交通空氣污染對(duì)大鼠子代發(fā)育及社交行為的影響

田宇，徐晨露，黃丹妮，馮鈺東，陳佳峰，劉晨陽(yáng)，金永堂,*

1. 環(huán)境表觀遺傳實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058 2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部，杭州 310058

隨著城市化進(jìn)程的加快，全球空氣質(zhì)量已不容樂(lè)觀，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全球91%的人口每天呼吸著受污染的空氣，而尾氣排放已成為空氣污染的主要原因[1]。交通尾氣成分非常復(fù)雜，主要有害物質(zhì)包括細(xì)顆粒物、氮氧化物和二氧化硫等。這些污染物可以通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，透過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，造成炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常改變[2]。

自閉癥是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，主要表現(xiàn)為溝通困難、社交障礙和重復(fù)刻板行為。美國(guó)國(guó)家疾控中心數(shù)據(jù)顯示，自閉癥患病率從2012年的1.46%增長(zhǎng)到2016年的2.47%[3]，但病因未明，且治療困難。Volk等[4-6]對(duì)美國(guó)加利福尼亞州的病例進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，母親懷孕期間和后代出生后第一年暴露于與交通有關(guān)的空氣污染、NO2、PM2.5和PM10與自閉癥有關(guān)。Kerin等[7]的調(diào)查顯示，孕早期NO2暴露劑量與兒童認(rèn)知、適應(yīng)能力評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。Pagalan等[8]的研究指出，兒童自閉癥與母親孕期NO暴露有關(guān)(優(yōu)勢(shì)比(OR)=1.07，95%置信區(qū)間(CI)=1.01～1.13)而與NO2和PM2.5無(wú)關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，在交通空氣污染與自閉癥關(guān)系的研究中，雖然有一些陰性結(jié)論[9]，但大部分研究結(jié)果都證明了二者的聯(lián)系[6,10-11]，也提示仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)性研究來(lái)證明交通空氣污染與自閉癥的因果關(guān)聯(lián)。有研究利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用柴油機(jī)顆粒物急性吸入的方式模擬交通空氣污染物暴露，研究結(jié)果顯示，動(dòng)物出現(xiàn)了自閉癥樣改變，但模擬濃度較高，無(wú)法真實(shí)反映人群的尾氣暴露狀況[12]。

自閉癥病因機(jī)制未明，目前認(rèn)為，除了遺傳因素外，受環(huán)境影響的組蛋白甲基化等表觀遺傳改變可能在調(diào)控大腦發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。H3K4甲基化修飾作為一種染色質(zhì)標(biāo)志，廣泛參與許多生物學(xué)過(guò)程，包括異染色質(zhì)的形成、X染色體失活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，與基因表達(dá)激活有關(guān)[13]。H3K4甲基化異常會(huì)改變其與RNA聚合酶的結(jié)合狀態(tài)，影響DNA轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起大腦發(fā)育的改變，與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[14]。有研究表明，一些與H3K4去甲基化相關(guān)的特異性酶發(fā)生基因突變與自閉癥有關(guān)[15-16]。此外，部分自閉癥患者腦組織中存在H3K4甲基化上調(diào)及分布范圍擴(kuò)大，伴相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)異常，而這些基因通常與神經(jīng)元連接、社會(huì)行為和認(rèn)知功能有關(guān)[17-18]。值得注意的是，人類大腦皮質(zhì)中的H3K4甲基化修飾從產(chǎn)前發(fā)育期間到幼兒期甚至青春期都是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的[19]，可能會(huì)在與外界環(huán)境相互作用的過(guò)程中發(fā)生一些自閉癥相關(guān)的改變。

因此，本研究采用模擬人體生活環(huán)境的交通道路實(shí)地暴露方法，將Wistar孕鼠在整個(gè)孕期或窩鼠整個(gè)哺乳期分別置于校園對(duì)照區(qū)域、普通路段及城市主干道十字路口進(jìn)行交通空氣污染物暴露，然后對(duì)其子代進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)量及行為學(xué)分析，通過(guò)更真實(shí)的人群生活環(huán)境來(lái)探索出生前后交通空氣污染暴露對(duì)大鼠自閉癥樣行為的影響，并分析出生前后暴露于交通空氣污染物與腦組織H3K4甲基化調(diào)控的關(guān)系，為深入認(rèn)識(shí)自閉癥的危險(xiǎn)因素、病因機(jī)制和預(yù)防措施提供思路。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 主要儀器材料

纖維濾膜(江蘇鹽城思銳儀器)，中等流量懸浮顆粒物采樣器(浙江恒達(dá)儀器，ZC-Q0101)，PM2.5-PM5-PM10-TSP切割器(浙江恒達(dá)儀器)，Any-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(美國(guó)Stoelting公司)，總組蛋白提取試劑盒(美國(guó)Epigentek公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)，總組蛋白H3K4甲基化定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Epigentek公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年Wistar大鼠(上海斯萊克)，雌雄各36只，體重250～300 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物處理及分組

將Wistar大鼠雌雄1∶1合籠過(guò)夜，次日清晨檢查到陰栓的雌鼠認(rèn)為交配成功，記為胚胎期第0天(E0)，產(chǎn)仔當(dāng)天記為出生后第0天(P0)。根據(jù)暴露時(shí)間(胚胎期E、出生后P)和暴露濃度(低L、中M、高H)將受孕雌鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，分別為EL、EM、EH、PL、PM和PH。

1.3.2 暴露地點(diǎn)與暴露裝置

根據(jù)交通車流量及城市道路等級(jí)，選擇浙江大學(xué)紫金港校區(qū)內(nèi)某樹(shù)林作為低污染暴露組，選擇紫荊花北路(四車道)某點(diǎn)作為中污染暴露組，選擇城市主干道文一西路和古墩路交叉口作為高污染暴露組。暴露時(shí)，E組大鼠每2～3只一籠，妊娠晚期分籠；P組大鼠每窩一籠。各自放置于校園內(nèi)、紫荊花北路路邊及十字路口路邊0.5～1.0 m高處進(jìn)行暴露。暴露從清晨7:30開(kāi)始到傍晚19:30結(jié)束，持續(xù)20 d(E1～E20、P1～P20)。出生后21 d(P21 d)斷奶，每組仔鼠中取雌雄各10只進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.3 現(xiàn)場(chǎng)污染物監(jiān)測(cè)

暴露期間，每天記錄杭州市氣象監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，包括天氣、氣壓、溫濕度、風(fēng)力風(fēng)向和空氣質(zhì)量指數(shù)(Air Quality Index, AQI)，并從中選取7 d進(jìn)行高峰期交通空氣污染物濃度的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括NOx和PM2.5，每次監(jiān)測(cè)持續(xù)1 h，各暴露點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。

1.3.4 生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)量

P25 d，對(duì)仔鼠稱重、測(cè)量身長(zhǎng)后施安樂(lè)死，迅速解剖取腦組織稱重，將生物樣本編號(hào)并放于-80 ℃冰箱備用。

1.3.5 社交行為測(cè)試

P21 d斷奶后，從每組中選取雌雄各10只，送到浙江大學(xué)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2 d，P22～P23 d進(jìn)行三箱社交行為測(cè)試。三箱社交實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)社會(huì)交往能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，也是評(píng)價(jià)自閉癥動(dòng)物模型時(shí)最常用到的行為測(cè)試[13]，如圖1。實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)階段：第一階段讓被測(cè)鼠在3個(gè)箱室內(nèi)自由活動(dòng)5 min以適應(yīng)環(huán)境；第二階段隨機(jī)向其中一個(gè)籠子內(nèi)放入陌生鼠1(Stranger 1)，讓被測(cè)鼠自由活動(dòng)10 min，被測(cè)鼠對(duì)陌生鼠1或空籠(Empty)的嗅探時(shí)間(Sniffing times)及嗅探頻次(Sniffing frequencies)代表它的社交意向：社交能力正常的仔鼠傾向于接觸新朋友而非空籠；第三階段向籠內(nèi)放入另一只陌生鼠2(Stranger 2)代表新朋友，陌生鼠1代表老朋友，通過(guò)記錄10 min內(nèi)被測(cè)鼠與二者的接觸可評(píng)估其社交記憶能力及社交新穎性：通常情況下，大鼠具有探索及喜新厭舊的本性，更愿意接觸新鮮事物。測(cè)試結(jié)束后帶回實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中。

1.3.6 組蛋白H3K4甲基化檢測(cè)

取仔鼠大腦皮質(zhì)組織樣本0.2 g進(jìn)行組蛋白提取，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，之后根據(jù)總組蛋白H3K4甲基化試劑盒提供的方法定量檢測(cè)總組蛋白H3K4甲基化水平，記為H3K4me(ng·μg-1prot)=OD(樣品-空白)×1000/(蛋白量×斜率)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2組間比較采樣獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD法(方差齊)或蓋姆斯法(方差不齊)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 三箱實(shí)驗(yàn)示意圖Fig. 1 Sketch map of three chambers test

2 結(jié)果(Results)

2.1 暴露現(xiàn)場(chǎng)空氣污染狀況

研究中選取的高濃度暴露點(diǎn)位于古墩路和文一西路交叉口，這2條道路均為杭州市區(qū)主干道，通常情況下每小時(shí)車流量為2 000～2 500次，高峰期可達(dá)3 500次以上，且經(jīng)常出現(xiàn)交通擁堵及車輛怠速。中濃度暴露點(diǎn)位于紫金花北路，是城市輔助道路，通常情況下每小時(shí)車流量為800～1 000次，高峰期為1 500次以上。校園內(nèi)清潔區(qū)域內(nèi)樹(shù)木植被較多，通常情況下無(wú)車輛通行。圖2是杭州城市信息一點(diǎn)通網(wǎng)站公布的某日高峰期暴露地點(diǎn)周邊的車流量情況。

低、中和高濃度暴露點(diǎn)NOx(以NO2計(jì))的1 h平均濃度均未超過(guò)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB3095—2012)，分別為(52.76±22.46)、(110.30±59.32)和(138.89±65.89) μg·m-3；方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較顯示低、高濃度間存在差異(P<0.01)。暴露期間杭州市區(qū)NO2月平均濃度為44.5 μg·m-3。

PM2.5的1 h平均濃度在低、中和高濃度暴露點(diǎn)分別為(71.67±38.47)、(91.43±45.38)和(101.67±53.37) μg·m-3；組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。暴露期間杭州市區(qū)PM2.5月平均濃度為45 μg·m-3。

2.2 子代一般體征和發(fā)育指標(biāo)檢測(cè)

各組子鼠均未出現(xiàn)明顯異常，皮毛順滑，活動(dòng)及飲食正常，雙眼無(wú)異常分泌物。出生后25 d，測(cè)量子鼠身長(zhǎng)體重并施安樂(lè)死，剝離完整大腦并稱重計(jì)算臟器系數(shù)，生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)見(jiàn)表1。胚胎期暴露于不同濃度的交通空氣污染對(duì)出生后體重、身長(zhǎng)及大腦臟器系數(shù)均有影響(P<0.001)，對(duì)身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index, BMI)無(wú)影響(P>0.05)；出生后暴露于不同濃度交通空氣污染對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在中、低濃度水平下，出生后暴露組的體重、身長(zhǎng)及BMI均低于胚胎期暴露組(P<0.001)，大腦臟器系數(shù)則高于胚胎期暴露組(P<0.001)；高濃度下雖然也出現(xiàn)這種趨勢(shì)，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 社交能力檢測(cè)

交通空氣污染對(duì)各組仔鼠社交能力的影響如圖3所示。EL組接觸Stranger 1的頻次及時(shí)間均顯著大于空籠(P<0.01)，EM組接觸Stranger 1的頻次更高(P<0.05)而時(shí)間無(wú)差異(P>0.05)，EH組接觸Stranger 1和空籠的頻次及時(shí)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。方差分析顯示，胚胎期不同濃度組間對(duì)Stranger 1的嗅探時(shí)間及頻次均存在差異(P<0.01)，其中EH組的嗅探時(shí)間及頻次最低。PL、PM和PH各組接觸Stranger 1的頻次和時(shí)間均大于空籠(P<0.05)，但出生后不同濃度組間對(duì)Stranger 1和空籠的嗅探時(shí)間及頻次均無(wú)差異(P>0.05)。

圖2 某日高峰期暴露地點(diǎn)周邊的車流量情況Fig. 2 Traffic flow around exposure site in a daily peak period

在低、中濃度下，暴露時(shí)期不同對(duì)子代接觸Stranger 1和空籠的時(shí)間及頻次均無(wú)影響(P>0.05)。在高濃度下，胚胎期暴露組接觸Stranger 1的時(shí)間更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 子代一般發(fā)育指標(biāo)Table 1 General developmental indicators of offspring

注：1為保留2位小數(shù)后分析方便，本文中顯示的是大腦臟器系數(shù)乘以100后的數(shù)值；2BMI為體重指數(shù)，為保留2位小數(shù)后分析方便，本文中顯示的是BMI×10的數(shù)值；與低濃度比較，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；與中濃度比較，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001；下同。

Note:1In order to facilitate analysis after reserving two decimal numbers, the value shown in this paper is the value of 100 times the coefficient of brain organs;2BMI is body mass index, in order to facilitate analysis after reserving two decimal numbers, the value shown in this paper is the value of 10×BMI; * compared with low concentration, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; compared with medium concentration, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001; the same below.

圖3 交通空氣污染對(duì)仔鼠社交能力的影響注：EL、EM和EH分別表示胚胎期低濃度、胚胎期中濃度、胚胎期高濃度暴露，PL、PM和PH分別表示出生后低濃度、出生后中濃度、出生后高濃度暴露；下同。Fig. 3 Effects of traffic-related air pollution on social ability of offspringNote: EL, EM and EH stand for low, medium and high concentrations of exposure in the embryo, respectively, while PL, PM and PH stand for low, medium and high concentrations of exposure after birth, respectively; the same below.

2.4 社交記憶及新穎性檢測(cè)

交通空氣污染對(duì)各組仔鼠社交記憶及新穎性的影響如圖4所示。EL、EM組接觸Stranger 2的時(shí)間及頻次均高于Stranger 1(P<0.05)，EH組對(duì)二者的嗅探無(wú)差異(P>0.05)。方差分析顯示，不同濃度組對(duì)Stranger 1或Stranger 2的嗅探時(shí)間及頻次均無(wú)差異。PL組對(duì)Stranger 1和Stranger 2的嗅探存在差異(P<0.05)，PM、PH組對(duì)二者的嗅探均無(wú)差異(P>0.05)。不同濃度間對(duì)Stranger 1的嗅探時(shí)間及頻次隨濃度增加而遞增，對(duì)Stranger 2的嗅探遞減，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。相同濃度下，未見(jiàn)暴露時(shí)期對(duì)接觸Stranger 1或Stranger 2的頻次及時(shí)間的影響(P>0.05)。

2.5 組蛋白H3K4甲基化水平

采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定了各暴露組仔鼠腦皮質(zhì)區(qū)的總組蛋白H3K4甲基化水平(圖5)。結(jié)果顯示，E組在各濃度下的H3K4甲基化未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，P組H3K4甲基化則出現(xiàn)濃度依賴性下調(diào)，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在相同濃度下，P組H3K4甲基化顯著高于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(L,P<0.01; M,P<0.001; H,P<0.05)。

2.6 組蛋白H3K4甲基化水平與污染物相關(guān)性分析

分析了各組子代腦皮質(zhì)區(qū)組蛋白H3K4甲基化與PM2.5、NOx濃度的相關(guān)性(表2)，均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

3 討論(Discussion)

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間，對(duì)杭州市區(qū)環(huán)境空氣質(zhì)量及天氣狀況進(jìn)行了記錄，并對(duì)暴露現(xiàn)場(chǎng)高峰期交通空氣污染物PM2.5、NOx濃度進(jìn)行了抽樣，發(fā)現(xiàn)3個(gè)暴露點(diǎn)的污染物含量雖未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但呈現(xiàn)逐級(jí)遞增的趨勢(shì)，且均高于杭州市區(qū)平均值，最高濃度可達(dá)101.67 μg·m-3。主干道十字路口的NOx濃度顯著高于校園對(duì)照點(diǎn)(P<0.01)，最高濃度達(dá)138.89 μg·m-3，提示該區(qū)域交通尾氣污染嚴(yán)重。

圖4 交通空氣污染對(duì)仔鼠社交記憶及新穎性的影響Fig. 4 Effects of traffic-related air pollution on social memory and novelty of offspring

表2 組蛋白H3K4甲基化與污染物濃度的相關(guān)性Table 2 The correlation between histone H3K4 methylation and pollutant concentration

注：r表示相關(guān)系數(shù)，P表示顯著性水平。

Note:rmeans the correlation coefficient,Pmeans the significance level.

圖5 組蛋白H3K4甲基化水平Fig. 5 The level of histone H3K4 methylation

本研究中，雖然各組仔鼠在第一階段社交能力測(cè)試中，接觸同伴的時(shí)間均大于空籠，但胚胎期高濃度暴露組對(duì)二者的接觸沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且仔鼠對(duì)同伴的接觸呈隨著濃度增加而減弱的趨勢(shì)；出生后暴露各組雖然對(duì)二者的選擇性接觸均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但對(duì)空籠的接觸呈隨濃度增加而增加的趨勢(shì)。這說(shuō)明，生長(zhǎng)發(fā)育階段接觸高濃度的交通空氣污染，尤其是胚胎發(fā)育期，會(huì)影響子代的社交能力。在第三階段社交記憶和社交新穎性的測(cè)試中，胚胎期暴露組接觸新朋友的時(shí)間均大于舊朋友，提示社交記憶良好，但高污染組對(duì)新、舊朋友的接觸無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示其社交新穎性受影響；出生后各組隨著暴露濃度增高，仔鼠接觸新朋友的時(shí)間遞減，接觸舊朋友的時(shí)間遞增，高濃度組接觸舊朋友的時(shí)間甚至超過(guò)新朋友，說(shuō)明其社交記憶和社交新穎性受損。此前，Chang等[20]發(fā)現(xiàn)，小鼠宮內(nèi)和早期生命發(fā)育過(guò)程中暴露于柴油廢氣污染(PM2.5約300 μg·m-3、6 h·d-1、5 d·week-1，等于時(shí)間加權(quán)濃度53 μg·m-3)會(huì)出現(xiàn)自閉癥樣行為缺陷，如交往和社會(huì)偏好測(cè)試中的社交能力降低，T-迷宮和大理石掩埋測(cè)試中的重復(fù)行為增加等。Yokota等[21]將孕鼠于妊娠期暴露于柴油廢氣環(huán)境中(90 μg·m-3、8 h·d-1)，發(fā)現(xiàn)后代雄性的攻擊性增強(qiáng)。Church等[22]將圍產(chǎn)期孕鼠暴露于PM2.5環(huán)境中(135.8 μg·m-3，全天)，發(fā)現(xiàn)幼仔社交能力下降，重復(fù)刻板行為增加。Thirtamara等[12]通過(guò)孕鼠及子代妊娠期柴油機(jī)顆粒物暴露(1 000 μg·m-3、4 h·d-1、5 d·week-1)，發(fā)現(xiàn)孕鼠產(chǎn)仔數(shù)、體重和健康狀態(tài)未受到影響；子代雖未出現(xiàn)明顯的社交障礙和溝通異常，但自我修飾、飼養(yǎng)和刻板行為增加，與孤獨(dú)癥患者的重復(fù)性/強(qiáng)迫行為類似。Li等[23]于雄鼠出生后8～22 d經(jīng)鼻內(nèi)滴注PM2.5(2或20 mg·kg-1，每天一次)，發(fā)現(xiàn)2組大鼠均表現(xiàn)出典型的孤獨(dú)癥行為特征，包括溝通障礙、社會(huì)交往不良和回避新奇等。綜合以上發(fā)現(xiàn)，再結(jié)合本次研究結(jié)果，可以推測(cè)城市交通主干道的汽車尾氣排放水平已經(jīng)可以對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育階段的幼鼠產(chǎn)生不良影響，使其產(chǎn)生自閉癥樣行為。

細(xì)顆粒物粒徑小，可以通過(guò)呼吸系統(tǒng)入肺并沉積在肺泡，已被證實(shí)與心血管系統(tǒng)疾病、呼吸道疾病及癌癥有關(guān)。2016年全球PM2.5死因構(gòu)成比達(dá)7.6%，死亡人口達(dá)420萬(wàn)[1]。此外，PM2.5還可以隨著血液循環(huán)通過(guò)血腦屏障入腦[24]，或通過(guò)胎盤(pán)屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)[25]，造成DNA損傷或表觀遺傳異常[26-27]，引起氧化應(yīng)激與膠質(zhì)細(xì)胞激活等神經(jīng)炎癥[28]，甚至造成幼鼠神經(jīng)發(fā)育改變[29]。NOx是指有氮、氧2種物質(zhì)組成的化合物，作為空氣污染指標(biāo)的NOx主要包括NO和NO2，而NO在光照等條件下最終變成NO2，除了造成酸雨及臭氧層破壞，還與呼吸道疾病及自閉癥有關(guān)[30-32]。毒理[29,33-34]和病理研究[35-36]提示自閉癥的發(fā)病或與交通空氣污染物引起神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)激及神經(jīng)炎癥等毒性作用有關(guān)。這些交通空氣污染物引起的氧化應(yīng)激和炎癥損傷會(huì)增加遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定性，可能通過(guò)與基因產(chǎn)生交互作用[5,37-39]以及表觀遺傳修飾的途徑影響蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)自閉癥[26,39]。

為了初步探討交通空氣污染物引起仔鼠出現(xiàn)自閉癥樣異常社交行為的潛在表觀遺傳機(jī)制，本研究檢測(cè)了各組仔鼠腦皮質(zhì)區(qū)組蛋白H3K4甲基化的水平。結(jié)果顯示，在不同暴露濃度下，H3K4甲基化水平并未出現(xiàn)顯著差異。而Cantone等[40]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期職業(yè)性接觸富含重金屬(鎳、砷和鐵)的顆粒物會(huì)引起工人血清H3K4甲基化水平上調(diào)。本研究中未發(fā)現(xiàn)H3K4甲基化水平與交通空氣污染物的關(guān)聯(lián)，可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)厝巳簩?shí)際生活條件下的污染物濃度梯度尚不足以引起大鼠腦組織H3K4甲基化出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的線性變化，也許還因?yàn)镠3K4在體內(nèi)不同組織區(qū)域內(nèi)甲基化水平不一致有關(guān)。并且組蛋白修飾往往存在交叉對(duì)話，或與其他非組蛋白因素共同作用形成級(jí)聯(lián)修飾，使基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)更加復(fù)雜多變，未來(lái)的研究可以將更多表觀遺傳效應(yīng)納入研究中。此外，與胚胎期接觸交通空氣污染物相比，出生后暴露的仔鼠腦組織中H3K4甲基化水平更高，說(shuō)明不同暴露時(shí)期交通空氣污染物對(duì)腦組織組蛋白H3K4甲基化的影響是有差異的。大腦各個(gè)功能區(qū)發(fā)育的窗口期出現(xiàn)及持續(xù)的時(shí)間不一樣，那么相應(yīng)基因表達(dá)及修飾發(fā)生的時(shí)間也不同。之前研究表明[19]，大腦高級(jí)皮質(zhì)區(qū)的發(fā)育與皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的廣泛變化有關(guān)，而H3K4甲基化作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的分子標(biāo)志，其甲基化的快速增加或減少主要發(fā)生在妊娠晚期到出生后第一年，之后逐漸變緩，發(fā)育窗口期的外界環(huán)境刺激可能更容易影響基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。

本研究創(chuàng)新地模擬了人群交通空氣污染物自然吸入環(huán)境，構(gòu)造的動(dòng)物模型更接近于人體暴露條件，可以最大限度地還原真實(shí)環(huán)境。利用經(jīng)典的社交評(píng)價(jià)模型——三箱試驗(yàn)，可以根據(jù)社交溝通、社交記憶及社交新穎性來(lái)評(píng)估動(dòng)物行為，證明本研究中交通污染路口暴露的動(dòng)物確實(shí)出現(xiàn)了自閉癥樣行為，與此前幾項(xiàng)交通污染所致自閉癥動(dòng)物模型結(jié)論一致，對(duì)自閉癥危險(xiǎn)因素的研究有一定的參考意義。與此同時(shí)，本研究首次比較了不同暴露時(shí)期對(duì)腦組織H3K4甲基化水平的影響，為今后進(jìn)一步探討自閉癥的表觀遺傳機(jī)制提供了線索。