流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海洋浮游異養(yǎng)細(xì)菌異質(zhì)性的研究進(jìn)展

趙苑，董逸，李海波，趙麗，張武昌，肖天

（1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071）

細(xì)菌群落中的單個(gè)細(xì)菌在生理狀態(tài)、代謝活性、化學(xué)組成、基因轉(zhuǎn)錄翻譯、行為等多個(gè)方面存在差異，即細(xì)菌個(gè)體間的異質(zhì)性，區(qū)分細(xì)菌群落中不同個(gè)體特征的研究被稱為單細(xì)胞微生物學(xué)（Brehm-Stecher et al，2004；Ishii et al，2010）。海洋浮游異養(yǎng)細(xì)菌（以下簡(jiǎn)稱浮游細(xì)菌）在海洋有機(jī)物降解和溶解有機(jī)碳轉(zhuǎn)化中起著重要作用，同時(shí)也是影響海洋凈生產(chǎn)力的重要生物因素（張異凡等2019）。它們種類繁多，胞內(nèi)含幾千種化合物，代謝反應(yīng)（途徑）極其多樣，所以自然海水中各個(gè)細(xì)菌除了種類的差別之外，也存在生理代謝和化學(xué)組成的異質(zhì)性，對(duì)浮游細(xì)菌異質(zhì)性及其影響因素的研究是理解細(xì)菌生產(chǎn)、代謝及其在生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用的基礎(chǔ)。

浮游細(xì)菌生理代謝和化學(xué)組成的異質(zhì)性可以依據(jù)不同的指標(biāo)進(jìn)行研究（Del Giorgio et al，2008；Grégori et al，2001；Hammes et al，2011）。浮游細(xì)菌的生理代謝包括細(xì)菌的存活狀態(tài)和代謝活性。存活狀態(tài)是100 年以前使用的概念，它依賴于培養(yǎng)方法（Hammes et al，2011），將細(xì)菌涂布在瓊脂平板上能生長(zhǎng)形成菌落的即為活的，不能生長(zhǎng)的為死的，這曾經(jīng)是判斷細(xì)菌存活的金標(biāo)準(zhǔn)（Buysschaert et al，2016）。但很多細(xì)菌在環(huán)境中處于“具有活性但無(wú)法培養(yǎng)”的狀態(tài)（Roszak et al，1984），這些細(xì)菌無(wú)法在平板上生長(zhǎng)，但仍保持一定代謝能力，在適宜環(huán)境條件下可以復(fù)活并繁殖。使用落射熒光顯微鏡來(lái)計(jì)數(shù)海水中浮游細(xì)菌豐度的方法是浮游細(xì)菌研究的重要突破（Hobbie et al，1977），相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)人們認(rèn)為這個(gè)方法得出的是存活的細(xì)菌豐度，然而Zweifel 等（1995）使用表面熒光顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)使用DNA 熒光染料DAPI（4＇，6-二脒 基-2 - 苯 基 吲 哚， 4＇ ， 6 -diamidino -2 -phenylindole）染色的波羅的海水樣中，僅有少數(shù)（2%～32%）細(xì)菌可以觀察到擬核（nucleoid），而大多數(shù)細(xì)菌不含擬核，可能是無(wú)活性（inactive）的，稱為幽靈細(xì)菌（ghost）。幾乎與此同時(shí)，Heissenberger 等（1996） 用電鏡法觀察到浮游細(xì)菌僅約34%具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)受損（42%）或缺乏內(nèi)部結(jié)構(gòu)（24%），意味著這些細(xì)菌是無(wú)活性或者死亡的。目前學(xué)者可以通過(guò)檢驗(yàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性來(lái)判斷細(xì)菌的存活狀態(tài)，主要指標(biāo)有：1）是否具有擬核；2） 細(xì)胞膜是否完整；3）細(xì)胞膜是否具有極性和膜電位。

代謝活性是通過(guò)檢驗(yàn)細(xì)菌對(duì)某種物質(zhì)（底物）的吸收和轉(zhuǎn)化能力來(lái)進(jìn)行判斷，需要培養(yǎng)并檢測(cè)細(xì)菌體內(nèi)物質(zhì)的積累情況，所以對(duì)于底物的選擇主要考慮可吸收和可檢測(cè)兩個(gè)指標(biāo)。許多物質(zhì)由于分子量或極性等原因是不能被細(xì)菌所吸收的，因此并不是所有物質(zhì)都能作為底物。根據(jù)可檢測(cè)的要求，底物主要有兩類：1）放射性標(biāo)記底物，即使用有放射性標(biāo)記的有機(jī)底物培養(yǎng)細(xì)菌并過(guò)濾到濾膜上，將濾膜和底片疊加放到玻片上，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞周圍是否有放射線造成的陰影，這項(xiàng)技術(shù)被稱為顯微放射自顯影術(shù)，這種有放射性標(biāo)記的有機(jī)底物除了被吸收進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)以外，還可能部分吸附在細(xì)菌細(xì)胞外，也能出現(xiàn)所謂“放射線陰影”，造成假陽(yáng)性的誤差，因此在過(guò)濾后對(duì)濾膜的清洗很重要；2）可產(chǎn)生熒光物質(zhì)的酶底物，例如，加入呼吸作用電子傳遞鏈中某種酶的底物，具有呼吸作用的細(xì)菌胞內(nèi)會(huì)積累可以產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)胞內(nèi)有沒(méi)有熒光判定是否有呼吸作用。目前測(cè)定細(xì)菌的化學(xué)組成異質(zhì)性即細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的含量，經(jīng)常檢測(cè)的三個(gè)主要指標(biāo)包括：核酸含量、核糖體含量和細(xì)胞內(nèi)pH。

對(duì)于單個(gè)細(xì)菌，基本上進(jìn)行其中的一種或兩種測(cè)試后，細(xì)菌就會(huì)被測(cè)定過(guò)程殺死，無(wú)法進(jìn)行其他指標(biāo)的測(cè)定。因?yàn)椴荒艽_定一個(gè)細(xì)菌的所有指標(biāo)，所以很難確定各個(gè)指標(biāo)之間的聯(lián)系。代謝活性和存活狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，但不完全代表存活狀態(tài)，根據(jù)代謝活性僅能得出活躍的細(xì)菌肯定是活的，而不活躍細(xì)菌可能是死的，也可能是活的（可能由于活躍程度低于該種方法的檢測(cè)限的細(xì)胞） （Falcioni et al，2008）。因此，不能通過(guò)測(cè)定其中的一個(gè)指標(biāo)而推知其他指標(biāo)。

每個(gè)細(xì)菌在上述每個(gè)指標(biāo)都存在一個(gè)狀態(tài)，這些指標(biāo)給出的結(jié)果基本都是二分法，即陽(yáng)性或陰性，對(duì)于陽(yáng)性指標(biāo)，不能進(jìn)一步分出強(qiáng)弱的等級(jí)。例如，對(duì)于細(xì)胞膜不完整的結(jié)果，無(wú)法測(cè)定這個(gè)細(xì)菌的細(xì)胞膜損壞1/4 還是1/8。除了陽(yáng)性（或陰性）細(xì)菌的具體數(shù)目外，陽(yáng)性（或陰性）細(xì)菌所占的比例（一般以%表示） 也是重要的表達(dá)方式。浮游細(xì)菌群落根據(jù)這些指標(biāo)得出的陽(yáng)性和陰性數(shù)目的比值被統(tǒng)稱為這個(gè)細(xì)菌群落的生理狀態(tài)（Howard-Jones et al，2001；Del Giorgio et al，2008；Falcioni et al，2008；Hammes et al，2011） 或 代 謝 活 性（Martin et al，2008）。因?yàn)槊總€(gè)指標(biāo)都是細(xì)菌生理狀態(tài)的一個(gè)方面，所以學(xué)者們建議同時(shí)測(cè)定幾個(gè)不同的指標(biāo)來(lái)描述細(xì)菌群落的生理狀態(tài)（Smith et al，2003；Hammes et al，2011）。

以上細(xì)菌生理指標(biāo)的測(cè)定方法都有各自的問(wèn)題，因此它們?cè)诟∮渭?xì)菌中的應(yīng)用受到多方面的制約，有的方法技術(shù)復(fù)雜（如放射自顯影技術(shù)），有的依靠人眼觀察，人眼的敏感度和個(gè)體差異會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，所以這些方法在浮游細(xì)菌研究中的應(yīng)用普及程度不一樣。由于熒光染料與流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）的結(jié)合，流式細(xì)胞術(shù)方便快捷的單細(xì)胞分析優(yōu)勢(shì)使得三個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)在浮游細(xì)菌生理狀態(tài)研究中得到較為廣泛的應(yīng)用，包括細(xì)菌存活狀態(tài)異質(zhì)性的細(xì)胞膜完整性檢測(cè)、代謝活性異質(zhì)性的CTC （5-氰基-2，3-二（4-甲基苯基） 四唑氯化物，5-Cyano-2，3-di-（p-tolyl）tetrazolium chloride）活性檢測(cè)和細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)化學(xué)組成異質(zhì)性的核酸含量檢測(cè)（Gasol et al，2000；Joux et al，2000；Sherr et al，2001；Czechowska et al，2008）。早期的研究大多只測(cè)定其中一個(gè)或兩個(gè)指標(biāo)，隨著認(rèn)識(shí)的深入和技術(shù)裝備的更新，近年來(lái)越來(lái)越多的研究同時(shí)測(cè)定這三個(gè)指標(biāo)（Gasol et al，2009；Morán et al，2009；2011；Franco-Vidal et al，2011；Lefort et al，2014；Huete-Stauffer et al，2015；Baltar et al，2016；Luis et al，2019）。雖然國(guó)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，我國(guó)在這方面的研究卻非常少，本文綜述了采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞膜完整性、CTC 活性和核酸含量檢測(cè)三項(xiàng)細(xì)菌異質(zhì)性研究的成果，為我國(guó)的相關(guān)研究提供參考。

2 浮游細(xì)菌的細(xì)胞膜完整性檢測(cè)

細(xì)胞膜完整性檢測(cè)采用NADS （核酸雙染色，nucleic acid double-staining） 方 法（Grégori et al，2001），基于熒光染料對(duì)細(xì)胞膜的穿透性不同進(jìn)行檢測(cè)，原理是使用兩種熒光染料對(duì)細(xì)菌的核酸進(jìn)行染色，綠色熒光染料SYTO 9 或SYBRGreenI 可以透過(guò)完整和不完整的細(xì)胞膜，使細(xì)菌呈現(xiàn)綠色熒光；紅色熒光染料PI（碘化丙啶，propidium iodide）由于分子較大，僅能穿過(guò)不完整的細(xì)胞膜，而且PI 與核酸的結(jié)合能力強(qiáng)于SYTO 9 或SYBRGreenI，削弱細(xì)菌的綠色熒光，使具有不完整細(xì)胞膜的細(xì)菌呈紅色熒光。計(jì)數(shù)具有不同顏色熒光的細(xì)菌即可分別得到樣品中具完整細(xì)胞膜和不完整細(xì)胞膜的細(xì)菌數(shù)目，細(xì)胞膜完整的細(xì)菌不絕對(duì)是活的，但是細(xì)胞膜不完整的細(xì)菌肯定是死的或受傷的。這個(gè)方法由Boulos 等（1999）最先與落射熒光顯微鏡結(jié)合使用，隨后Barbesti 等（2000）結(jié)合雙染色與流式細(xì)胞術(shù)對(duì)純培養(yǎng)菌株進(jìn)行檢測(cè)，Grégori 等（2001）將流式細(xì)胞術(shù)用于自然海水和淡水細(xì)菌的研究中，并將這種方法命名為NADS。Falcioni 等（2008）證明了NADS 方法可以探測(cè)自然環(huán)境中細(xì)菌的死亡，并探索了NADS 方法用于浮游細(xì)菌的技術(shù)細(xì)節(jié)，Nescerecka 等（2016）對(duì)不同作者的技術(shù)細(xì)節(jié)的效果進(jìn)行了比較，并提出了完整的實(shí)驗(yàn)流程，標(biāo)志著這一技術(shù)已經(jīng)比較成熟，NADS 的結(jié)果常用活細(xì)胞百分比例來(lái)表示。

海洋中使用NADS 方法進(jìn)行的細(xì)菌存活狀態(tài)調(diào)查大多局限于幾個(gè)近岸淺海區(qū)，包括地中海西北部近岸海區(qū)（Grégori et al，2001；Alonso-Sáez et al，2006；Falcioni et al，2008；Lekunberri et al，2012；Ruiz-Gonzalez et al，2012；Lefort et al， 2014；Gomes et al，2015），大西洋比斯開(kāi)灣（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015）、美國(guó)馬薩諸塞州的Waquoit 灣河口（Morán et al，2011），南大洋的南極半島海域（Ortega-Retuerta et al，2008），北冰洋的卡拉海（Mosharova et al，2016；2017）。深海大洋海域的研究?jī)H有地中海（Lasternas et al，2010）和大西洋的加納利群島附近 （Gasol et al， 2009； Baltar et al， 2010；Lasternas et al，2014），其中Gasol 等（2009） 和Baltar 等（2010）進(jìn)行了深海采樣（＞1 000 m），其他研究?jī)H采集200 m 以淺水樣。此外，學(xué)者們還在比斯開(kāi)灣進(jìn)行了晝夜變化（Lefort et al，2014） 以及周年和季節(jié)變化研究（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015）。

根據(jù)這些調(diào)查，在表層海水中，活的細(xì)菌在總細(xì)菌豐度中占優(yōu)勢(shì)，其比例介于50%～90%之間，大洋和近岸海區(qū)沒(méi)有差異。活細(xì)菌的豐度比例隨水深增加而下降，Gasol 等（2009）發(fā)現(xiàn)大西洋加納利群島附近海域活細(xì)菌的豐度比例從200 m 的40%～70 %降低為1 000 m 的10 %～40 %，Baltar 等（2010）在同一海區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)活細(xì)菌的豐度比例從表層的70%～79%降低為2 000 m 的25%～60%。在地中海西部到東部的一個(gè)斷面，Lasternas 等（2010）發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍（5 ℃～25 ℃）內(nèi)，活細(xì)菌的豐度比例與溫度呈負(fù)相關(guān)，隨溫度升高而降低。對(duì)比斯開(kāi)灣的季節(jié)變化研究表明，夏季活細(xì)菌有較高的比例和生長(zhǎng)率（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015），而從晝夜變化上看活細(xì)菌豐度比例沒(méi)有明顯的變化（Lefort et al，2014）。

水文現(xiàn)象和生物過(guò)程對(duì)活細(xì)菌比例有一定影響，如：中尺度渦區(qū)域的活細(xì)菌比例高于渦的外部（Baltar et al，2010）；在北冰洋卡拉海的一個(gè)河口，活細(xì)菌比例隨鹽度（4.4～28.5） 增加而增加（Mosharova et al，2016）；在加納利群島海域的調(diào)查表明，當(dāng)浮游植物死亡時(shí)，浮游植物向細(xì)胞外釋放的有機(jī)物增加，活細(xì)菌比例從60%上升到95%（Lasternas et al，2014）。學(xué)者們通過(guò)圍隔實(shí)驗(yàn)研究影響活細(xì)菌比例的因素，添加營(yíng)養(yǎng)鹽誘發(fā)水華會(huì)導(dǎo)致活細(xì)菌比例增加（Lasternas et al，2014；Baltar et al，2016），其主要原因?yàn)榧?xì)菌的存活需要DOM（溶解有機(jī)物），而浮游植物發(fā)生水華時(shí)會(huì)向水體釋放大量DOM；此外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明光照對(duì)活細(xì)菌比例的影響有季節(jié)性，夏季活細(xì)菌比例會(huì)降低，其他季節(jié)則影響不大（Alonso-Sáez et al，2006；Ruiz-Gonzalez et al，2012）。

3 浮游細(xì)菌的CTC 活性檢測(cè)

細(xì)菌的呼吸需要FTS （電子傳遞系統(tǒng)），CTC是一種可以滲透細(xì)胞膜的熒光染料，在海水中加入CTC 后，有活躍FTS 的細(xì)菌會(huì)還原CTC，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成并積累具有紅色熒光的CTF（甲，CTCformazan）結(jié)晶（Rodriguez et al，1992；Schaule et al，1993），這些細(xì)菌被稱為CTC+（CTC 陽(yáng)性，即活躍呼吸）的細(xì)菌（Rodriguez et al，1992）。

20 世紀(jì)90 年代中期，Gasol 等（1995） 和Lovejoy 等（1996） 首先用表面熒光顯微鏡檢測(cè)CTC 活性，隨后Kaprelyants 等（1993）用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分辨實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)菌的CTC 活性，Del Giorgio 等（1997）和Sieracki 等（1999）則將這種方法應(yīng)用于自然湖水和海水中的浮游細(xì)菌研究。

CTC 活性檢測(cè)方法是將CTC 加入含細(xì)菌的自然海水中進(jìn)行培養(yǎng)，使得細(xì)菌吸收CTC 生成CTF，因此CTC 的濃度和培養(yǎng)時(shí)間是該方法的關(guān)鍵，不同的研究者使用了不同的培養(yǎng)濃度、時(shí)間。目前對(duì)于濃度已經(jīng)有了比較一致的看法，即加入海水中的CTC 的最佳終濃度為5 mmol/L，低于這個(gè)濃度得出的CTC+比例會(huì)偏低，例如Lovejoy 等（1996） 用的濃度為0.75 mmol/L，CTC+細(xì)菌的比例為1 %～2 %，這個(gè)比例被認(rèn)為過(guò)低。CTC 培養(yǎng)所需水樣體積很小，只用0.5～1.5 mL 室溫培養(yǎng)即可，紅色熒光在加入CTC 后立刻產(chǎn)生（Gasol et al，2007），10 min 后就可以進(jìn)行檢測(cè)，隨著這個(gè)結(jié)晶的體積增大，熒光強(qiáng)度也相應(yīng)增強(qiáng)，1 h 后，紅色結(jié)晶的數(shù)目不再增長(zhǎng)（Gasol et al，2007），50 min 的培養(yǎng)即可得出較準(zhǔn)確的CTC+細(xì)菌比例，此后，雖然CTC+細(xì)菌的數(shù)目不再增加，但是紅色熒光的強(qiáng)度還會(huì)一直增強(qiáng)，甚至能持續(xù)10 h（Gasol et al，2007）。

CTC+檢測(cè)方法也有一定的局限性，并非所有細(xì)菌都能夠利用CTC，雖然Sherr 等（1999）在海洋中分離的菌株都能降解CTC，但是其他生境，例如人體內(nèi)（Smith et al，1997）、厭氧環(huán)境（Bhupathiraju et al，1999）、地下水（Hatzinger et al，2003）、河流（Yamaguchi et al，1997）的證據(jù)表明有些細(xì)菌不降解CTC，所以海洋中也很可能存在不降解CTC 的細(xì)菌。CTC+細(xì)菌與其他細(xì)菌狀態(tài)的指標(biāo)也有對(duì)比實(shí)驗(yàn)，例如Karner 等（1997）發(fā)現(xiàn)CTC+細(xì)菌的數(shù)目低于顯微放射自顯影技術(shù)得出的活躍細(xì)菌數(shù)目。

CTF 晶體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)累積可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌破裂，使得CTF 釋放到水體中。Gasol 等（1995）在用表面熒光顯微鏡觀察時(shí)，注意到細(xì)菌細(xì)胞外也有CTF 顆粒，Gasol 等（2007）用SYTO13 對(duì)CTC 培養(yǎng)的細(xì)菌染色，用流式細(xì)胞術(shù)分別計(jì)數(shù)紅色和綠色（SYTO 13+）熒光顆粒，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌破裂后釋放到海水里的CTF 結(jié)晶用流式細(xì)胞儀仍能檢測(cè)到，會(huì)被認(rèn)為是一個(gè)細(xì)菌。

多項(xiàng)研究表明CTC 或CTF 對(duì)細(xì)菌具有毒性，例如：CTC 染色后細(xì)菌放射性標(biāo)記的生長(zhǎng)率和呼吸率分別降低了1%～14%和4%～44% （Ullrich et al，1996），用熒光細(xì)菌進(jìn)行的毒性測(cè)試表明濃度為0.1～5 μmol/L 的CTC 在15 min 后熒光減少50%～100 % （Ullrich et al，1996）；加入5 mmol/L 的CTC 培養(yǎng)30 min 后，細(xì)菌的豐度平均減少22 %（Gasol et al，2007）；加入CTC 后，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)停止（Grossart et al，2001）。Gasol 等（2007） 認(rèn)為CTC 作為外來(lái)物質(zhì)對(duì)細(xì)菌肯定產(chǎn)生影響，但其毒性可能很低，因?yàn)榧尤隒TC 數(shù)小時(shí)后，CTC+細(xì)菌的數(shù)目不再增加，但是單個(gè)細(xì)菌中的CTF 熒光強(qiáng)度還在增加，說(shuō)明仍有細(xì)菌降解CTC （Del Giorgio et al，1997），細(xì)菌并沒(méi)有被立即殺死。由于毒性要在細(xì)菌吸收和降解CTC 后才能發(fā)生，所以CTC的毒性對(duì)CTC+陽(yáng)性的檢測(cè)數(shù)據(jù)沒(méi)有影響，CTC+測(cè)試是有效的。

對(duì)于CTC+細(xì)菌對(duì)細(xì)菌代謝的貢獻(xiàn)有兩種截然不同的觀點(diǎn)：第一種觀點(diǎn)認(rèn)為CTC+細(xì)菌是細(xì)菌代謝的主要貢獻(xiàn)者，例如Smith （1998）發(fā)現(xiàn)雖然切薩皮克灣CTC+細(xì)菌比例平均只有14 %，但是CTC+細(xì)菌豐度和占總細(xì)菌數(shù)的比例都與細(xì)菌群落呼吸有很好的相關(guān)性；Sherr 等（1999）發(fā)現(xiàn)CTC+細(xì)菌是放射性標(biāo)記物的主要吸收者。第二種觀點(diǎn)認(rèn)為CTC+細(xì)菌的貢獻(xiàn)并不那么大，Servais 等（2001）用放射性底物培養(yǎng)來(lái)自法國(guó)地中海沿岸海水的細(xì)菌，然后進(jìn)行CTC 染色并用流式細(xì)胞儀分選出CTC+細(xì)菌，測(cè)定其放射性標(biāo)記的量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與總細(xì)菌的放射性標(biāo)記相比，CTC+細(xì)菌貢獻(xiàn)占總細(xì)菌生產(chǎn)的比例＜60 %；Longnecker 等（2005）使用同樣的方法得出在美國(guó)俄勒岡外海CTC+細(xì)菌貢獻(xiàn)了總細(xì)菌生產(chǎn)的7 %～14 %。然而，Gasol 等（2007） 研究認(rèn)為第二種觀點(diǎn)把釋放在水體中的CTF 顆粒也作為細(xì)菌進(jìn)行了分選，導(dǎo)致CTC+細(xì)菌的放射性結(jié)果偏低。

CTC+細(xì)菌比例的測(cè)定最初于1995 年應(yīng)用于浮游細(xì)菌研究中（Gasol et al，1995），目前有CTC+調(diào)查資料的海區(qū)包括地中海的布拉內(nèi)斯灣（Blanes Bay） （Gasol et al，1995；Baltar et al，2016）、比斯 開(kāi) 灣（Morán et al，2009；Franco-Vidal et al，2011；Huete-Stauffer et al，2015）、亞得里亞海（Paoli et al，2006）、法國(guó)近岸海域（Bernard et al，2000），大西洋的切薩皮克灣（Smith，1998）、北卡羅來(lái)納州外海陸架區(qū)（Sherr et al，2002）、馬薩諸塞州的Waquoit 灣河口（Morán et al，2011）、加拿大的圣勞倫斯灣（Lovejoy et al，1996；2000）、新斯科舍（Nova Scotia）近海（Lovejoy et al，2000）、波羅的海（Schumann et al，2003）、葡萄牙的阿威羅（Ria de Aveiro） 海灣（Almeida et al，2001）、加納利群島附近海域（Gasol et al，2009）、塞內(nèi)加爾近岸海域（Gasol et al，2009），太平洋的俄勒岡州 外 海（Choi et al，1996；Sherr et al，1999；Longnecker et al，2005）、加利福尼亞州圣莫尼卡灣（Santa Monica Bay） （Karner et al，1997），其他海區(qū)還包括澳大利亞塔斯馬尼亞外海（Davidson et al，2004）、北冰洋的卡拉海（Mosharova et al，2016；2017）和南大洋海冰（Martin et al，2008）等。

以上現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查表明CTC+細(xì)菌比例一般低于10 %，內(nèi)陸架海區(qū)比外陸架海區(qū)高（Sherr et al，2002），極地CTC+細(xì)菌比例較高，平均為32%～38 %（Martin et al，2008；Mosharova et al，2017）。在北冰洋卡拉海河口，CTC+細(xì)菌比例隨鹽度（4.4～28.5） 增加而增加（Mosharova et al，2016），但在西非塞內(nèi)加爾的河口，CTC+細(xì)菌比例在一定范圍內(nèi)隨鹽度升高（0～20）而降低，當(dāng)鹽度繼續(xù)升高時(shí)，CTC+細(xì)菌比例增加（Bettarel et al，2011）。CTC+細(xì)菌比例垂直分布基本為表層高、深層低，在加納利群島附近海域表層CTC+細(xì)菌比例為5%～10%，底層1 000 m 比例＜5%（Gasol et al，2009），在比斯開(kāi)灣夏季表層CTC+細(xì)菌比例高，冬季上下混合均勻（Franco-Vidal et al，2011），在北卡羅來(lái)納州外海陸架區(qū)（Sherr et al，2002）和俄勒岡州外海（Longnecker et al，2005），200 m 以淺水柱內(nèi)CTC+細(xì)菌比例的垂直分布沒(méi)有明顯規(guī)律。對(duì)于CTC+細(xì)菌比例的季節(jié)和周年變化的研究很少，在比斯開(kāi)灣CTC+細(xì)菌占總細(xì)菌比例周年平均為3.6%，最高值出現(xiàn)在4 月，達(dá)12 %（Morán et al，2009），而在比斯開(kāi)灣另一個(gè)海區(qū)，最高值（12%） 出現(xiàn)在夏季（Franco-Vidal et al，2011）。

CTC+細(xì)菌比例可能受其攝食者鞭毛蟲(chóng)豐度的影響，CTC+細(xì)菌比例與異養(yǎng)鞭毛蟲(chóng)在鞭毛蟲(chóng)總豐度的比例相關(guān)，異養(yǎng)鞭毛蟲(chóng)在鞭毛蟲(chóng)總豐度中的比例高時(shí)，CTC+細(xì)菌比例降低，說(shuō)明異養(yǎng)鞭毛蟲(chóng)選擇攝食活躍的細(xì)菌（Lovejoy et al，1996；2000），Del Giorgio 等（1996）的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也支持這一觀點(diǎn)。

4 浮游細(xì)菌的核酸含量檢測(cè)

根據(jù)核酸染色后的熒光強(qiáng)度可估算浮游細(xì)菌的核酸含量。早期研究中，熒光的強(qiáng)弱在高分辨率熒光顯微鏡下即可分辨（Sieracki et al，1992），Li 等（1995）最先使用流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)根據(jù)散射信號(hào)（SSC，side scatter，與細(xì)胞的密度相關(guān)）和綠色熒光的相對(duì)強(qiáng)度（與細(xì)胞的核酸含量有關(guān)），將浮游細(xì)菌在流式圖上分為核酸含量不同的群，這種分群現(xiàn)象在淡水和海水、寡營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)水體都有，因此是浮游細(xì)菌群落的普遍特征（Bouvier et al，2007）。

對(duì)這些不同核酸含量的細(xì)菌分群的用詞不同，Li 等（1995）稱它們?yōu)榻M（group），Gasol 等（1999）稱它們?yōu)閬喨海╯ubpopulations），此外也有研究稱它們?yōu)閬喗M（subgroup） （Gasol et al，2000）。在自然海水樣品中，浮游細(xì)菌經(jīng)核酸染色大多被分為兩群，通常稱為HNA（高核酸含量群，high nucleic acid）和LNA（低核酸含量群，low nucleic acid） （Lebaron et al，2001），有的研究在HNA 和LNA 之外還有VHNA（極高核酸含量群，very high nucleic acid） （Nishimura et al，2005；Girault et al，2015；Dhib et al，2017）。

用流式細(xì)胞儀分選HNA 和LNA 細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)測(cè)序，不同的學(xué)者得出了相互沖突的結(jié)論：有的認(rèn)為HNA 和LNA 在系統(tǒng)發(fā)生上類群組成沒(méi)有區(qū)別（Bernard et al，2000；Servais et al，2003；Longnecker et al，2005），而有的研究認(rèn)為HNA 和LNA 在系統(tǒng)發(fā)生上的類群組成是不同的或有的分類類群在一個(gè)核酸類群中占主導(dǎo)，例如LNA 主要與SAR11 類群和SAR86 類群有關(guān)，HNA 則主要與γ-變形菌、紅細(xì)菌目、SAR116 類群和擬桿菌門(mén)有關(guān)（Filers et al，2000；Fuchs et al，2000；Zubkov et al，2001；2002；Fuchs et al，2005；Mary et al，2006；Schattenhofer et al，2011；Vila-Costa et al，2012）。

有浮游細(xì)菌分群研究資料的海區(qū)包括地中海西北部近岸（Gasol et al，1999；Joux et al，2005；Gomes et al，2015）、直布羅陀到塞浦路斯的斷面（Van Wambeke et al，2011）、亞得里亞海（antiet al，2014）、突尼斯海岸潟湖（Dhib et al，2017）、大西洋的加拿大近岸海區(qū)（Jellett et al，1996）、美國(guó)的馬里蘭近岸（Bouvier et al，2007）、拉布拉多海（Li et al，1995）、墨西哥灣（Jochem，2001；Jochem et al，2004）、西班牙比斯開(kāi)灣（Calvo-Díaz et al， 2006； Morán et al， 2009； García et al，2014）、加納利群島附近海域（Gasol et al，2009）、波羅的海河口區(qū)（Kaartokallio et al，2016）、太平洋的俄勒岡外海（Bouvier et al，2007）、北加州外海（Sherr et al，2006）、在北太平洋12 °N-34 °N經(jīng)向斷面（Girault et al，2015）、臺(tái)灣淺灘（Jiang et al，2017）、南大洋德雷克海峽（Corzo et al，2005）、普利茲灣（Ortega-Retuerta et al，2008）、澳大利亞南部阿德萊德近岸站位（Schapira et al，2009）、澳大利亞南部大陸架上升流區(qū)（Paterson et al，2012）、北極海區(qū)加拿大富蘭克林灣（Belzile et al，2008）等海區(qū)。

自然海區(qū)浮游細(xì)菌中，HNA 的DNA 含量大大高于LNA，約為后者的4～6 倍（Li et al，1995；Jellett et al，1996；Sherr et al，2006；Bouvier et al，2007），HNA 和LNA 兩群熒光的平均值成正比，即當(dāng)LNA 的熒光值增加時(shí)，HNA 的熒光值也增加（Bouvier et al，2007）。自然海區(qū)中HNA% （HNA豐度占總細(xì)菌豐度的百分比）大多介于30%～90%之間，表層的比例隨營(yíng)養(yǎng)程度的升高而升高，例如濱海濕地高于海洋（Bouvier et al，2007），近岸區(qū)高于陸坡和大洋區(qū)（Sherr et al，2006），澳大利亞南部大陸架上升流區(qū)HNA% （84 %～93 %）高于其他區(qū)域（36 %～43 %） （Paterson et al，2012），在南海臺(tái)灣淺灘赤潮區(qū)域HNA%介于63%～78%，高于非赤潮區(qū)域（38%～57%） （Jiang et al，2017）。Li 等（1995）發(fā)現(xiàn)不同的海洋生境中HNA%與葉綠素a 濃度成正相關(guān)，說(shuō)明HNA%隨著有機(jī)物供給的增多而上升。HNA%與葉綠素a 有關(guān)，因此海水的生產(chǎn)力也可能與此有關(guān)，但是葉綠素a 濃度很高和很低的海區(qū)也會(huì)出現(xiàn)相近的HNA%，說(shuō)明除生產(chǎn)力之外還有其他影響因素（Bouvier et al，2007）。

在近岸海區(qū)（200 m 以淺） 的垂直分布調(diào)查中，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)程度高的表層HNA%低于營(yíng)養(yǎng)程度低的底層（Jochem，2001；Calvo-Díaz et al，2006；Belzile et al，2008），這與Li 等（1995）的觀點(diǎn)不同（Jochem et al，2004），原因尚不清楚。在大洋中，HNA%在水深200 m 以淺的垂直分布中稍有增加但沒(méi)有明顯規(guī)律（Gasol et al，2009；Van Wambeke et al，2011；Girault et al，2015），在地中海自200 m 以深HNA %隨深度增加而升高，從0～250 m 的30 %～50%升高至3 300 m 的50 %～70 %（Van Wambeke et al，2011），在加納利群島附近，從0～1 000 m 沒(méi)有變化（Gasol et al，2009）。在紅海中部，在200 m 以淺是LNA 占主導(dǎo)，在200 m 以深是HNA 占主導(dǎo)（Calleja et al，2018）。在東北大西洋深水中，從70°N-30°N，HNA%降低，再到10°S，HNA%稍微升高（Reinthaler et al，2013）。近岸海區(qū)HNA%隨鹽度變化的研究較少，在法國(guó)地中海沿岸羅納河口，鹽度變化范圍在15～36 之間，HNA%在40%～80%之間，隨鹽度變化在不同的調(diào)查沒(méi)有明顯的規(guī)律（Joux et al，2005）。

表層HNA%的季節(jié)變化一般為春季和冬季比例大，夏季比例小，如西班牙比斯開(kāi)灣（Calvo-Díaz et al，2006） 和 亞 得 里 亞 海（?antiet al，2014），在北極貝福特陸架的富蘭克林灣HNA%春季比冬季更高（Belzile et al，2008），而深水HNA%沒(méi)有明顯的季節(jié)變化（Belzile et al，2008；Calvo-Díaz et al，2006）。對(duì)影響HNA%的因素目前所知甚少，實(shí)驗(yàn)操作中升溫培養(yǎng)可以使細(xì)菌核酸含量降低（Huete-Stauffer et al，2015），此外不同浮游植物釋放的DOC 會(huì)影響HNA%（Tada et al，2016），HNA 對(duì)浮游植物水華的反應(yīng)比LNA 明顯（Gomes et al，2015）。

流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)可根據(jù)核酸含量把水體細(xì)菌分為兩群后，這兩群細(xì)菌在活性上的差異立即引起關(guān)注，Li 等（1995）發(fā)現(xiàn)HNA 的分布和DNA 含量與水體葉綠素a 濃度具有相關(guān)性，所以推測(cè)HNA是活躍細(xì)菌，而LNA 是不活躍細(xì)菌。Jellett 等（1996） 提出了ACI（活躍細(xì)胞指數(shù)，active cell index） 概念，即HNA 占總細(xì)菌豐度的比例，與HNA%概念相同，他們發(fā)現(xiàn)ACI 與細(xì)菌生產(chǎn)力的變化趨勢(shì)一致，認(rèn)為ACI 可以表征細(xì)菌群落的活躍程度。

但是HNA 和LNA 是否活性不同仍需要直接的證據(jù)。第一項(xiàng)證據(jù)來(lái)自生長(zhǎng)率培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，Gasol 等（1999）發(fā)現(xiàn)稀釋培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中HNA 有較高的生長(zhǎng)率，而LNA 生長(zhǎng)率較低，所以認(rèn)為HNA 是活躍細(xì)菌，LNA 是不活躍或死細(xì)菌，Vaqué 等（2001）同樣支持這個(gè)觀點(diǎn)，但是也有培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LNA 有較高的生長(zhǎng)率，并非是不活躍的細(xì)菌（Jochem et al，2004；Zubkov et al，2004；Sherr et al，2006）。另外的直接證據(jù)來(lái)自兩類細(xì)菌對(duì)放射性標(biāo)記底物的吸收能力的比較，有研究發(fā)現(xiàn)HNA 能夠活躍吸收底物（Lebaronetal，2001；2002；Servaisetal，2003），所以是HNA 是活躍細(xì)菌；但是也有一些研究發(fā)現(xiàn)LNA 的活性和HNA 相當(dāng)，在單位細(xì)菌體積比較時(shí)甚至超過(guò)HNA（Zubkov et al，2001；Longnecker et al，2005；Mary et al，2006；Scharek et al，2007；Wang et al，2009；Longnecker et al，2010；Talarmin et al，2011；Huete-Stauffer et al，2012），HNA 類群中的細(xì)菌的活性也不盡相同（Moran et al，2007）。由于生長(zhǎng)率和對(duì)底物的吸收能力的實(shí)驗(yàn)都得出了矛盾的結(jié)果，目前普遍認(rèn)為L(zhǎng)NA 和HNA 的劃分不能作為細(xì)菌是否活躍的指示，HNA比LNA 活躍一些，但是LNA 中也有一些細(xì)菌是活躍的，能吸收有機(jī)底物并表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)。

5 浮游細(xì)菌異質(zhì)性研究指標(biāo)間的關(guān)系

目前已有相當(dāng)多的研究分別使用不同的指標(biāo)報(bào)道了浮游細(xì)菌的異質(zhì)性，主要包括NADS 法研究細(xì)菌存活狀態(tài)異質(zhì)性、CTC 法研究細(xì)菌的代謝狀態(tài)異質(zhì)性，以及HNA/LNA 法研究細(xì)菌的化學(xué)組成異質(zhì)性，但對(duì)不同指標(biāo)之間的關(guān)系研究相對(duì)較少。采用NADS 法檢測(cè)時(shí)觀測(cè)到活細(xì)菌比例通常大于HNA 比例，這意味著LNA 不全是死細(xì)菌，例如在南極半島海區(qū)，61%的細(xì)菌是活的，這其中約45%的細(xì)菌屬于HNA，也就是說(shuō)有16%的活細(xì)菌屬于LNA（Ortega-Retuerta et al，2008）?？臻g分布方面，在加納利群島附近海域三者的垂直分布變化趨勢(shì)并不一致（Gasol et al，2009）。在同一海區(qū)的周年變化中，這些指標(biāo)的變化也不同步，例如在地中海西北部海區(qū)，HNA %在3 月最高，但是活細(xì)菌比例在9 月最高（Gomes et al，2015）；在比斯開(kāi)灣，HNA %和CTC+細(xì)菌比例周年變化較為一致，但是活細(xì)菌比例則與這兩項(xiàng)指標(biāo)不一致（Morán et al，2009）；在地中海西北部，CTC+細(xì)菌比例與HNA %的日變化趨勢(shì)一致（Lefort et al，2014）；在圍隔實(shí)驗(yàn)中，NADS 和HNA%的變化趨勢(shì)相似，而CTC+細(xì)菌比例變化與前兩者不一致（Baltar et al，2016）。

6 小結(jié)與展望

浮游細(xì)菌能夠有效吸收和轉(zhuǎn)化海洋生態(tài)系統(tǒng)中的DOM，快速響應(yīng)物理化學(xué)梯度等環(huán)境因素的變化，對(duì)其生理狀態(tài)研究的重要性顯而易見(jiàn)。我國(guó)在相關(guān)方面的研究較為缺乏，主要包括好氧不產(chǎn)氧光合異養(yǎng)細(xì)菌的膜電位研究（Jiao et al，2004）、臺(tái)灣淺灘和珠江口的HNA %研究（Xu et al. 2013；Jiang et al，2017；李祥付 等2018）等，在淡水中也有浮游細(xì)菌生理狀態(tài)的報(bào)道（Liu et al，2016）。

目前的研究集中在近岸海域，大洋深海和極區(qū)的資料較少，長(zhǎng)期變化、全球變暖、酸化等其他影響因素影響下浮游細(xì)菌生理狀態(tài)的變化研究亟須加強(qiáng)：

（1）目前對(duì)浮游細(xì)菌生理狀態(tài)的調(diào)查主要集中在近岸海域，在大洋和深海的資料很少，2 000 m水深以下幾乎沒(méi)有資料，在如此廣闊的水域中浮游細(xì)菌生理狀態(tài)如何，從近岸海區(qū)至大洋是如何過(guò)渡的，在深海全水深調(diào)查中細(xì)菌的生理代謝活性是如何垂直變化的，這些問(wèn)題亟須得到解釋。

（2） 光強(qiáng)也可能對(duì)細(xì)菌的生理狀態(tài)有影響，目前僅在中緯度（41°N）的地中海Blanes 海灣進(jìn)行過(guò)研究（Alonso-Sáez et al，2006；Ruiz-Gonzalez et al，2012；Lefort et al，2014）。低緯度海區(qū)的光強(qiáng)是否會(huì)降低細(xì)菌的生理狀態(tài)，夏季能影響到多深，影響的時(shí)間有多長(zhǎng)，是否存在晝夜變化，也需要繼續(xù)研究。

（3）浮游細(xì)菌生理狀態(tài)周年變化僅在比斯開(kāi)灣（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015）、亞德里亞海（?antiet al，2014）和北極的貝福特陸架的富蘭克林灣（Belzile et al，2008）有研究報(bào)道，數(shù)據(jù)還十分缺乏，難以總結(jié)其變化規(guī)律，應(yīng)選擇代表性海域進(jìn)行深入的周年變化調(diào)查。

（4）海洋酸化和全球變暖已嚴(yán)重威脅到海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及生物多樣性。在這一背景下，可以通過(guò)調(diào)節(jié)升溫梯度和pH，研究全球變暖和酸化對(duì)浮游細(xì)菌生理狀態(tài)的影響。