地質封存CO2泄漏對蚯蚓的毒性效應

趙晨陽，馬俊杰,2,*，薛璐,3，田園，劉丹

1. 西北大學，西安 710127 2. 二氧化碳捕集與封存技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，西安 710127 3. 榆林學院，榆林 719000

二氧化碳捕集與封存技術(CO2capture and storage, CCS)是清潔能源技術的關鍵部分，為減少溫室氣體排放、確保能源安全提供了一條可持續(xù)的道路[1]。CCS項目是將從排放源捕集的CO2注入到盆地的石油與天然氣儲層、深層咸水層和不可開采的煤層[2]等穩(wěn)定的地質構造中，達到捕碳減排的效果[3]。CCS工程的“高效性”取決于“零泄漏”的保障[4]，但由于封存的地質條件和人類活動的不確定性，注入的CO2存在著通過泄漏井、斷層或裂縫以及蓋層的“薄弱帶”(局部高滲帶)產生泄漏的風險[5-7]，加之我國地形條件復雜，生態(tài)環(huán)境脆弱，一旦發(fā)生泄漏，其風險會遠高于其他國家[8]。CCS泄漏將會對近地表陸地生態(tài)系統(tǒng)產生直接威脅，這已經(jīng)成為CCS技術最大的環(huán)境風險[9]。

最近網(wǎng)絡科學安全研究所(RISCS)的研究表明，地質封存CO2泄漏引起的土壤中CO2濃度的增加比任何相關的、短暫的和大氣水平的輕微上升具有更顯著的影響[10]。已有研究證實，CCS泄漏[11-12]可導致土壤CO2濃度升高、土壤酸化[13]以及土壤O2含量減少[14]，在CO2泄漏中心區(qū)域，泄漏量可達2 000～3 000 g·m-2·d-1，土壤CO2濃度接近100%[13]，會對土壤生態(tài)系統(tǒng)以及植物帶來極大的危害。同時，CO2泄漏會對土壤微生物群落及土壤酶活性產生顯著影響。張旺園等[15]研究得出，隨著土壤CO2濃度增加，土壤微生物多樣性逐漸降低，結構趨于單一，土壤酶活性變化明顯。張慧慧等[16]通過變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析得出，高濃度CO2長期入侵土壤包氣帶，能促進細菌、真菌生長，抑制放線菌的生長；真菌對CO2脅迫表現(xiàn)更為敏感?；贑O2泄漏對土壤性質以及土壤微生物的研究，地質封存CO2泄漏對土壤大型動物的影響知之甚少。

蚯蚓作為土壤大型動物的代表，是土壤生態(tài)系統(tǒng)非常重要的組成部分，其生命活動過程可改善土壤結構、提高土壤肥力，它對土壤生態(tài)系統(tǒng)的貢獻已被廣泛認識[17-18]；蚯蚓作為的“生態(tài)系統(tǒng)工程師”，是許多動物的食物來源，也是土壤生物、土壤生態(tài)環(huán)境與陸地生物之間(營養(yǎng))信息傳遞的橋梁[19-21]，在地球物質循環(huán)和陸地生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的物質傳遞中擔負著重要功能[22]。同時，蚯蚓對土壤中外源性污染物非常敏感，是最易受到環(huán)境有毒有害物質傷害的土壤生物之一，因而也是土壤污染生態(tài)風險評價的重要指示生物。

本研究以蚯蚓作為研究對象，通過模擬地質封存CO2泄漏后可能產生的土壤高濃度CO2環(huán)境，研究土壤高濃度CO2對蚯蚓的形態(tài)變化、皮膚及表皮損傷、死亡率、體腔細胞溶酶體中性紅保留時間(NRRT)等生長與生理毒性效應，明確土壤高濃度CO2對土壤典型動物蚯蚓的影響，以期為CCS項目的風險評估以及泄漏的識別提供參考。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 蚯蚓

按照蚯蚓的生態(tài)習性，可將蚯蚓分為表棲型、內棲型和深棲型3類[23]。從CCS項目CO2泄露特征而言，一般具有下部濃度高表層濃度低的特點。關笑坤[24]采用250 cm土柱進行CO2泄露擴散模擬實驗，發(fā)現(xiàn)30 cm深度處CO2濃度可達250 cm深度處的80%。通過預實驗得出，5 cm和10 cm深度處CO2濃度可分別達到30 cm深度處的15%和45%。以250 cm深度處CO2濃度100%為參照，則5 cm和10 cm深度處CO2濃度可達到12%和36%。近表層土壤對深部CO2泄露有比較明顯的響應，其濃度值也明顯超過該層位土壤正?；顒訒rCO2最高濃度(4%)。為了便于通過土壤動物蚯蚓開展CCS項目中CO2泄露風險監(jiān)測，本文以易于發(fā)現(xiàn)、易于采樣的表居型蚯蚓——赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)為實驗對象，其取自陜西卻行生物科技有限公司(陜西楊凌)養(yǎng)殖場，在實驗室用牛糞作為飼養(yǎng)基質，于室溫下長期培養(yǎng)。實驗時選取體重為400～500 mg、生殖環(huán)帶明顯且大小一致的成年蚯蚓。

1.1.2 供試土壤

實驗土壤采自西安市長安區(qū)某農田表層土(0～20 cm)，土壤的基本理化性質如表1所示，該土壤為弱堿性高有機質沙質粘土。

1.1.3 主要儀器和試劑

實踐證明，耐密型玉米品種相比稀植大穗品種具有較大的增產潛力。通過對建昌縣耐密玉米種植現(xiàn)狀和推廣對策分析，引導全縣農民改變種植觀念，廣泛種植耐密玉米品種，通過增加密度和集成耐密型玉米高產栽培技術，實現(xiàn)玉米種植的高產高效。

試劑：二甲基亞砜、中性紅指示劑(C15H17N4Cl)、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、戊二醛、無水乙醇和乙酸異戊酯等，以上試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

主要儀器：光學顯微鏡(型號OLYMPUS CX23，山東博科科學儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡(型號SU3500，深圳市三昊儀器設備有限公司)；動物培養(yǎng)箱(型號YCP-160D，長沙華曉電子科技有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

本實驗用動物培養(yǎng)箱來模擬CCS技術中CO2發(fā)生泄漏后可能產生的高濃度CO2環(huán)境。該培養(yǎng)箱可以通過傳感器及其反饋系統(tǒng)控制箱體內CO2的濃度，以達到控制土壤CO2濃度的目的，該培養(yǎng)箱也可以控制溫度和光照度，其CO2濃度量程可以到達100%。各參數(shù)均可以多級調節(jié)，可以根據(jù)實驗的需要設定相應的目標值。具體裝置如圖1所示。

本實驗參考經(jīng)合組織化學品測試準則(OCED 207)[25]的方法開展蚯蚓毒性實驗。首先通過預實驗得出蚯蚓全存活的最高濃度為8%，全致死的最低濃度為48%。在此基礎上，確定適用于開展蚯蚓毒性實驗的CO2濃度分別為：CK(對照組)、10%、20%、30%、40%和48%共6個濃度梯度。實驗時將馴化一周的蚯蚓放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中清腸24 h，用0.9%的生理鹽水沖洗蚯蚓表面并用濾紙擦干。稱取500 g實驗土樣于實驗盒中，加入適當蒸餾水，調節(jié)土壤含水率，使得土壤含水率為最大持水量的60%。然后將10條清腸后的蚯蚓放入土壤表面，任其自由活動，實驗盒用紗布封口，橡皮筋捆扎，防止蚯蚓逃逸。將實驗盒放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持箱內恒溫(20±1) ℃，提供連續(xù)的光照，適時補充水分，每個處理設置3個重復。

圖1 動物培養(yǎng)箱Fig. 1 Animal incubator

表1 實驗土壤基本理化性質Table 1 Physical and chemical properties of experimental soil

1.2.2 指標測定

形態(tài)變化與皮膚損傷：在實驗過程中觀察蚯蚓形態(tài)變化，并通過掃描電鏡觀察暴露7 d后各濃度梯度下存活的蚯蚓皮膚，拍照記錄皮膚損傷情況。具體操作步驟按照謝顯傳[26]所描述的方法進行試驗，對蚯蚓進行清腸、取材、固定、清洗、脫水、置換和干燥等處理后用掃描電鏡觀察。

蚯蚓死亡數(shù)與死亡率統(tǒng)計：分別在7 d和14 d記錄每個濃度梯度下蚯蚓的死亡數(shù)，實驗中將蚯蚓頭、尾部受到機械刺激而無反應認為是已經(jīng)死亡[19]，根據(jù)死亡率=(死亡數(shù)/總數(shù)量)×100%計算得出蚯蚓的死亡率。

蚯蚓體腔細胞溶酶體中性紅保留時間(neutral red retention time, NRRT)測定方法如下。由于污染物會使蚯蚓溶酶體膜受損，導致中性紅染料釋放，體腔細胞變紅。因此，用NRRT變化來指示蚯蚓受到的污染脅迫，NRRT越長，毒害作用越弱；NRRT越短，毒害作用越強。實驗分別取暴露7 d和14 d后不同CO2濃度下存活的蚯蚓測定NRRT，根據(jù)Maboeta等[27]所描述的方法進行測定。用中性紅工作液(20 mg中性紅溶于1 mL二甲基亞砜)染色，在光學電子顯微鏡下觀察并實時記錄整個染色過程，當視野中超過50%的體腔細胞被染成粉紅色，觀察結束，記錄NRRT。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPASS11.5和origin8.0進行數(shù)據(jù)分析與作圖，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(AV±SD)，高濃度CO2對蚯蚓的半數(shù)致死濃度(LC50)通過線性回歸法求出。

2 結果(Results)

2.1 蚯蚓形態(tài)變化與皮膚損傷

土壤高濃度CO2使蚯蚓的形態(tài)發(fā)生了變化。在暴露1初期，蚯蚓出現(xiàn)了卷曲現(xiàn)象；隨著暴露時間的延長，蚯蚓表現(xiàn)出生殖環(huán)帶腫大、尾部串珠以及斷尾等中毒現(xiàn)象；在實驗過程中還觀察到，受損蚯蚓皮膚表面不像正常蚯蚓一樣保持濕潤，有蚯蚓死亡在土壤表層甚至發(fā)生自溶。

通過掃描電鏡觀察蚯蚓在不同CO2濃度下暴露7 d后的皮膚狀況。CK組蚯蚓的皮膚表面光滑緊湊、組織良好(圖2(a))；CO2濃度為10%時，蚯蚓皮膚出現(xiàn)局部損傷(圖2(b))；CO2濃度為20%時，蚯蚓皮膚損傷面積擴大、程度加深，個別環(huán)節(jié)收縮變細(圖2(c))；CO2濃度為30%時，蚯蚓表皮紋理變粗并出現(xiàn)與皮膚損傷連帶性的明顯組織損傷(圖2(d))；CO2濃度為40%時，發(fā)生大面積皮膚損傷，整個皮膚表面非常粗糙，褶皺明顯(圖2(e)、2(f))。

通過觀察蚯蚓剛毛發(fā)現(xiàn)，CK組蚯蚓的剛毛完整、排列整齊(圖3(a))；隨著土壤CO2濃度升高，蚯蚓的剛毛銳度降低，出現(xiàn)不同程度的開裂及斷裂現(xiàn)象(圖3(b)～3(d))。

進一步放大觀察蚯蚓的表皮紋理變化(圖4)，在同樣的放大倍數(shù)(1 000倍)下，CK組蚯蚓表皮裂隙規(guī)整順直，裂隙間緊致有序(圖4(a))；隨著CO2濃度的增加，蚯蚓的表皮裂隙逐漸加寬、彎曲度增大，表皮裂隙間紋理逐漸模糊，部分裂隙間出現(xiàn)細胞碎屑及其分泌物(圖4(b)～4(e))。

2.2 蚯蚓死亡數(shù)與死亡率

在實驗的第7天和第14天分別統(tǒng)計不同CO2濃度下蚯蚓的死亡數(shù)與死亡率(圖5、圖6)。由圖5可知，在暴露7 d和14 d時，CK組的蚯蚓均未出現(xiàn)死亡。在不同CO2濃度下暴露7 d后，隨著CO2濃度的增加蚯蚓死亡數(shù)隨之增加，10%濃度組開始出現(xiàn)蚯蚓死亡，48%濃度組蚯蚓死亡率達到100%。當暴露時間為14 d時，蚯蚓死亡數(shù)呈現(xiàn)出與暴露7 d時相似的規(guī)律，但死亡率明顯增加，在CO2濃度為40%時蚯蚓的死亡率已達100%。通過線性回歸方法分析蚯蚓死亡率與CO2濃度的關系(圖6)可知，受到高濃度CO2污染的土壤對蚯蚓產生了致死效應，土壤高濃度CO2對蚯蚓的7 d半致死濃度(7 d-LC50)和14 d半致死濃度(14 d-LC50)分別為26.39%和17.78%，LC50隨染毒時間的延長而降低。

2.3 體腔細胞溶酶體中性紅保留時間(NRRT)

在不同CO2濃度下，選擇第6分鐘拍照記錄蚯蚓體腔細胞溶酶體染色情況(圖7)。由圖7可知，隨著CO2濃度的增加，視野內體腔細胞的染色數(shù)量(紅色)逐漸增加。

圖2 暴露7 d時不同CO2濃度下蚯蚓的皮膚損傷情況注：(a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e)～(f). 40%。Fig. 2 Skin damage of earthworms at different CO2 concentrations after 7 d of exposureNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e)～(f). 40%.

圖3 暴露7 d時不同CO2濃度下蚯蚓剛毛受損情況注：(a). CK; (b). 10%; (c). 30%; (d). 40%。Fig. 3 Setae damage of earthworms at different CO2 concentrations after 7 d of exposureNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 30%; (d). 40%.

圖4 暴露7 d后不同CO2濃度下蚯蚓表皮的變化注：(a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%。Fig. 4 Epidermis changes of earthworms at different CO2 concentrations after 7 d of exposureNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%.

圖5 不同CO2濃度和暴露時間下蚯蚓的死亡數(shù)Fig. 5 Earthworm deaths at different CO2 concentration and exposure time

圖6 不同CO2濃度和暴露時間下蚯蚓死亡率的變化Fig. 6 Changes of earthworm mortality under different CO2 concentration and exposure time

圖7 暴露7 d時健康蚯蚓及暴露于不同CO2濃度土壤中的蚯蚓體細胞染色6 min時的情況注：(a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%。Fig. 7 Staining conditions of earthworm cells at 6 min in healthy earthworms and earthworm exposed to soil with different CO2 concentrations after 7 dNote: (a). CK; (b). 10%; (c). 20%; (d). 30%; (e). 40%.

7 d組和14 d組在不同CO2濃度下存活蚯蚓的體腔細胞溶酶體NRRT結果如圖8所示，由圖8可知，當暴露時間相同時，隨著CO2濃度的升高，體腔細胞溶酶體NRRT不斷減??；當CO2濃度相同時，隨著暴露時間的增加，體腔細胞溶酶體NRRT也會縮短。即隨著CO2濃度的升高以及作用時間的增加，體腔細胞溶酶體NRRT不斷減小，說明CO2對蚯蚓溶酶體膜的毒性作用在增強。

體腔細胞溶酶體NRRT抑制率(IRNRRT)，表示在一定條件下，各種污染物對蚯蚓體腔細胞溶酶體正常功能的抑制作用，與污染物濃度呈正相關。NRRT抑制率與NRRT的關系可表達為：

IRNRRT(%)=(NRRTCK-NRRTCI)/NRRTCK

式中：IR為體腔細胞溶酶體NRRT抑制率(inhibition rate)；NRRTCK為對照組體腔細胞溶酶體NRRT；NRRTCI為各實驗組體腔細胞溶酶體NRRT。

圖8 不同CO2濃度下暴露7 d和14 d時蚯蚓體細胞溶酶體的中性紅保留時間(NRRT)Fig. 8 The neutral red retention time (NRRT) of earthworm somatic lysosomes exposed to different CO2 concentrations for 7 d and 14 d

在不同CO2濃度下分別暴露7 d和14 d后各處理組體腔細胞溶酶體NRRT抑制率如表2所示。在毒性實驗中得到蚯蚓7 d-LC50和14 d-LC50的土壤CO2濃度分別為26.39%和17.78%，對比之下，當CO2濃度為10%時，蚯蚓7 d和14 d NRRT抑制率分別達到22.2%和41.2%，說明在蚯蚓個體發(fā)生死亡之前，蚯蚓體腔細胞溶酶體膜已受到損傷。

3 討論(Discussion)

蚯蚓的體壁由角質層、表皮以及皮下的環(huán)肌層、縱肌層等組成。剛毛位于體壁內的剛毛囊中，圍繞蚯蚓的體節(jié)排列，是輔助蚯蚓在土壤中移動的幾丁質細胞器(chitinous organelles)[28-29]。剛毛結構的完整性對蚯蚓在土壤中的運動及其生態(tài)功能的發(fā)揮具有重要的作用。本研究表明，高濃度CO2破壞了蚯蚓的剛毛結構，其可能的原因是高濃度CO2抑制了幾丁質的合成，迫使其結構發(fā)生部分或完全變形，同時剛毛受損會引起蚯蚓運動遲緩和掘穴能力減弱，這也解釋了大多數(shù)蚯蚓死亡于土壤表面的現(xiàn)象。土壤作為蚯蚓生存的介質，與蚯蚓的表皮直接接觸，高濃度CO2所導致的土壤pH降低、O2濃度減少和濕度降低等改變[30]，可能會對蚯蚓的皮膚及表皮產生直接影響，造成蚯蚓皮膚不同程度的損傷、表皮裂隙和褶皺的明顯變化。實驗中還觀察到蚯蚓發(fā)生了身體卷曲、生殖環(huán)帶腫大、尾部串珠及斷尾等異常運動及形態(tài)變化，此現(xiàn)象與劉馥雯等[31]在研究鉻污染土壤穩(wěn)定化處理對蚯蚓的毒性效應時和Nusair等[32]在研究二惡英(PCDD/Fs)對Eiseniaandrei蚯蚓的體表影響時所觀察到的現(xiàn)象基本一致。這說明，高濃度CO2污染土壤后，蚯蚓會產生肉眼可見的中毒癥狀。這些現(xiàn)象可能是由于高濃度CO2對蚯蚓體壁微結構損傷的一種宏觀表現(xiàn)。

在實驗暴露7 d和14 d時，隨著土壤CO2濃度的增加，蚯蚓死亡數(shù)與死亡率逐漸增加。蚯蚓從背孔分泌粘液保持皮膚濕潤，通過皮膚進行呼吸。本研究表明，隨著暴露濃度的增加和時間的延長，蚯蚓的體表變得干燥，其可能原因是高濃度CO2抑制了粘液的分泌；其次，蚯蚓的呼吸方式為有氧呼吸，當空氣經(jīng)皮膚吸入時，氧氣被置換至循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)狀心臟，從而通過血液循環(huán)輸送氧氣并通過皮膚排除CO2[33]。高濃度CO2使蚯蚓皮膚受損，直接阻礙了蚯蚓呼吸時氣體的交換，這在一定程度上抑制了蚯蚓的呼吸，不能為機體提供足夠的能量，這時蚯蚓不得不依靠組織消耗提供能量，當組織消耗過度時導致蚯蚓死亡。此外，相比于內層種威廉腔環(huán)蚓，表層種赤子愛勝蚓也會食取少量的土壤微生物[34]，因此土壤微生物的改變也會對蚯蚓產生影響。Pierce和Sj?gersten[35]通過Asgard平臺試驗，證實了土壤的缺氧和酸化，對大型土壤動物(蚯蚓等)的生存不利，蚯蚓的活性受到抑制。Zhao等[36]對青海省平安縣三合鎮(zhèn)的天然CO2泄漏試驗場的土壤動物的調查結果也表明，在CO2脅迫下，不同種類土壤動物的適應性和耐受性差異較大，其中，蚯蚓對土壤CO2濃度的變化表現(xiàn)最為敏感，隨著CO2濃度的升高，生存率顯著降低。

表2 不同CO2濃度和暴露時間下蚯蚓體腔細胞溶酶體膜NRRT抑制率(IRNRRT)Table 2 NRRT inhibition rate (IRNRRT) of lysosome membrane in earthworm lumen cells under different CO2 concentration and exposure time

溶酶體是一種幾乎存在于所有動物細胞中的亞細胞器[37]，對細胞內受損的細胞器、細胞碎片以及外部入侵的微生物的清除與循環(huán)利用發(fā)揮著重要作用[38]，溶酶體的損害是其濃縮各種污染物的結果[39]。它可以表明一個有機體的健康狀況，常用溶酶體NRRT來評估由污染物引起的溶酶體膜通透性(lysosomal membrane stability, LMS)的改變[40]。本研究結果表明，隨著CO2濃度的增加和暴露時間的延長，NRRT逐漸變短，即CO2對蚯蚓的毒害作用隨著CO2濃度的增加和時間的延長而增強。這種溶酶體膜通透性的增加甚至破壞，可導致組織蛋白酶和其他相關溶酶體水解酶的釋放并進入胞漿，促進細胞程序死亡，被認為是一種細胞死亡的機制[41-43]。雖然此時在不同土壤CO2濃度下，仍有蚯蚓存活，但其健康狀況已經(jīng)受到了不同程度威脅。所以，盡管暴露于CO2濃度相對較低的污染土壤不一定導致蚯蚓死亡，但蚯蚓溶酶體膜通透性的變化是顯著的。Moore等[44]和Fuchs等[45]學者的研究得出，溶酶體系統(tǒng)的改變通常被認為是蚯蚓暴露于污染物的第一反應，這種有害的溶酶體反應通常發(fā)生在細胞和組織病理學之前。也有研究人員證實，蚯蚓溶酶體膜的響應速度遠遠快于其生長、繭產量和繭活力等其他生理反應指標[46-47]。因此，蚯蚓體腔細胞溶酶體NRRT可用作指示地質封存CO2泄漏對蚯蚓種群產生不利影響的早期預警指標，為建立地質封存CO2泄漏近地表監(jiān)測與識別提供技術參考。但由于溶酶體膜NRRT對CO2并非具有專一性，因此在蚯蚓取樣時，應盡量避免其他導致同類現(xiàn)象的污染存在。

綜上所述，盡管CO2泄露對土壤中蚯蚓的形態(tài)、生理及生存影響具有系統(tǒng)性特征，但其研究卻具有明顯的零散性特點，進一步進行高濃度CO2對蚯蚓的血象、酶活性、解剖及超微結構等影響的研究，則更有利于深化其影響的系統(tǒng)性機理認識和挖掘，也有助于利用蚯蚓尋找地質封存CO2泄漏近地表監(jiān)測與識別的方法。