CDKN2B-AS1基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的相關性研究

郝 娜， 賈亞靜， 田蕓婕， 路曉琳

(1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院婦科， 河北 邯 鄲 056001 2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦科， 河北 石家莊 050010)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)常發(fā)于育齡婦女，發(fā)病率為10%-15%，其在不孕者中發(fā)病率高達25%～40%，且呈逐年上升趨勢，嚴重影響女性生活質(zhì)量及生育功能[1]。但其發(fā)病機制尚不清楚，相關研究認為，EM是一種雌激素依賴性疾病，且其易感性有一定遺傳性和家族聚集傾向[2]?；騿魏塑账岫鄳B(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)是常用遺傳學標記，臨床可用于分析復雜基因遺傳特性[3]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B-反義RNA基因(cyclin-dependent kinase inhibitor 2B antisense RNA1，CDKN2B-AS1)位于9p21.3染色體，研究證實其rs4977574位點與冠心病、動脈粥樣硬化性疾病等有關，其rs10965235位點與EM可能有關，但目前關于CDKN2B-AS1多態(tài)性與EM關系報道尚少[4]。因此，本研究擬探究CDKN2B-AS1 rs4977574位點、rs10965235位點與中國北方女性EM易感性的關系，以期為EM發(fā)病遺傳機制深入研究提供一定參考依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2017年12月至2019年7月邯鄲市中心醫(yī)院和河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜異位(EM)患者112例為病例組，年齡22～45歲，平均年齡(33.16±6.13)歲，月經(jīng)周期28～32d，平均(30.19±1.36)d，平均身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)為(24.69±1.97)Kg/m2。根據(jù)美國生殖醫(yī)學協(xié)會制定的(r-AFS)分期標準[5]，EM患者Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期73例。另取同期因?qū)m外孕、輸卵管黏連等手術患者112例為對照組，年齡22～45歲，平均年齡(33.74±5.91)歲，月經(jīng)周期28～32d，平均(29.94±1.23)d，平均BMI為(24.32±1.68)Kg/m2，兩組受試者年齡、BMI、月經(jīng)周期比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會批準通過，收集受試者所有臨床資料，所有樣品采集及資料調(diào)查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2納入與排除標準:納入標準：①均符合EM相關診斷標準；②患者均無親緣關系；③均為22～45歲間適育齡女性。排除標準：①術前3個月有激素或其他藥物治療史；②有子宮、卵巢手術史或遺傳病史者；③合并嚴重心、肝、肺或其他重要臟器功能障礙者；④合并惡性腫瘤者；⑤合并先天性子宮畸形或放置宮內(nèi)節(jié)育器者。

1.3方 法

1.3.1標本采集:采集所有受試者清晨空腹靜脈血5mL，于-80℃冰箱保存待檢。

1.3.2PCR擴增及應基因型檢測:采用DNA提取試劑盒(貨號：158422，英國QIAGEN)提取受試者血液DNA，CDKN2B-AS1 rs4977574上游引物序列(5′→3′)：GGG TTA TGG GAA ATG CCA TG，下游引物序列(5′→3′)：TTG CTG AAG GGA CTC AAT GAG AG；CDKN2B-AS1 rs10965235上游引物序列(5′→3′)：CGT ACG CGG TTC TCT GAC CCG GTC CCT CGG C，下游引物序列(5′→3′)：CAT CCA GCG AGC AGT GCA GCC AGC ATT CCT GG；引物由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反應體系(25 L)：混池DNA 1.0 L，2×Primer STAR GC Buffer 12.5 L，dNTP 2.0 L，Primer STAR HS DNA Polymerase 0.25 L，ddH2O 9.25 L。反應條件：95℃ 5 min；98℃ 15s；64℃ 1 min；72℃，30s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化回收(DNA純化回收試劑盒貨號：DP214-3，北京天根生化科技有限公司)后送上海生工生物科技有限公司測序。采用Chroms 1.62 軟件讀取測序峰圖。

2 結(jié) 果

2.1兩組受試者一般資料比較:與對照組相比，病例組年齡稍小、BMI稍高、月經(jīng)周期稍長，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 兩組受試者一般資料比較

2.2兩組受試者CDKN2B-AS1等位基因及基因型頻率比較:對照組與病例組患者CDKN2B-AS1基因rs4977574、rs10965235位點基因型和等位基因頻率分布均符合哈代-溫伯格遺傳平衡定律，具有群體代表性。病例組與對照組CDKN2B-AS1 基因rs4977574位點等位基因A與G、AA與AG+GG基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，病例組CDKN2B-AS1基因rs10965235位點等位基因C、CC基因型頻率高，等位基因A、CA+AA基因型頻率低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者CDKN2B-AS1等位基因及基因型頻率比較n(%)

組別例數(shù)CACDKN2B-AS1 rs10965235CC CA+ AA對照組112168(75.00)56(25.00)61(54.46)51(45.54)病例組112187(83.48)37(16.52)77(68.75)35(31.25)χ24.3974.075P0.0360.044

表3 CDKN2B-AS1基因rs10965235位點多態(tài)性與EM臨床分期的關系n(%)

2.3CDKN2B-AS1基因rs10965235位點多態(tài)性與EM臨床分期的關系:與Ⅰ～Ⅱ期比較，Ⅲ～Ⅳ期EM患者CDKN2B-AS1基因rs10965235位點CC基因型頻率高、CA+AA基因型頻率低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4Logistic回歸分析CDKN2B-AS1基因多態(tài)性與EM易感性的關系:CDKN2B-AS1基因rs4977574位點與AA基因型比較，AG+GG基因型與EM易感性無關(OR=1.105，95%CI：0.819-1.491；P=0.124)；CDKN2B-AS1基因rs10965235位點，與CC基因型比較，CA+AA基因型可降低EM易感性(OR=0.564，95%CI：0.347-0.917，P=0.000)，見表4。

表4 Logistic回歸分析CDKN2B-AS1基因多態(tài)性對EM易感性的關系

3 討 論

EM是指具有生物活性的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外其他部位，且存在增生、轉(zhuǎn)移及高復發(fā)等惡性腫瘤性行為，臨床主要表現(xiàn)為繼發(fā)性痛經(jīng)、慢性盆腔痛和不孕等，不僅影響患者生活治療及生育功能，還給患者家庭及社會帶來嚴重經(jīng)濟負擔[6]。目前臨床EM確診率很低，CA125、CA19-9、TNF-α等指標可協(xié)助EM診斷，但特異性不強，預測EM疾病發(fā)生能力差，往往導致病情延誤；另病理檢測因其有創(chuàng)性導致患者接受度不一，臨床應用受限。近來研究報道，全基因組關聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)可篩查出有效疾病形狀關聯(lián)的SNP，可檢測低頻突變信息，且靈敏度和特性度高[7]。本研究以及因多態(tài)性為切入點研究CDKN2B-AS1基因多態(tài)性與EM的相關性可能為臨床EM發(fā)病機制研究及診療提供一定參考。

多項研究證實EM受遺傳因素影響。賴曾珍等[1]研究報道，Toll樣受體4(TLR4)受體基因多態(tài)性與EM有關，且純合子Asp299Gly基因型和Thr/Ile基因型可增加EM易感性，其檢出率在EM Ⅲ～Ⅳ期中顯著增加。Wang等[8]研究報道，白細胞介素-10(IL-10)基因多態(tài)性與EM易感性有關，IL-10 -819T/C位點和-592A/C位點等位基因或基因型頻率高，且與EM患者臨床分期有關。近來隨著基因多態(tài)性的深入研究，基因多態(tài)性與EM易感性的關系備受關注。CDKN2B基因產(chǎn)物是一種腫瘤抑制因子，可調(diào)控細胞周期、延緩細胞增殖，CDKN2B-AS1基因為其反義RNA，基因全長126.3Kb，其表達水平升高亦與細胞增殖、黏附增加等有關[9]。喬林等[4]研究報道，CDKN2B-AS1基因rs4977574位點SNP與女性早發(fā)冠心病及高血紅蛋白有關，其中GG、GA基因型攜帶者早發(fā)冠心病發(fā)生率顯著增加。Kunnas等[10]研究報道，CDKN2B-AS1基因rs4977574位點GG基因型與冠心病風險增加有關，而可降低高血壓易感性。Lee等[11]研究報道，CDKN2B-AS1基因rs10965235位點SNP與韓國女性EM易感性有關，其中攜帶CA、AA基因型EM易感性低，CC基因型攜帶者EM易感性高且EM臨床分期亦高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，EM患者rs4977574位點等位基因A、G、GG、AG+AA基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義，且與EM易感性無關，可能因選擇病例存在地域差異或疾病異質(zhì)性，CDKN2B-AS1基因rs4977574與EM易感性無相關。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，病例組CDKN2B-AS1基因rs10965235位點等位基因C、CC基因型頻率高，等位基因A、CA+AA基因型頻率低，且與EM臨床高分期及EM易感性有關，提示CDKN2B-AS1基因rs10965235位點SNP可能與EM易感性及疾病進展有關，CC基因型可增加EM易感性并與疾病分期高有關，A等位基因可能為保護基因，攜帶A等位基因可能降低EM易感率，但有文獻報道，這種相關性也可能因rs10965235位點SNP與周圍基因存在連鎖不平衡而檢測不到，而本研究并未關注rs10965235是否可能出現(xiàn)連鎖不平衡、連鎖互換等反應，因此后期仍需加大樣本量進一步深入探究。

綜上所述，CDKN2B-AS1基因rs4977574位點與EM易感性無關，rs10965235位點基因多態(tài)性與中國北方女性EM易感性及臨床分期有關，CC基因型可增加EM易感性，攜帶A等位基因可能降低EM易感性。但由于本研究樣本量少，選擇樣本范圍小，另因地理差異導致結(jié)果存在局限性，后期應加大樣本量、增加選擇范圍進一步深入探究。