丹皮酚通過上調(diào)SIRT1減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷

劉 超， 王明娟， 范彥芳， 單偉超

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學院， 河北 承德 067000)

盡管人們不斷地研究心梗發(fā)生發(fā)展的分子機制，并不斷開發(fā)新的治療方案來限制心肌受損面積和促進心梗后心臟功能的恢復及心室重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)，心肌梗死仍然是造成人類死亡的首要原因[1]。為了挽救即將發(fā)生梗死的缺血心肌，再灌注治療是相當有效的方法。然而，再灌注治療也有可能進一步導致更多心臟損傷，包括細胞凋亡、炎性細胞浸潤、毛細血管破裂等，甚至有可能進一步擴大心肌梗死的面積[2]。因此，探究減輕和防止心肌缺血再灌注損傷的方法即分子途徑對于進一步改善心梗預(yù)后具有重要意義。丹皮酚(paeonol)是牡丹根皮的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可以通過阻礙MAPK/ERK/p38通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[3]。此外，丹皮酚具有顯著的心血管保護作用。在一項通過Sprague Dawley (SD)大鼠心建立心肌缺血再灌注模型的研究中，丹皮酚被發(fā)現(xiàn)提高了大鼠缺血再灌注后心排出量和左室內(nèi)壓上升段或下降段的最大變化速率，改善了心臟功能[4]。然而，丹皮酚在心肌缺血再灌注過程中發(fā)揮作用的機制尚未探明。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1, SIRT1)是編碼基因定位于染色體10q21.3的蛋白質(zhì)。本研究通過結(jié)扎冠狀動脈后恢復血流灌注在SD大鼠中建立心肌缺血再灌注損傷模型，以此觀察丹皮酚對心肌缺血再灌注損傷的影響并探究其作用機制。

1 資料與方法

1.1動物模型:40只雄性SD大鼠均購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，根據(jù)文獻已報道的方法建立心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)損傷模型[5]。簡言之，所有大鼠吸入2%異氟醚麻醉，于37℃恒溫板上進行操作。于無菌環(huán)境下開胸暴露心臟，用7-0縫合線結(jié)扎左心房遠緣3mm處左冠狀動脈40min以造成心肌缺血，以左室前壁心肌顏色變深，并迅速發(fā)展為運動減退和擴張代表心肌缺血建立成功。缺血40min后松開結(jié)扎線120min以恢復心肌血流灌注，以心電圖顯示抬高的ST段下移一半以上提示再灌注成功。再灌注120min后，獲取大鼠心臟組織和血液樣本。所有大鼠隨機分為四組，每組十只：①假手術(shù)(sham)組：不結(jié)扎冠狀動脈，其余操作與I/R組相同；②I/R組：按照前文的方法建立大鼠體內(nèi)I/R損傷；③丹皮酚組：于建立I/R損傷前24h使用丹皮酚(12mg/kg)灌胃處理；④SIRT1敲低組：于建立I/R損傷前使用丹皮酚灌胃并通過尾靜脈注射SIRT1-siRNA(2.5mg/kg)。本研究實驗方案已獲得本院動物實驗倫理委員會批準。

1.2Western blot:取大鼠心肌組織樣本，離心后去上清。加入蛋白裂解液(Beyotime Biotcchnology，Shanghai, China)以分離總蛋白。取50g總蛋白加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠中，100V電泳2h。然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(Millipore, Bedford, MA, USA)。用5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，TBST洗膜3次，每次10min，與一抗(Anti-Sirt1抗體，兔抗人多克隆抗體，1∶1000，ab12193, Abcam, Shanghai, China)在4℃下孵育過夜。在TBST洗膜后，在室溫下將膜用辣根過氧化物酶(HRP)標記抗二抗(山羊抗兔IgG，1∶2000，ab205718, Abcam, Shanghai, China)孵育1h。TBST洗膜3次，每次10 min。最后用Western blot專用試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)顯色成像，采用Image J分析各蛋白灰度值。

1.3活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測:用2,7'-二氯熒光素(DCFDA)試劑盒(Jianchen, Nanjing, China)檢測大鼠心肌組織內(nèi)ROS表達。

1.4氧化應(yīng)激標志物測定:應(yīng)用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA )和試劑盒(Jianchen, Nanjing, China)分別測定SOD和MDA的含量，嚴格按試劑盒要求操作。

1.5心肌損傷標志物檢測:收集大鼠血液樣本，使用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)和肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)檢測試劑盒(Jianchen, Nanjing, China)測定大鼠血漿中LDH和CK表達水平。

1.6超聲心動檢測:經(jīng)胸超聲心動圖采用高分辨率超聲心動系統(tǒng)(Visual Sonics, Toronto, Canada)，檢測左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室縮短分數(shù)(FS)、左室射血分數(shù)(EF)。

2 結(jié) 果

2.1丹皮酚影響了SIRT1的表達:通過western blot，首先檢測了大鼠心臟組織中SIRT1的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)I/R損傷導致了SIRT1表達的顯著下調(diào)，丹皮酚則顯著增強了SIRT1的表達，SIRT1敲低組中SIRT1表達水平確實顯著降低了(圖1)。

圖1 丹皮酚對SIRT1表達的影響

通過western blot檢測各組大鼠心臟組織中SIRT1的表達水平。**、***分別代表P<0.01、P<0.001

2.2 丹皮酚減輕了大鼠心肌氧化應(yīng)激和心肌損傷:我們初步探究了丹皮酚對受到缺血再灌注損傷的SD大鼠心臟的作用。DCFDA試劑盒的檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠心肌組織中ROS水平明顯增8.8mm。80.4mm(+69.2mm,96.2mm)〗高，丹皮酚則下調(diào)了ROS的含量(圖1A)。通過ELISA，我們進一步檢測了大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激標志物和心肌損傷標志物含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在I/R處理后，MDA表達水平顯著增高，SOD則顯著減少，丹皮酚的預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了I/R的作用(圖1B,C)。此外，心肌損傷標志物LDH和CK也因I/R處理而顯著增多，并同樣可以被丹皮酚預(yù)處理逆轉(zhuǎn)(圖1D,E)。此外，與丹皮酚組相比，SIRT1組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)更強、心臟受損更嚴重(圖1A-E)。我們的發(fā)現(xiàn)提示丹皮酚顯著抑制了缺血再灌注后發(fā)生的氧化應(yīng)激和心肌損傷，且至少在一定程度上是通過SIRT1發(fā)揮作用的。

圖2 丹皮酚對大鼠心肌氧化應(yīng)激標志物和心肌損傷標志物的影響

(A)通過DCFDA檢測心肌組織中ROS含量。(B,C)通過ELISA試劑盒檢測大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激標志物MDA和SOD的表達水平。(D,E)通過ELISA試劑盒檢測大鼠血漿中LDH和CK的表達水平。*、**、***分別代表P<0.05、P<0.01、P<0.001

2.3丹皮酚改善了大鼠心臟重塑、提高了心臟功能:我們通過超聲心動圖進一步檢測了丹皮酚對于大鼠心臟功能的影響。我們觀察到與I/R組相比，丹皮酚組中大鼠心臟左室縮短分數(shù)(FS)、左室射血分數(shù)(EF)和左室收縮壓(LVSP)顯著增高(圖3A-C)，左室舒張末期壓(LVEDP)則顯著降低(圖3D)。在敲低SIRT1后，與丹皮酚組相比，雖然FS無顯著性差異，但EF和LVSP顯著降低，LVEDP顯著升高(圖3A-D)。結(jié)合前文的實驗結(jié)果，我們認為丹皮酚至少在一定程度上通過上調(diào)SIRT1增強了大鼠心肌缺血再灌注后的心臟功能，顯著改善了心室重構(gòu)情況。

圖3 丹皮酚對大鼠心臟功能和心室重構(gòu)情況的影響

(A-D)通過超聲心動圖分別檢測大鼠心臟左室縮短分數(shù)(FS)、左室射血分數(shù)(EF)、左室收縮壓(LVSP)和左室舒張末期壓(LVEDP)變化情況。*、**、***分別代表P<0.05、P<0.01、P<0.001；ns代表無顯著性差異。

3 討 論

已有不少研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚在多種心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病的進程中發(fā)揮了顯著的效果，但對于丹皮酚作用機制的報道尚且不多。我們的研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚在缺血再灌注損傷大鼠中通過上調(diào)SIRT1的表達，抑制了大鼠心肌組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕了心肌損傷，并因此改善了缺血再灌注造成的心室重構(gòu)和心臟功能障礙。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是缺血再灌注造成心肌損傷的重要驅(qū)動因素之一，ROS的產(chǎn)生可造成線粒體功能紊亂，引起一系列心肌功能紊亂。如氨磷汀被發(fā)現(xiàn)通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)減少了心肌細胞凋亡，抑制了心肌的缺血再灌注損傷；脂聯(lián)素被發(fā)現(xiàn)通過激活PKA信號通路，減少了心肌缺血再灌注損傷中的活性氧產(chǎn)生，對心臟功能具有改善作用[6]。在本研究中，我們觀察到丹皮酚顯著減少了缺血再灌注后大鼠心肌組織中ROS和MDA的含量，同時促進了SOD的產(chǎn)生。心肌損傷標志物的測定和超聲心動圖的結(jié)果則共同說明丹皮酚的預(yù)處理減輕了I/R造成的心肌損傷。丹皮酚對于氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用已在多種病理過程中有過報道，提示丹皮酚是治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的潛在選項。如丹皮酚被發(fā)現(xiàn)可以提高小鼠對NO的利用度，減少主動脈中ROS的產(chǎn)生，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以此減弱多種心血管疾病中的內(nèi)皮功能障礙[7]；在對乙酰氨基酚造成的肝損傷中，丹皮酚增加了肝臟中SOD、GSH等還原性物質(zhì)的含量，減少了ROS的產(chǎn)生，改善了對乙酰氨基酚誘導的肝壞死[8]。結(jié)果證實了丹皮酚可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、預(yù)防I/R損傷，提示了丹皮酚對于心肌I/R損傷的潛在預(yù)防與治療藥用價值，并與主流的研究中所報道的丹皮酚的作用相一致。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了SIRT1對于抑制炎癥、氧化應(yīng)激的作用。SIRT1主要通過激活Nrf2信號通路[9]或抑制FOXO家族蛋白的表達[10]在腦氧化應(yīng)激損傷等多種病理進程中抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。在我們的研究中，我們觀察到模型組大鼠心肌組織中SIRT1表達水平顯著降低，而丹皮酚增強了SIRT1的表達。進一步的研究表明，敲低SIRT1后丹皮酚保護心肌的作用被逆轉(zhuǎn)了。這些結(jié)果說明，至少在一定程度上，丹皮酚通過上調(diào)SIRT1減輕大鼠受到的缺血再灌注損傷。我們的研究在表明了丹皮酚的作用機制的同時也進一步提示了SIRT1在心肌I/R損傷中的保護作用。SIRT1是一個具有良好前景的心臟保護靶點之一，上調(diào)SIRT1在多種心血管疾病中具有保護作用。在慢性恰加斯心肌病中，通過使用SIRT1激動劑，顯著減弱了氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)并改善了心臟功能[11]；薯蕷皂苷則被發(fā)現(xiàn)通過激活SIRT1/Nrf2和p38 MAPK通路減輕氧化應(yīng)激和炎癥以對抗冠心病[12]。我們的研究結(jié)果和主流的研究中SIRT1發(fā)揮的抗氧化應(yīng)激、保護心肌的功能相同。由于SIRT1抗氧化應(yīng)激和炎癥的作用，提示丹皮酚在其他氧化應(yīng)激或炎癥相關(guān)疾病中可能有類似的作用及作用方式，并很可能通過影響SIRT1下游蛋白如Nrf2和FOXOs等發(fā)揮作用，具有更加廣泛的藥用價值。然而這還需要進一步的探究。

總而言之，我們通過在SD大鼠體內(nèi)構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷的模型，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可以通過上調(diào)SIRT1減輕大鼠心肌中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌損傷，改善心臟功能和心室重構(gòu)情況。我們的研究進一步闡明了丹皮酚的作用及其作用機制，為丹皮酚的臨床應(yīng)用和開發(fā)新的缺血再灌注損傷治療方案提供了理論基礎(chǔ)。