下17個(gè)PME基因進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中基因PpPME48在野生型縫合線(WSP)表達(dá)量高于野生型果面(WP)(圖3)，同時(shí)突變體縫合線(MSP)表達(dá)量也遠(yuǎn)高于突變體果肉(MP)中的表達(dá)量，在突變體中MSP和MP之間相差倍數(shù)高達(dá)13倍，因此選擇該基因?yàn)樘臆浕嚓P(guān)的候選基因并做進(jìn)一步研究。

以燕紅果肉cDNA為模板，PME48-F和PME48-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)條帶在1 000 bp以上，與預(yù)期目的基因大小一致(圖4)。用膠回收試劑盒回收目的條帶，將回收產(chǎn)物和PMD19T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆菌落8個(gè)，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，有7個(gè)菌落擴(kuò)增出特異性條帶且條帶大小約1 200 bp，PpPME48基因的克隆陽(yáng)性率達(dá)到87%，在陽(yáng)性克隆中隨機(jī)挑選3個(gè)送中美泰和公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序長(zhǎng)1 278 bp，與已知差異片段重疊，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)堿基差異。將其命名為PpPME48，GenBank登錄號(hào)為MT019687。

表1 PME基因表達(dá)量

圖2 RT-qPCR轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證

圖3 桃果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中PME熱圖分析

圖4 PpPME48基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(M:DL2000)

2.3 桃PpPME48基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析

桃PpPME48基因編碼370個(gè)氨基酸。通過(guò)ProtParam分析可知，桃PpPME48蛋白質(zhì)分子量為41 187.06 ku，分子式C1 856H2 860N500O533S15，理論等電點(diǎn)為8.79，PpPME48蛋白總的負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為37個(gè)，正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為43個(gè)。該蛋白由20種氨基酸構(gòu)成，其中丙氨酸所占比例最大(8.1%)，半胱氨酸所占比例最小(1.4%)。該蛋白脂肪系數(shù)為77.76，不穩(wěn)定指數(shù)為31.59，為穩(wěn)定蛋白；該蛋白親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.158，屬親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PpPME48蛋白有1個(gè)信號(hào)肽，為分泌蛋白，裂解位點(diǎn)的位置在27和28之間。利用TMHMM在線分析結(jié)果表明，桃PpPME48蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)。使用Prot Comp 9.0在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析可知，桃PpPME48蛋白主要位于細(xì)胞外基質(zhì)。利用SMART對(duì)其編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，表明PpPME48蛋白包含1個(gè)果膠甲酯酶結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸的75～361位點(diǎn)。

用SOPMA對(duì)PpPME48蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其中包括21.62%的α-螺旋、6.76%的β-轉(zhuǎn)角、30.81%的延伸鏈和40.81%的無(wú)規(guī)則卷曲，且其中所占比例最高的為無(wú)規(guī)則卷曲。通過(guò)SWISS-MODEL在線分析工具進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。可以看出，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相符。

2.4 桃PpPME48基因同源分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)BlastP比對(duì)發(fā)現(xiàn)PpPME48基因編碼的氨基酸序列與扁桃(Prunusdulcis)、烏梅(Prunusmume)、甜櫻桃(Prunusavium)、蘋(píng)果(Malusdomestica)具有很高的同源性，序列相似程度最高，相似率分別為98.11%，96.22%，94.86%，82.79%。利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果顯示，桃PME蛋白與其他物種PME蛋白具有相似結(jié)構(gòu)域(圖6)，包括5個(gè)高度保守區(qū)：RegionⅠ(GxYxE)，RegionⅡ(QAVAxR)，RegionⅢ(QDTL)，RegionⅣ(Gxx DFIFG)，RegionⅤ(YLGRxWx)。利用MEGA5.1進(jìn)行系統(tǒng)譜系分析發(fā)現(xiàn)，PpPME48與薔薇科的扁桃、烏梅和甜櫻桃親緣關(guān)系較近(圖7)。

注：紅框區(qū)域表示5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域

圖7 PpPME48蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

圖8 PpPME48基因的表達(dá)分析

2.5 桃PpPME48基因在不同品種不同貯藏時(shí)間的表達(dá)分析

燕紅是縫合線易變軟品種，晚久保是縫合線不易軟品種。隨著果實(shí)后熟，PpPME48基因在2個(gè)品種的縫合線和果肉部位的表達(dá)趨勢(shì)都是先升高后降低，在采收后第3天表達(dá)量達(dá)到最高(圖8)。然而在燕紅中，PpPME48基因在縫合線處的表達(dá)量明顯高于果面，且在采后各時(shí)期、部位的表達(dá)亦明顯高于晚久保，這說(shuō)明燕紅的縫合線變軟可能與PpPME48基因的高表達(dá)相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

果實(shí)軟化是果實(shí)成熟標(biāo)志之一，同時(shí)是一個(gè)復(fù)雜的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過(guò)程，果實(shí)在儲(chǔ)藏過(guò)程中仍然不斷軟化。許多研究表明，果實(shí)軟化與果膠甲酯酶(PME)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纖維素酶(Cellulases，CX)等密切相關(guān)，其中果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性增強(qiáng)導(dǎo)致果膠等細(xì)胞壁物質(zhì)降解，從而引起果實(shí)硬度下降、質(zhì)地變軟。果膠甲酯酶抑制劑(Pectin methylesterase inhibitors，PMEI)抑制果膠甲酯酶去甲酯化作用，從而調(diào)控PME的活性。曾文芳等[19]在溶質(zhì)型桃和硬質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中發(fā)現(xiàn)1個(gè)PME和2個(gè)PMEI基因在溶質(zhì)型桃中高表達(dá)，是研究桃果實(shí)成熟軟化的關(guān)鍵基因。Xue等[20]在草莓研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)vPME38和FvPME39在果實(shí)成熟過(guò)程中大量表達(dá)導(dǎo)致草莓軟化，并加速果實(shí)成熟進(jìn)程。Tieman等[21]在研究番茄中發(fā)現(xiàn)，PME對(duì)果實(shí)軟化影響顯著，但是不影響果實(shí)成熟進(jìn)程。因此，不同植物的PME表現(xiàn)不同功能，可能是果實(shí)發(fā)育過(guò)程的多樣性導(dǎo)致。同時(shí)，許多研究表明，PME的活性在不同種類、不同品種的果實(shí)中表現(xiàn)不同，起著不同作用。在蘋(píng)果中，魏建梅等[22]發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)軟化過(guò)程中，PME的活性逐漸增加，且在不同時(shí)期不同品種中存在差異，受乙烯調(diào)控的影響。在杏中，Botondi等[23]發(fā)現(xiàn)，品種Ceccona中果膠甲基酯酶(PME)活性均呈下降趨勢(shì)，果實(shí)成熟過(guò)程中硬度不變；而在品種San Castrese中，PME活性略有升高，果實(shí)在成熟過(guò)程中變軟。在茄子中，趙云峰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，采后果肉PME活性呈峰型變化。

果膠甲酯酶是一個(gè)龐大的基因家族，在植物中檢測(cè)到多種PME同工異構(gòu)體，它們的分子量、等電點(diǎn)和生物化學(xué)活性都不相同[25]。霍如雪等[26]在桃PME基因家族中鑒定出69個(gè)PME蛋白，按照基因和蛋白的結(jié)構(gòu)分為T(mén)ypeⅠ，TypeⅡ兩類。Type Ⅱ類PME蛋白具有1個(gè)比較長(zhǎng)的N-端PRO區(qū)域，而TypeⅠ類PME蛋白的PRO區(qū)域很短甚至缺失，PpPME48具有1個(gè)比較長(zhǎng)的PRO區(qū)域，屬于TypeⅡ。PpPME48全長(zhǎng)1 113 bp，共編碼370個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為41 187.06 ku，理論等電點(diǎn)為8.79，翻譯后的蛋白序列含有果膠甲酯酶的重要結(jié)構(gòu)域，與扁桃(Prunusdulcis)、烏梅(Prunusmume)、甜櫻桃(Prunusavium)的PME蛋白有很高的同源性。PpPME48在北京2號(hào)桃突變體縫合線部位的表達(dá)量是其果面部位表達(dá)量的13倍，說(shuō)明該基因可能參與了縫合線部位的變軟。RT-qPCR分析表明，PpPME48基因在縫合線易軟品種中表達(dá)量顯著高于不易軟品種，且在易軟品種燕紅中，PpPME48在縫合線處的表達(dá)量顯著高于果面，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相符。由此可知，PpPME48基因在桃果實(shí)軟化過(guò)程中起重要作用，并且與縫合線部位的軟化密切相關(guān)。