外源激素對(duì)銀杏葉中黃酮類化合物積累的影響

王鼎豪，劉 宇，國(guó) 穎，江 皓，汪貴斌

（南京林業(yè)大學(xué) a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

銀杏Ginkgo biloba是中生代孑遺的稀有樹種，為我國(guó)特有樹種[1]。銀杏葉中含有多種具有重要藥理活性的次生代謝產(chǎn)物，其中黃酮類化合物是主要活性成分之一，它不僅廣泛參與植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)，還對(duì)人體具有抗氧化、提高免疫力、擴(kuò)展或收縮血管、降低血脂、抗炎癥等療效[2-3]，在制藥行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。有研究結(jié)果表明，外源激素處理會(huì)對(duì)植物黃酮類化合物的合成與積累產(chǎn)生重要影響。Park 等[4]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的生長(zhǎng)素（IAA）和赤霉素（GA）處理可以促進(jìn)蕎麥Fagopyrum esculentum芽中類黃酮的積累。在酸橙Citrus aurantium葉片上噴施GA 和水楊酸（SA）后，酸橙葉片中總酚和總黃酮含量顯著上升[5]。對(duì)黃柏Phellodendron chinense噴施外源 6-芐氨基嘌呤（6-BA）和α-萘乙酸（NAA）后，葉片中的類黃酮物質(zhì)等藥用成分含量顯著增加[6]。

目前，有關(guān)激素與銀杏次生代謝物的研究多集中在內(nèi)源激素與黃酮含量的關(guān)系或外源激素處理對(duì)銀杏愈傷組織中次生代謝物積累的影響等方面[7-8]。通過對(duì)銀杏植株噴施特定的激素來提高其葉內(nèi)目標(biāo)次生代謝物含量的研究報(bào)道較為鮮見，尤其是進(jìn)行田間試驗(yàn)的研究。本研究中選用4 種可調(diào)節(jié)植物次生代謝的激素處理同一銀杏品種，測(cè)定激素處理后銀杏葉中黃酮的含量及其組成，分析激素種類、濃度及處理后時(shí)長(zhǎng)與黃酮類化合物含量之間的關(guān)系，以期為提高銀杏葉用林的產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于南京林業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地（31°36′N，119°10′E）。該地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫15.5 ℃，年平均日照2 146 h，年平均降水1 037 mm。試驗(yàn)地土壤理化性狀良好，占地約500 m2，約有300 棵銀杏樹，均為10年生實(shí)生樹，樹高2.5 ～3.0 m，地徑6 ～8 cm，株行距1.5 m，株間距1 m。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用6-BA、GA、NAA、PP333共4 種激素，每種激素處理設(shè)置3 個(gè)濃度梯度，以乙醇溶液處理為對(duì)照（CK），共計(jì)13 個(gè)處理（表1）。先將粉狀激素溶解于95%無水乙醇，再用蒸餾水分別稀釋至所需濃度，其中酒精體積分?jǐn)?shù)為5%，Tween 20 體積分?jǐn)?shù)為0.02%，對(duì)照組噴施等量體積分?jǐn)?shù)的乙醇（含0.02%的Tween 20）。

表1 各處理中所使用激素種類及其質(zhì)量濃度Table 1 Types of hormones used in treatments and their mass concentrations mg/L

在試驗(yàn)地內(nèi)選擇生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)一致的銀杏樹掛牌，每個(gè)處理隨機(jī)分配9 株（為9 個(gè)生物學(xué)重復(fù)），共計(jì)處理117 株。將各處理的激素溶液分別噴施在銀杏葉上，直至處理葉片全部濕潤(rùn)，每株樹噴施量約220 mL，各處理噴施量為2 000 mL。

1.3 樣品采集和處理

2019年5月9 日16:00，使用各處理溶液噴施葉片，之后每隔5 d 采集1 次葉片，共采集4 次。采樣時(shí)間為9:00（天氣晴朗）。為了減少誤差，采集每株樹朝南方向枝條的頂部、中部、基部的全展葉片1 ～2 片，將各部位葉片混合后用冰盒保存，立即帶回試驗(yàn)室。將不同處理的葉片分別放入信封，105 ℃殺青10 min 后，置于60 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，用粉碎機(jī)將干葉磨成粉，稱0.5 g用9 cm 定圈濾紙包好，每個(gè)處理包3 份，待提取。

1.4 黃酮提取和測(cè)定[9]

采用索氏提取法提取黃酮：粉包加入石油醚后，在索氏提取器上回流3 h 進(jìn)行除雜，之后加甲醇回流4 h，將提取液旋蒸，蒸干后用25 mL 色譜甲醇和25%鹽酸溶液（4∶1）分批洗脫內(nèi)壁，再回流0.5 h 后用色譜甲醇定容到25 mL，溶液保存待測(cè)。

采用高效液相色譜法（HPLC），使用Waters arc 二元高效液相色譜儀測(cè)定黃酮含量。以甲醇和0.1%磷酸溶液（54∶46）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 500。測(cè)定并計(jì)算槲皮素含量（C槲皮素）、山奈酚含量（C山奈酚）、異鼠李素含量（C異鼠李素），換算總黃酮含量（C總黃酮）。

C總黃酮=(C槲皮素+C山奈酚+C異鼠李素)×2.51。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 2016 和SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，用Graphpad Prism 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素種類和濃度對(duì)銀杏葉槲皮素含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉槲皮素的含量及其多重比較結(jié)果見表2。由表2 可知，使用20 mg/L 6-BA 處理后不同采樣時(shí)間的葉槲皮素含量均顯著提高（P＜0.05），且達(dá)到了各采樣時(shí)間的最高值，與對(duì)照相比，分別提高了60.3%、42.5%、18.1%和47.7%，在處理后10 d 時(shí)達(dá)到最大值2.112 mg/g。較低質(zhì)量濃度的6-BA（20 mg/L） 促進(jìn)葉片槲皮素含量提高且見效快，處理后5～10 d 時(shí)有明顯效果，高質(zhì)量濃度的6-BA（50、80 mg/L）在處理后15 d 內(nèi)，反而抑制了葉中槲皮素的積累，處理后20 d 時(shí)含量有所提升。

表2 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉槲皮素的含量? Table 2 Quercetin contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones mg/g

50、80 mg/L GA 處理促進(jìn)了葉片槲皮素含量的提高且見效快，處理后5 d 時(shí)即有明顯效果，處理后各采樣時(shí)間的槲皮素含量與對(duì)照相比均有所增加，50 mg/L GA 處理相對(duì)提高更多，與對(duì)照相比各采樣時(shí)間分別提高了24.6%、25.7%、2.4%和43.0%。而低質(zhì)量濃度GA（20 mg/L）處理后15 d內(nèi)顯著抑制了葉片中槲皮素的積累，處理后20 d時(shí)槲皮素含量比對(duì)照顯著提高。

經(jīng)NAA 處理后，除50 mg/L NAA 處理后10 d 時(shí)和80 mg/L NAA 處理后5 d 時(shí)葉片槲皮素含量比對(duì)照有所下降外，其他處理和采樣時(shí)間的槲皮素含量均顯著高于對(duì)照。20 mg/L NAA 處理后，各采樣時(shí)間的葉槲皮素含量與對(duì)照相比均顯著增加，80 mg/L NAA 處理后10 ～20 d 時(shí)比對(duì)照分別提高了12.0%、37.4%和88.3%，在處理后15 d 時(shí)達(dá)到最大值2.532 mg/g。

經(jīng)PP333處理后，100 mg/L PP333處理提高了在不同時(shí)間采樣的葉中槲皮素含量，與對(duì)照相比分別提高了25.4%、7.5%、3.3%和32.7%，在處理后20 d 時(shí)達(dá)到最大值1.785 mg/g。而50、100 mg/L PP333處理后15 d 內(nèi)，葉中槲皮素的含量有不同程度的降低，處理后20 d 時(shí)比對(duì)照顯著提高。

2.2 激素種類和濃度對(duì)銀杏葉山奈酚含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉山奈酚的含量及其多重比較結(jié)果見表3。由表3 可知，經(jīng)不同濃度6-BA 處理后，各采樣時(shí)間銀杏葉中山奈酚含量差異均達(dá)到顯著水平，其中50 mg/L 6-BA 處理提升效果最大，與對(duì)照相比分別提高了105.1%、47.8%、41.5%和32.6%。提升效果隨采樣時(shí)間延后而逐漸降低。見效快，在處理后5 d 時(shí)達(dá)到最大值1.782 mg/g。

表3 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉山奈酚的含量 Table 3 Campherol contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones mg/g

葉片經(jīng)50 mg/L GA 處理后，除在處理后10 d 時(shí)山奈酚含量相比對(duì)照減少了1.9%外，其他采樣期內(nèi)山奈酚含量均顯著高于對(duì)照，分別提高了41.0%、26.4%和27.6%，并在處理后20 d 時(shí)達(dá)到最大值1.481 mg/g。20 mg/L GA 處理不同采樣時(shí)間的提高效果與50 mg/L GA 處理一致，但提高量均低于50 mg/L GA 處理。80 mg/L GA 處理后各采樣時(shí)間葉中槲皮素含量均有所提高。GA 處理并經(jīng)10 d 后，山奈酚含量提高較少，甚至出現(xiàn)降低，與其他采樣時(shí)間的情況相反。

葉片經(jīng)NAA 處理后，山奈酚含量均有不同程度的提高，尤其是50、80 mg/L NAA 處理后，各采樣時(shí)間的葉山奈酚含量與對(duì)照相比均有顯著性提高。50 mg/L NAA 處理中 ，各采樣時(shí)間的山奈酚含量與對(duì)照相比分別提高了45.9%、87.4%、81.2%和138.2%，在處理后20 d時(shí)達(dá)到最大值2.765 mg/g。 80 mg/L NAA 處理中，各采樣時(shí)間的山奈酚含量與對(duì)照相比分別提高了65.0%、42.7%、119.0%和99.1%。NAA 提高葉中山奈酚含量見效快，處理后15 ～20 d 時(shí)效果最明顯。

葉片經(jīng)PP333處理后，除150 mg/L PP333處理后10 d 時(shí)抑制了山奈酚含量，其他處理均不同程度提高了不同采樣時(shí)間葉中山奈酚含量。經(jīng)50 mg/L PP333處理后，各采樣時(shí)間的山奈酚含量與對(duì)照相比均有顯著性提高，分別提高了30.5%、11.8%、21.1%和39.4%，在處理后20 d 時(shí)達(dá)到最大值1.618 mg/g。不同濃度PP333處理15 d 后葉中山奈酚含量均顯著提高。

2.3 激素種類和濃度對(duì)銀杏葉異鼠李素含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉異鼠李素的含量及其多重比較結(jié)果見表4。由表4 可知，葉片經(jīng)6-BA 處理后，在大多采樣時(shí)間異鼠李素含量低于對(duì)照，僅20 mg/L 6-BA 處理后15 d、50 mg/L 6-BA 處理后5 d 和80 mg/L 6-BA 處理后10 d 時(shí)顯著高于對(duì)照。

表4 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉異鼠李素的含量 Table 4 Isorhamnetin contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones mg/g

葉片經(jīng)GA 處理后，各采樣期內(nèi)異鼠李素含量均有不同程度提高，其中80 mg/L GA 能顯著提高葉片中異鼠李素含量，各采樣期相比對(duì)照分別提高了38.6%、39.2%、55.3%和48.9%，在處理后15 d 時(shí)達(dá)到最大值0.528 mg/g。GA 在處理后15 ～20 d 時(shí)對(duì)葉中異鼠李素含量提升最大，且隨著濃度提高，異鼠李素含量也有提高。

葉片經(jīng)80 mg/L NAA 處理后，除在處理后5 d 時(shí)表現(xiàn)為抑制外，其他采樣期內(nèi)異鼠李素含量均顯著高于對(duì)照，相比對(duì)照分別提高了109.3%、42.1%和136.9%，在處理后20 d時(shí)達(dá)到最大值0.789 mg/g， 20、50 mg/L NAA 在各采樣期內(nèi)均顯著提高了異鼠李素含量。NAA 對(duì)葉中異鼠李素含量的提升在處理后5 ～10 d 時(shí)即見效，在處理后15 ～20 d時(shí)異鼠李素含量達(dá)最大。

葉片經(jīng)100 mg/L PP333處理后，各采樣期內(nèi)異鼠李素含量均高于對(duì)照，分別提高了17.4%、2.1%、2.6% 和17.1%，在處理后20 d 時(shí)達(dá)到最大值 0.390 mg/g。而50、150 mg/L PP333對(duì)葉內(nèi)異鼠李素含量產(chǎn)生了抑制效果，處理后5 ～15 d 時(shí)抑制作用顯著。

2.4 激素種類和濃度對(duì)銀杏葉總黃酮含量的影響

不同種類及濃度激素處理后銀杏葉總黃酮的含量及其多重比較結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可見，葉片經(jīng)處理后，低質(zhì)量濃度6-BA（20 mg/L）顯著提高了葉中總黃酮含量，且見效快，在處理后15 d 時(shí)出現(xiàn)最大值。50 mg/L 6-BA 處理的提升效果不如20 mg/L 6-BA 處理，在處理后10 d 時(shí)總黃酮含量甚至低于對(duì)照。80 mg/L 6-BA 處理對(duì)各采樣時(shí)間葉中總黃酮含量的提升效果均低于20 mg/L 6-BA 處理。

葉片經(jīng)GA 中處理后，高質(zhì)量濃度的GA（50、80 mg/L）處理中各采樣時(shí)間的葉中總黃酮含量比對(duì)照均有提高，且見效快，在處理后20 d 時(shí)出現(xiàn)最大值。而低質(zhì)量濃度的GA（20 mg/L）處理在處理后15 d 內(nèi)抑制了葉中總黃酮含量。

不同濃度的NAA 均顯著提高了不同采樣時(shí)間的銀杏葉總黃酮含量，且見效快。處理后5 d 時(shí)，低質(zhì)量濃度的NAA（50 mg/L）提升效果優(yōu)于高質(zhì)量濃度的NAA（100、150 mg/L），而處理后10 ～20 d 時(shí)正好相反，且葉中總黃酮含量隨采樣時(shí)間延后而逐漸提高，在處理后20 d時(shí)出現(xiàn)最大值。

100 mg/L PP333處理中各采樣時(shí)間的葉總黃酮含量相比對(duì)照均有提高，并在處理后20 d 時(shí)出現(xiàn)最大值。50、150 mg/L PP333處理后15 d 內(nèi)，葉中總黃酮含量提升不明顯，甚至出現(xiàn)降低。處理后20 d 時(shí)各濃度PP333處理均顯著提高了葉中總黃酮含量。

3 結(jié)論與討論

可以通過采取多種措施來提高銀杏葉用林銀杏葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，如水分調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、樹體調(diào)控等，激素調(diào)控也是一種重要的栽培措施。本研究結(jié)果表明，6-BA、GA、NAA 和PP333有促進(jìn)銀杏葉黃酮類化合物積累的效果，但黃酮類化合物含量的提高幅度受激素種類、激素濃度和處理時(shí)間等因素影響。在本試驗(yàn)環(huán)境下，6-BA、GA、NAA 和PP333提高銀杏葉黃酮類化合物含量的最適宜質(zhì)量濃度分別為20、50、20 和100 mg/L。 在生產(chǎn)實(shí)踐中，需根據(jù)各地的具體環(huán)境條件、銀杏葉用林的生長(zhǎng)狀況等進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)，并在周邊進(jìn)行推廣。

圖1 不同種類及濃度激素處理后銀杏葉總黃酮的含量Fig.1 Total flavonoids contents in G.biloba leaves treated by different types and concentrations of hormones

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。6-BA 屬于細(xì)胞分裂素，在次生代謝產(chǎn)物的合成和積累以及應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)低質(zhì)量濃度的6-BA（20 mg/L）是提高銀杏葉總黃酮含量的最適宜濃度，各采樣時(shí)間的銀杏葉總黃酮含量顯著增高，并且葉中槲皮素、山奈酚含量也顯著提高，其原因是可能較低濃度的6-BA 溶液提高了葉片中細(xì)胞分裂素的水平，抑制并清除了自由基，增強(qiáng)了光合作用[11]，從而促進(jìn)了黃酮的合成和積累。有研究結(jié)果表明，外源6-BA 處理下甘草Glycyrrhiza uralensis中黃酮類物質(zhì)含量提高[12]，6-BA 對(duì)三裂葉野葛Pueraria phaseoloides毛狀根中異黃酮化合物的積累具有重要的調(diào)控作用，與本研究結(jié)果一致[13]。

GA 是種能夠加速細(xì)胞分裂與伸長(zhǎng)，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，抑制植物器官衰老的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)葉片噴施50、80 mg/L GA 后，各采樣時(shí)間的銀杏葉總黃酮含量均有不同程度的提升，并且槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量基本均有所提高。這可能與GA 誘導(dǎo)了DELLA 蛋白降解有關(guān)[15]，而且GA 已被證實(shí)是生長(zhǎng)素運(yùn)輸所必需的激素[16]，兩者均證實(shí)了GA 對(duì)植物生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)效果。另有研究結(jié)果表明，噴施GA 后，黃芩Scutellaria baicalensis中苯丙氨酸途徑的產(chǎn)物木質(zhì)素和黃酮類成分累積量上升[17]，這些因素均有利于次生代謝物黃酮的合成。不同濃度的GA處理除了能影響苦蕎Fagopyrum tataricum的產(chǎn)量，還對(duì)其籽粒中的黃酮含量存在影響[18]。噴施GA可提升葡萄Vitis vinifera所有組織中單萜和倍半萜的合成，并可提升葡萄葉片中類黃酮的含量[19]。

NAA 能促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中，有研究結(jié)果表明它有利于銀杏莖段愈傷組織的誘導(dǎo)[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施20、50、80 mg/L NAA 均會(huì)顯著提升各采樣時(shí)間的銀杏葉中總黃酮含量，但NAA 處理后5 d 時(shí)，受處理葉片出現(xiàn)了明顯的黃化和萎蔫現(xiàn)象，NAA濃度越高，經(jīng)過時(shí)間越長(zhǎng)，黃化和萎蔫現(xiàn)象越嚴(yán)重。這種現(xiàn)象表明，噴施高濃度的NAA 對(duì)銀杏葉造成了較強(qiáng)的逆境脅迫，而黃酮含量會(huì)因?yàn)槊{迫增強(qiáng)而提高[21]，但是噴施高濃度的NAA 不利于銀杏葉片及植株的良性發(fā)育。本研究結(jié)果表明，NAA 提升銀杏葉黃酮含量的適宜噴施質(zhì)量濃度是20 mg/L。 崔剛等[22]在銀杏組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度激素NAA（0.1 mg/L）與6-BA（0.5 mg/L）更有助于銀杏胚愈傷組織中黃酮的積累，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

多效唑有延緩植物生長(zhǎng)，抑制莖稈伸長(zhǎng)，增加植物抗逆性能，提高產(chǎn)量等效果[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100 mg/L PP333處理對(duì)不同采樣時(shí)間的葉片中槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均有促進(jìn)效果。有研究結(jié)果表明，多效唑的作用時(shí)間較長(zhǎng)，施用1 次足量的多效唑，可以影響秧苗的整個(gè)生長(zhǎng)過程，多次施多效唑則有累加效應(yīng)[24]。本試驗(yàn)中數(shù)據(jù)顯示，多效唑處理后15 d 內(nèi)（除100 mg/L處理）銀杏葉總黃酮含量并無顯著增加，但噴施不同濃度多效唑20 d后總黃酮含量均有顯著增加。多效唑噴施油菜Brassica napus的試驗(yàn)結(jié)果表明，多效唑能增加葉綠素含量，從而提升光合效率，提高可溶性糖和相關(guān)合成酶的含量[25]，這些因素均可能與銀杏葉黃酮含量提高有關(guān)。三七Panax notoginseng苗期噴施多效唑，對(duì)葉中葉綠素合成和塊根中總黃酮的積累具有促進(jìn)作用，低濃度多效唑的促進(jìn)作用不顯著，高濃度多效唑的促進(jìn)作用明顯[26]。

不同外源激素影響植物次生代謝的效果和時(shí)間存在差異[4-6]，銀杏葉黃酮含量年動(dòng)態(tài)變化明顯，試驗(yàn)周期越長(zhǎng)，氣候等因素影響越大[27-28]。通常外源激素處理對(duì)銀杏次生代謝物產(chǎn)生影響的時(shí)間較短[22]，因此本研究中將試驗(yàn)周期定為20 d。另有研究結(jié)果表明，9月銀杏葉黃酮含量較高，是采收藥用銀杏葉的主要時(shí)間[27]。在采收前噴施外源激素對(duì)提高銀杏葉的藥用價(jià)值具有重要意義，這4種外源激素對(duì)銀杏葉黃酮含量的長(zhǎng)期影響以及采收前的噴施效果有待進(jìn)一步研究。

本研究中發(fā)現(xiàn)4 種外源激素6-BA、GA、NAA和PP333的濃度和處理時(shí)間對(duì)銀杏葉黃酮含量的短期影響效果明顯，但這4 種激素對(duì)銀杏葉的生長(zhǎng)發(fā)育、內(nèi)源激素含量變化等產(chǎn)生的作用尚不明確，這些因素與植物次生代謝物含量變化緊密相關(guān)[29-31]。 除了黃酮，萜內(nèi)酯含量也是衡量銀杏葉價(jià)值的重要指標(biāo)，因此這4 種外源激素的濃度和處理時(shí)間對(duì)銀杏葉生理生化特性變化的影響，及其導(dǎo)致黃酮和萜內(nèi)酯含量變化的分子機(jī)制均有待進(jìn)一步深入研究。