葉文斌,宮崢嶸,何玉鵬,陳耀年,趙慶芳,周紫鵑
(1.隴南師范高等專(zhuān)科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院,甘肅 成縣 742500;2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;3.中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)工程研究所,甘肅 蘭州 730000)
中國(guó)是世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出最大的國(guó)家,每年大約有40多億t[1].隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,農(nóng)業(yè)種植物的固體廢棄物也隨之增加,預(yù)計(jì)到2020年將達(dá)到2億t[2].近年來(lái)隨著國(guó)家對(duì)中藥材種植的政策支持,甘肅省大力實(shí)施隴藥振興計(jì)劃,明確支持建立中藥材生產(chǎn)基地,隴南道地中藥材紋黨(Codonopisispilosula)和黃芪(Hedysarumpolybotrys)是主要的支持和推廣種植栽培藥材,近3 a隴南紋黨和紅芪種植面積已達(dá)1.3萬(wàn)hm2上,采挖面積0.5萬(wàn)hm2以上,年產(chǎn)量超過(guò)600萬(wàn)t,產(chǎn)值達(dá)6億元以上,隴南已成為中國(guó)最大的紋黨和紅芪的生產(chǎn)、加工和銷(xiāo)售基地.紋黨和黃芪加工時(shí)會(huì)產(chǎn)生數(shù)量巨大的加工廢棄物,而對(duì)兩種中藥加工時(shí)產(chǎn)生的廢棄物處理和資源化的利用研究是當(dāng)前的面臨的重要問(wèn)題.近年來(lái),隨著人民生活水平的不斷提高,糖尿病的發(fā)生率越來(lái)越高,世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)2025年糖尿病患者將達(dá)到3億[3],糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與人體血糖水平密切相關(guān),也與血糖波動(dòng)有直接關(guān)系,血糖波動(dòng)越大并發(fā)癥的發(fā)生率越高[4].長(zhǎng)時(shí)間的高糖環(huán)境會(huì)引起人體及動(dòng)物體內(nèi)糖脂代謝的紊亂,降低臟器抗氧化酶活性的表達(dá)和增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化水平,從而引起臟器病變導(dǎo)致糖尿病及發(fā)生相應(yīng)的并發(fā)癥[5].人體血液中糖化血紅蛋白含量(HbA1c)能更好地反映機(jī)體糖代謝的水平,是血檢中評(píng)價(jià)糖尿病患者的一個(gè)重要指標(biāo)[6].也有學(xué)者研究表明 HbA1c 與空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)的含量之間存在密切關(guān)系,在治療糖尿病及其并發(fā)癥時(shí),對(duì)血脂代謝紊亂的有效調(diào)節(jié)和血糖水平的及時(shí)控制是治療糖尿病的重點(diǎn)[7-8].目前,雖然市場(chǎng)上治療糖尿病的藥物眾多,但主要集中在化學(xué)合成藥方面,雖然短期治療效果顯著,但長(zhǎng)時(shí)間的服用和注射會(huì)產(chǎn)生不同程度的副作用,如發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)、臟器病變和心血管疾病等[4-8].
隴南紋黨是桔梗科植物黨參的根,具有補(bǔ)中益氣,健脾益肺之功效,主治脾肺虛弱,氣短心悸,食少便溏,虛喘咳嗽,內(nèi)熱消渴等癥,隴南市文縣出產(chǎn)的紋黨或晶黨質(zhì)量最好,是中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品[9-12],其主要成分為紋黨多糖,占紋黨總成分的28.83%[10-11].隴南武都紅芪為豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪的干燥根[13],性溫,味甘,具有補(bǔ)氣固表、利尿解毒、排膿、斂瘡生肌等功效[13],以隴南市武都米倉(cāng)山特產(chǎn)尤為著名,是中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品,其主要成分為紅芪多糖,占紅芪總成分的23%~34%[14].中藥多糖類(lèi)活性物質(zhì)具有眾多的生理功能,黨參多糖和紅芪多糖同其他藥用植物多糖一樣,具有廣泛的藥理作用,而且具有依賴(lài)性低、毒副作用小、安全性高、療效好等特點(diǎn)[15-20].由于紋黨和紅芪加工時(shí)會(huì)產(chǎn)生數(shù)量巨大加工廢棄物,對(duì)加工廢棄物的處理和資源化利用研究是當(dāng)前的一個(gè)主要問(wèn)題.為了減少資源的浪費(fèi)和資源綜合利用,本文以腹腔注射鏈脲霉素(STZ)構(gòu)建小鼠Ⅱ型糖尿病模型,用兩種多糖來(lái)對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血糖血脂的影響進(jìn)行研究,對(duì)患病模型動(dòng)物的治療功能進(jìn)行評(píng)價(jià),為開(kāi)發(fā)無(wú)毒無(wú)副作用的降糖替代藥物和功能食品提供依據(jù),提高隴南道地中藥材紋黨和紅芪的資源化利用水平和附加值,同時(shí),也為合理利用、節(jié)約資源以及綜合開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐.
紋黨加工廢棄物由甘肅省隴南市文縣中寨種植基地提供,紅芪加工廢棄物由甘肅省隴南市武都米倉(cāng)山種植基地提供;清潔級(jí)ICR小鼠,雄性,體質(zhì)量28~35 g(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心);鏈脲霉素(Sigma公司);鹽酸二甲雙胍片(常州制藥廠(chǎng)有限公司生產(chǎn));普魯卡因腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn));SK5200H超聲波清洗儀(廣州越特科學(xué)儀器有限公司);RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海千載科技有限公司);TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));UV759紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);TDL-5000B型低速冷凍大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));LGJ-18型冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng));全自動(dòng)生化分析儀AU5800(貝克曼庫(kù)爾特有限公司);全自動(dòng)血糖檢測(cè)儀(愛(ài)奧樂(lè)醫(yī)療器械(深圳)有限公司).
參考葉文斌等[10]的方法將紋黨和紅芪加工廢棄物先經(jīng)過(guò)篩選,將篩選的廢段、廢須和廢渣清洗干凈后在50 ℃ 烘干,分別通過(guò)粉碎儀粉碎后過(guò)100目篩,用無(wú)水乙醇回流脫脂,50 ℃ 烘干備用,各取100 g,加入500 mL水,在50 ℃溫度下熱水提取12 h,將提取的上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,用 95% 的乙醇沉淀分別獲得紋黨和紅芪粗多糖.將獲取的紋黨和紅芪粗多糖溶于水中,通過(guò) Sevag 試劑去蛋白,通過(guò)斐林試劑,去除銅絡(luò)合物,再分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌,冷凍干燥得潔白的紋黨和紅芪多糖粉末,后經(jīng)過(guò)DEAE-纖維素柱層析,再過(guò)Sephadex G柱純化后真空冷凍干燥得到純化的紋黨和紅芪多糖.
取ICR小鼠 70 只,隨機(jī)分為 7組.按200 mg/kg劑量每天灌胃1次二甲雙胍為藥物處理組;按照50、100、200、400和600 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)每天灌胃1次紋黨多糖和紅芪多糖,分別建立紋黨多糖和紅芪多糖5個(gè)劑量組.在試驗(yàn)期間,保證小鼠自由飲食和活動(dòng),喂食與二甲雙胍等量的生理鹽水為對(duì)照組,給藥后 1 h 眼眶靜脈叢采血,用血糖儀測(cè)定FBG[8]來(lái)篩選最佳紋黨多糖和紅芪多糖的降糖濃度便于后續(xù)試驗(yàn).
按照小鼠體質(zhì)量45 mg/kg標(biāo)準(zhǔn),用檸檬酸緩沖液溶解STZ配制1%的STZ 溶液.將60只適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d的ICR小鼠,隨機(jī)平均分成6組,隨機(jī)取10只小鼠作為CK(0)組飼喂基礎(chǔ)鼠飼料;將其余50 只小鼠腹腔一次性注射45 mg/kg新鮮配制的1%的STZ,然后飼喂添加豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%的高糖高脂喂養(yǎng)30 d后,在禁食不禁水12 h 后,稱(chēng)質(zhì)量后眼眶靜脈叢采血,用血糖儀測(cè)定FBG,將FBG≥11.5 mmol/L 者視為 Ⅱ型糖尿病小鼠造模成功.造模成功后的糖尿病模型組,每天灌胃一次與模型組等體積的生理鹽水;按250 mg/kg劑量每天灌胃一次二甲雙胍為藥物對(duì)照組;紋黨多糖400 mg/kg劑量組、紅芪多糖400 mg/kg劑量組、紋黨多糖和紅芪多糖400 mg/kg+400 mg/kg復(fù)合劑量組,每天灌胃1次.在試驗(yàn)期間,大鼠自由飲食和飲水,連續(xù)觀(guān)察28 d,每隔7 d,測(cè)定FBG 和稱(chēng)量體質(zhì)量,測(cè)定FBG前12 h禁食不禁水.
參照葉文斌等[8]的方法按照1.4給藥處理后,各組大鼠禁食不禁水12 h,采用血糖儀和血糖試紙,剪尾取血測(cè)各組大鼠FBG和糖化血紅蛋白;測(cè)定FBG后,迅速處死動(dòng)物并采血,離心收集血清,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)TC、TG、HDL和LDL水平.
紋黨和紅芪加工廢棄物經(jīng)過(guò)分離提取、脫色和真空冷凍干燥后得潔白的多糖粉,經(jīng)過(guò)測(cè)定紋黨多糖和紅芪多糖得率分別為16.52%和13.96,將所得紋黨多糖配成0.05%的多糖溶液,將紅芪多糖配成0.01%的多糖溶液分別在波長(zhǎng)為260 nm和280 nm的紫外光譜下掃描,結(jié)果均沒(méi)有蛋白質(zhì)和核酸的特征吸收峰.參照葉文斌等[8]的方法用HPLC-GPC色譜檢測(cè)多糖純度,用面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算.液相色譜條件:色譜柱Shodex SUGAR SP-G 0810糖分析柱;流動(dòng)相純H2O;流速1.0 mL/min;檢測(cè)器Shodex RI-10A示差折光檢測(cè)器;柱溫80 ℃;進(jìn)樣量20 μL.在 HPLC-GPC 色譜檢測(cè)中都只出現(xiàn)一個(gè)峰,表明得到的紋黨多糖和紅芪多糖是由一種多糖組成的,面積歸一化計(jì)算純度為 99.65%和99.38%.
1:紅芪多糖;2:紋黨多糖.
二甲雙胍具有減少糖異生作用,降低基礎(chǔ)肝糖輸出,引起基礎(chǔ)血糖減低的功效;也可以促進(jìn)胰島素與胰島素受體的結(jié)合,增加胰島素對(duì)血糖的清除作用,從而達(dá)到人體降血糖的作用.由表1可見(jiàn),CCP劑量組均能降低正常小鼠血糖,50 mg/kg劑量處理與CK(0)組相比無(wú)顯著差異(P>0.05),100~200 mg/kg劑量處理與CK(0)組相比都存在顯著差異的降血糖作用(P<0.05),400~600 mg/kg的CCP劑量處理與CK(0)組比較均有極顯著性差異(P<0.01)的降血糖作用,400 mg/kg的CCP劑量組與二甲雙胍組相比其降糖效果無(wú)顯著差異(P>0.05),且400和600 mg/kg的CCP劑量對(duì)正常小鼠降糖作用相差不大.CHP劑量組也均能降低正常小鼠血糖,50~100 mg/kg的CHP劑量處理與CK(0)組相比無(wú)顯著差異(P>0.05),200 mg/kg的CHP劑量處理與CK(0)組相比存在顯著差異的降血糖作用(P<0.05),400~600 mg/kg的CHP劑量處理與CK(0)組比較均有極顯著性差異(P<0.01)的降血糖作用,CHP400~600 mg/kg劑量組與二甲雙胍組相比其降糖效果均無(wú)顯著差異(P>0.05).這也表明,紋黨多糖和黃芪多糖劑量在400 mg/kg時(shí)對(duì)正常小鼠血糖水平的降低效果與二甲雙胍基本相同,雖然降糖效果沒(méi)有二甲雙胍明顯,但比較溫和,所以將兩種中藥多糖的劑量篩選為400 mg/kg來(lái)進(jìn)行后續(xù)研究.
由表2可見(jiàn),各處理組小鼠的血糖均表現(xiàn)出明顯的升高,且與CK(0)組小鼠之間均存在極顯著差異(P<0.01).連續(xù)灌胃給藥7 d后,二甲雙胍組小鼠血糖在不同時(shí)期均表現(xiàn)為明顯的降低,與STZ模型組相比存在均有極顯著差異(P<0.01).CCP組小鼠灌胃給藥28 d后的血糖值與STZ模型組相比有極顯著性差異(P<0.01),與二甲雙胍組比較血糖高于二甲雙胍組(P<0.05),CHP組小鼠灌胃給藥28 d后的血糖值與STZ模型組相比也存在極顯著性差異(P<0.01),與二甲雙胍組相比血糖明顯高于二甲雙胍組(P<0.01),CCP和CHP聯(lián)合組小鼠灌胃給藥28 d后的血糖值與STZ模型組相比存在極顯著性差異(P<0.01),與二甲雙胍組的血糖相比沒(méi)有顯著性(P>0.05).以上結(jié)果表明,CCP對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血糖具有較好的降血糖作用,且降血糖效果優(yōu)于CHP,而CCP和CHP聯(lián)合用藥對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠降血糖效果最好,與二甲雙胍組無(wú)顯著差異(P>0.05).
表1 紋黨多糖和黃芪多糖對(duì)正常小鼠血糖水平的影響
與CK(0)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與二甲雙胍組比較,#P<0.05,##P<0.01.
Compared with CK(0)group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with metformin group,#P<0.05,##P<0.01.
表2 紋黨多糖和紅芪多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影響
與CK(0)組比較,**P<0.01;與STZ模型組比較,#P<0.01,##P<0.01;與二甲雙胍組比較,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
Compared with CK(0)group,**P<0.01;Compared with STZ-group,#P<0.05;##P<0.01;Compared with metformin group,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
由表3可知,在STZ 誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病小鼠模型組成功后7 d 內(nèi)出現(xiàn)飲水、進(jìn)食及尿量明顯增加,體質(zhì)量略有下降,活動(dòng)減少等表現(xiàn),CK(0)組小鼠隨時(shí)間的推移體質(zhì)量增加明顯,與STZ模型組存在極顯著差異(P<0.01),在連續(xù)給藥28 d后,CCP、CHP、CCP和CHP聯(lián)合治療3個(gè)組小鼠體質(zhì)量都逐漸呈現(xiàn)出不同的增加趨勢(shì).CCP組小鼠灌胃給藥治療28 d后的體質(zhì)量增加明顯,與二甲雙胍組相比有顯著性差異(P<0.05),CHP組小鼠灌胃給藥治療28 d后的體質(zhì)量有所升高,但與二甲雙胍組相比還存在極顯著性差異(P<0.01),CCP和CHP聯(lián)合給藥后Ⅱ型糖尿病小鼠的體質(zhì)量增加迅速,與CK(0)組小鼠之間不存在顯著差異(P>0.05),治療效果與二甲雙胍組相比也沒(méi)有顯著性(P>0.05),而且小鼠活動(dòng)與精神狀況良好.
由表4可知,CCP、CHP、CCP和CHP聯(lián)合組在連續(xù)給藥治療28 d后,小鼠糖化血紅蛋白含量均呈下降趨勢(shì),CCP與STZ模型組相比糖化血紅蛋白含量極顯著降低(P<0.01),效果沒(méi)有二甲雙胍組明顯,但對(duì)小鼠糖化血紅蛋白含量降低的作用卻明顯高于CHP組,而CCP和CHP聯(lián)合給藥治療28 d后糖尿病小鼠的糖化血紅蛋白含量與模型組比較,降低效果明顯,具有極顯著差異(P<0.01),與二甲雙胍組的糖化血紅蛋白含量無(wú)顯著差異(P>0.05).這也說(shuō)明CCP、CHP能夠有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠糖化血紅蛋白的含量,其中CCP和CHP的聯(lián)用效果最佳.
表3 紋黨多糖和紅芪多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響
與CK(0)組比較,**P<0.01;與STZ模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與二甲雙胍組比較,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
Compared with CK(0)group,**P<0.01;Compared with STZ-group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with metformin group,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
表4 紋黨多糖和紅芪多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠糖化血紅蛋白含量的影響
與CK(0)組比較,**P<0.01;與STZ模型組比較,#P<0.01,##P<0.01;與二甲雙胍組比較,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
Compared with CK(0)group,**P<0.01;Compared with STZ-group#P<0.05,##P<0.01;Compared with metformin group,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
由表5可知,CCP、CHP、CCP和CHP聯(lián)合組在連續(xù)給藥治療28 d后與CK(0)組相比,STZ糖尿病模型小鼠TC、TG和LDL均表現(xiàn)出極顯著的升高趨勢(shì)(P<0.01),而HDL極顯著降低(P<0.01).二甲雙胍組治療28 d后與STZ模型組比較,TC、TG 和LDL均有極顯著升高(P<0.01),HDL極顯著降低(P<0.01).連續(xù)給藥CCP治療28 d后與CK(0)組比較小鼠的TC、TG 和LDL顯著降低(P<0.05),HDL顯著升高(P<0.05),CHP治療后小鼠的TC、TG、LDL和HDL與CK(0)組相比治療效果不如CCP;而CCP和CHP聯(lián)合給藥治療28 d后糖尿病小鼠的TC、TG和LDL含量與模型組比較,降低效果明顯,具有極顯著性差異(P<0.01),HDL升高也存在極顯著差異(P<0.01),其對(duì)糖尿病模型小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用與二甲雙胍組相當(dāng),兩組的TC、TG、HDL及LDL 含量均無(wú)顯著性差異(P>0.05).結(jié)果表明CCP、CHP能夠有效調(diào)節(jié)Ⅱ型糖尿病小鼠的血脂.
表5 紋黨多糖和紅芪多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血脂代謝的影響
與CK(0)組比較,**P<0.01;與STZ模型組比較,#P<0.01,##P<0.01;與二甲雙胍組比較,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
Compared with CK(0)group,**P<0.01;Compared with STZ-group#P<0.05,##P<0.01;Compared with metformin group,☆P<0.01,☆☆P<0.01.
糖尿病患者對(duì)葡萄糖利用較低,會(huì)引起脂肪動(dòng)員,從而導(dǎo)致血脂含量升高等并發(fā)癥[20],引起脂類(lèi)代謝紊亂的主要原因是胰島素分泌不足,調(diào)節(jié)血糖的功能不強(qiáng),使血液中 TG、TC水平升高,誘發(fā)脂蛋白的糖基化,增強(qiáng)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化,HbAlc含量上升.HDL是血液中密度最高、顆粒最小的一種脂蛋白,是血脂代謝的基礎(chǔ)物質(zhì),專(zhuān)門(mén)在體內(nèi)結(jié)合多余血脂,轉(zhuǎn)運(yùn)體外,清除血液垃圾,且由于體積小,能穿透動(dòng)脈內(nèi)膜將沉積在里面的膽固醇清除掉并攜帶出血管壁,修復(fù)血管內(nèi)皮破損細(xì)胞,恢復(fù)血管彈性,具有清除血管內(nèi)多余血脂,清除血垢,清潔血管的作用.醫(yī)學(xué)臨床上認(rèn)為,HDL是將肝外組織的膽固醇運(yùn)送到肝臟的工具,因而可以防止游離膽固醇在肝外組織細(xì)胞上的沉積,所以HDL是對(duì)糖尿病患者的并發(fā)癥如冠心病臨床診斷是一個(gè)重要的參考指標(biāo),它的升高是臨床冠心病保護(hù)因子之一,并能防治和延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展.相反的如果血液中LDL濃度升高,將沉積于心腦等部位血管的動(dòng)脈壁內(nèi),逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊,阻塞相應(yīng)的血管,加重糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率.
用隴南道地中藥材紋黨和紅芪加工廢棄物中提取的活性多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血糖血脂的影響的研究結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)28 d的灌胃治療,紋黨多糖和紅芪多糖均能降低正常小鼠的FBG,紋黨多糖降糖能力優(yōu)于紅芪多糖,紋黨多糖和紅芪多糖組合降糖能力最好,能有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠的FBG、HbAlc、TC、TG和LDL含量,促進(jìn)HDL水平的升高,并能顯著改善Ⅱ型糖尿病小鼠血脂代謝紊亂.STZ造模成功后的各組小鼠體形則明顯消瘦,體質(zhì)量逐漸變輕,經(jīng)過(guò)紋黨多糖和紅芪多糖28 d的灌胃治療后,Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間推移,均表現(xiàn)出不同程度的增加,尤其紋黨多糖和紅芪多糖聯(lián)合給藥后Ⅱ型糖尿病小鼠的體質(zhì)量增加迅速,與CK(0)組小鼠之間不存在顯著差異,治療效果與二甲雙胍組等同,而且小鼠活動(dòng)與精神狀況良好.
綜上所述,紋黨多糖和紅芪多糖聯(lián)用具有很好的促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量恢復(fù)的作用.雖然兩種多糖的的降血糖作用沒(méi)有二甲雙胍強(qiáng)烈,但降糖作用比較緩慢和溫和,不易出現(xiàn)降糖藥品強(qiáng)烈的低血糖反應(yīng),是一種比較好的降糖物質(zhì).本研究為開(kāi)發(fā)無(wú)毒無(wú)副作用的降糖替代藥物和功能食品提供了科學(xué)依據(jù).