LncRNA MEG3在病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液中表達(dá)及意義

朱連海， 何長生， 申建偉， 楊丹平， 胡諍贇

(1.上海市松江區(qū)九亭醫(yī)院兒科， 上海 松江區(qū) 201600 2.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院兒科， 上海 松江區(qū) 201600)

毛細(xì)支氣管炎是一種下呼吸道感染性疾病，以呼吸道合胞病毒引發(fā)的病毒性毛細(xì)支氣管炎最為常見，多發(fā)于2歲以下尤其是2～6個(gè)月嬰幼兒群體。由于遺傳、免疫力低、生活環(huán)境差、流行性疾病等影響，近年來病毒性毛細(xì)支氣管炎發(fā)病率呈遞增趨勢[1]。病毒性毛細(xì)支氣管炎進(jìn)展極快，年齡小于6個(gè)月患兒死亡率高，且治療后多出現(xiàn)哮喘等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒生存及生活質(zhì)量[2]。及時(shí)診斷和采取有效治療對(duì)控制病情發(fā)生發(fā)展，改善患兒預(yù)后有重要意義。病毒性毛細(xì)支氣管炎發(fā)生發(fā)展與呼吸道合胞病毒和炎癥反應(yīng)有關(guān)。Tao等研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道合胞病毒感染的鼻咽癌患者腫瘤組織中LncRNA MEG3(maternally expressed gene 3，母系表達(dá)基因3)低表達(dá)，可能通過影響腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素(IL)-8水平，阻止呼吸道上皮細(xì)胞感染呼吸道合胞病毒[3]。由于LncRNA MEG3在病毒性毛細(xì)支氣管炎發(fā)生發(fā)展中未有研究，本研究通過檢測病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平，分析其與患兒臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，探究其臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年2月至2019年1月上海市松江區(qū)九亭醫(yī)院和上海市松江區(qū)中心醫(yī)院收治的病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒103例，其中男性患兒69例，女性患兒34例，年齡4～25個(gè)月，平均(12.67±3.85)個(gè)月。根據(jù)毛細(xì)支氣管炎臨床病情嚴(yán)重程度分為三組：輕度組41例，中度組35例，重度組27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合病毒性毛細(xì)支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。②入組患兒均在患病3d內(nèi)入院，且2周內(nèi)無類固醇激素使用史。③臨床及預(yù)后資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有先天性心臟病。②有免疫缺陷。③合并肺結(jié)核等肺部感染。另選取同期體檢顯示健康嬰幼兒103例為對(duì)照組。其中男性71例，女性32例，年齡5～24個(gè)月，平均(13.04±4.12)歲。所有入組患兒及健康嬰幼兒家屬均對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)上海市松江區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2主要儀器和試劑:實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號(hào)：7500，美國ABI公司)；SYBR PrimeScriptTM qRT-PCR試劑盒(批號(hào)：RR820a，大連寶生物工程有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse transcriptase Kit，批號(hào)：RP1105，北京索萊寶科技有限公司)；RNA提取試劑盒(Trizol Reagent RNA，批號(hào)：R1200-100，北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方 法

1.3.1樣本采集:入組患兒及健康嬰幼兒分別于入院當(dāng)天及體檢時(shí)抽取外周靜脈血3mL，采用Ficoll-Hypaque分離液分離并獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×109L-1，在CO2飽和濕度下育孵5h后收集細(xì)胞，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。入組健康嬰幼兒采用喉部輕壓刺激法收集痰液。入組患兒于入院當(dāng)天進(jìn)行生理鹽水口腔清潔后，常規(guī)拍背吸痰，痰液量較少則給予3%NaCl氧驅(qū)霧化吸入15min后重新吸痰，保證收集痰液量≥1.5mL。所收集痰液2h內(nèi)檢測合格后，加入4倍體積的1%二硫蘇糖醇、等體積磷酸鹽緩沖液，經(jīng)震蕩、離心后取上清液于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2qRT-PCR法檢測患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液中LncRNA MEG3表達(dá):采用Trizol法分別提取外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用于qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系(20μL)如下：0.8μL上游引物，0.8μL下游引物，2μL cDNA，10μL SYBR Primix Ex TaqTM，0.4μL ROX Dye II，6μL ddH2O，反應(yīng)程序如下：95℃、33s，1循環(huán)；95℃、5s，62℃、32s，以上40個(gè)循環(huán)，一個(gè)樣品進(jìn)行三次重復(fù)。采用2-△△CT法計(jì)算外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液中LncRNA MEG3和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物如表1所示，以GAPDH為內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)與上海徠創(chuàng)生物科技有限公司合作進(jìn)行。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4隨訪:所有入組患兒經(jīng)治療出院后，每3個(gè)月以電話或復(fù)查形式對(duì)其進(jìn)行隨訪，以哮喘發(fā)作為主要終點(diǎn)事件，隨訪至2019年7月截止。

2 結(jié) 果

表2 不同患病程度患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與輕度組比較，#P<0.05；與中度組比較，△P<0.05

2.1不同患病程度患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達(dá)水平比較:對(duì)照、輕度、中度和重度組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中LncRNA MEG3表達(dá)水平依次顯著降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。對(duì)照、輕度、中度和重度組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)水平依次顯著升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

2.2不同患病程度患兒痰液中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達(dá)水平比較:對(duì)照、輕度、中度和重度組患兒痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平依次顯著降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。對(duì)照、輕度、中度和重度組患兒痰液中VEGF mRNA表達(dá)水平依次顯著升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表3。

表3 不同患病程度患兒痰液中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與輕度組比較，#P<0.05；與中度組比較，△P<0.05

2.3患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中及痰液中LncRNA MEG3與VEGF mRNA水平相關(guān)性:如圖1和圖2所示，患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.417，P<0.001；r=-0.560，P<0.001)。

2.4不同臨床特征及預(yù)后患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中及痰液中LncRNA MEG3水平比較:不同性別、年齡患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。有過敏史患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平顯著低于無過敏史患兒(P<0.05)。治療出院后并發(fā)哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平明顯低于未并發(fā)哮喘患兒(P<0.05)，見表4。

表4 患兒單個(gè)核細(xì)胞中及痰液中LncRNA MEG3水平與臨床特征及預(yù)后關(guān)系

2.5病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒不良預(yù)后影響因素分析:logistic回歸分析可知，有過敏史、VEGF高表達(dá)、LncRNA MEG3低表達(dá)是影響病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒發(fā)生不良預(yù)后危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見表5。

表5 病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒不良預(yù)后影響因素分析

圖1 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中LncRNA MEG3與VEGF mRNA水平相關(guān)性

圖2 患兒痰液中LncRNA MEG3與VEGF mRNA水平相關(guān)性

3 討 論

病毒性毛細(xì)支氣管炎常發(fā)生在上呼吸道感染后，表現(xiàn)為持續(xù)性干咳、發(fā)熱、憋喘等，憋喘后患兒病情持續(xù)加重，出現(xiàn)呼氣延長、喘鳴、口周發(fā)青、臉色蒼白、呻吟不止等癥狀。若不能及時(shí)治療，疾病可能進(jìn)展至心力或呼吸衰竭，嚴(yán)重威脅患兒生命安全[4,5]。探尋該疾病生物標(biāo)志物，有助于及時(shí)治療和患者預(yù)后改善。

LncRNA是長度大于200核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，可參與多種疾病進(jìn)展。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA BCYRN1可通過調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移能力，抑制哮喘癥進(jìn)展[6]。Li等在慢性阻塞性肺疾病中研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA MEG3可抑制支氣管上皮細(xì)胞凋亡和自噬[7]。以上研究提示，LncRNA與呼吸道疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，病毒性毛細(xì)支氣管患兒患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，提示LncRNA MEG3可能與病毒性毛細(xì)支氣管炎發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，輕度、中度和重度組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平依次顯著降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LncRNA MEG3可能與病毒性毛細(xì)支氣管炎發(fā)展有關(guān)。

有研究表明，LncRNA MEG3在皮膚黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，過表達(dá)可抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力[8]。Zhang等研究證實(shí)，與健康對(duì)照組相比，LncRNA MEG3在糖尿病性視網(wǎng)膜患者血清中表達(dá)水平顯著降低，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達(dá)水平顯著升高，過表達(dá)LncRNA MEG3可通過下調(diào)VEGF、TGF-β表達(dá)抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)展[9]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照、輕度、中度和重度組患兒痰液中VEGF mRNA表達(dá)水平依次顯著升高，且患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)，提示，LncRNA MEG3可能通過調(diào)控VEGF水平，促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞增殖，影響病毒新毛細(xì)支氣管炎進(jìn)展。有研究表明，骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平明顯低于正常軟骨組織，與VEGF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與血管生成和骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程有關(guān)[10]。有研究表明，咳嗽變異性哮喘患兒血清中VEGF高表達(dá)，與IL-4、IL-5等炎癥因子表達(dá)水平成正相關(guān)[11]。提示本研究中，LncRNA MEG3可能通過VEGF，調(diào)控炎癥因子水平，影響病毒性毛細(xì)支氣管炎發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，有過敏史患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平顯著低于無過敏史患兒，提示外周血單個(gè)核細(xì)胞及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平變化可能與病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒是否存在過敏史有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，治療出院后并發(fā)哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞及痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平明顯低于未并發(fā)哮喘患兒，且有過敏史、VEGF高表達(dá)、LncRNA MEG3低表達(dá)是影響病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒發(fā)生不良預(yù)后危險(xiǎn)因素，提示LncRNA MEG3可能作為病毒性毛細(xì)支氣管炎生物標(biāo)志物，影響疾病進(jìn)展及患兒預(yù)后。

綜上所述，對(duì)照、輕度、中度和重度組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞和痰液中LncRNA MEG3表達(dá)水平依次顯著降低，與VEGF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，可能通過調(diào)控VEGF表達(dá)，影響病毒性毛細(xì)支氣管炎發(fā)生發(fā)展及患兒預(yù)后。但由于本研究方法較為基礎(chǔ)，樣本量較少，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。