泡核桃不同器官多酚類物質組分及含量差異分析

陸勝波，史斌斌，張文娥，潘學軍

（1.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省果樹工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025）

核桃作為重要的堅果和木本油料樹種，具有很高的經濟價值。目前，核桃Juglans regiaL.與泡核桃Juglans sigillataDode 是我國的兩種主栽類型[1]， 泡核桃又稱為茶核桃、鐵核桃、漾濞核桃，是西南地區(qū)特有的核桃種質資源，廣泛分布于云南、貴州、四川和西藏的雅魯藏布江中下游等地區(qū)，現(xiàn)今云南、貴州等省的核桃種植面積近百萬公頃[2-3]， 核桃生產已成為助推農業(yè)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興的重要產業(yè)。核桃生產周期長，目前很多核桃樹仍處于種植期或掛果初期，還沒有形成穩(wěn)定的經濟效益，這在一定程度上挫傷了林農管理的積極性。核桃樹體冠幅較大，其枝葉量多，多數(shù)情況下因修枝、剪葉和剝離青皮、內種皮而產生的附屬物都被廢棄，導致了資源浪費和環(huán)境污染等問題[4-5]的產生，若能合理利用這些廢棄物，對于緩解前期種植壓力和增加果農收入都很有幫助。

許多研究結果都表明，核桃含有豐富的多酚類物質，這類物質具有抑菌、抗氧化、降血脂、防衰老等功效[6-8]。目前關于核桃多酚類物質的研究報道很多，相關研究從多酚類物質的提取、分離鑒定和功能成分的體外試驗等方面進行，其中，多酚物質的分離鑒定始終是相關研究的重點，是認識和利用多酚物質的前提[9-10]。Solar 等[11]在1年生核桃枝條中檢出了香草酸、丁香酸、鞣花酸、綠原酸、兒茶素、楊梅素、胡桃醌和1,4-萘醌等8 種酚類物質。田平平等[12]從核桃青皮中檢出了綠原酸、短葉蘇木酚羧酸、花靛-葡萄糖/半乳糖、鞣花、槲皮素-阿拉伯糖、表兒茶素或兒茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等7 種強抗氧化活性成分。Joana 等[13]從核桃葉片中鑒定出了3-咖啡?？鼘帯?-對香豆?？鼘?、4-對香豆酸奎寧、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-木糖苷、槲皮素-3鼠李糖苷和2 種山奈酚戊糖苷衍生物。Regueiro 等[14]應用LC-MS 聯(lián)用技術從核桃仁中鑒定到了酚酸、黃酮、鞣質、水解單寧和縮合單寧等120 種酚類化合物。萬政敏等[15]還從核桃仁的內種皮中檢測到了17 種酚酸類和8 種黃酮類物質，其中沒食子酸是酚酸類含量最高的物質，蘆丁是黃酮類含量最高的物質。這些研究結果表明，核桃的根、枝、葉片、青皮、內種皮等器官中均含有豐富的多酚物質，是開發(fā)和利用多酚的良好植物源。

目前，很多研究都只局限于核桃仁或核桃青皮等單一器官上，而系統(tǒng)評價核桃不同器官中多酚物質的報道卻較少。多酚類物質在核桃器官中分布廣泛，且各自組分和含量存在差異，弄清核桃各器官中酚類物質的組分及含量是其合理開發(fā)利用的前提。為此，本研究以我國西南地區(qū)特有的泡核桃Juglans sigillataDode 優(yōu)良品種‘黔核6號’和‘黔核7 號’為材料，對其不同器官中酚類物質的組分及含量進行了鑒定和分析，以期為深刻認識與合理利用核桃不同器官中的多酚物質提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地處于貴州省畢節(jié)市赫章縣財神鎮(zhèn)（27°13′N、104°71′E），平均海拔為1 750 m，屬于溫帶季風性氣候。氣溫日差較大而年差較小，年均溫為10.0 ～13.6 ℃，最高氣溫33.6 ℃，最低氣溫-3.0 ℃。年總積溫為3 650 ～4 964 ℃，年均降水量為785.5 ～1 068.0 mm，全年降水集中在6—8月，全年平均降水日174 d，日照時數(shù)1 260.8 ～ 1 548.3 h，無霜期210 ～250 d。光照條件較好，太陽輻射較高。試驗地為平緩坡地，排水狀況良好，土壤類型為沙質黃壤土。

1.2 試驗材料

供試核桃品種為本課題組前期篩選的酚類物質含量差異較大的兩個泡核桃Juglans sigillataDode 品種‘黔核6 號’和‘黔核7 號’，以其樹齡為38 a 的實生大樹為供試材料。

于2016年9月采集其成熟期的須根（樹冠滴水線50 ～60 cm 深處的須根，直徑為1 ～5 mm， 分別從東、南、西、北4 個方位采集，每個方位各隨機采集50 g，共200 g）、樹冠中部外圍的 1年生枝條（每個方位各隨機取結果枝5 段，共20 段）、葉片（結果枝基部復葉的第2 片小葉，每個方位各隨機采取10 片葉，共40 片葉）、果實（每個方位各隨機取5 個果，共20 個果）。

將上述樣品放入0 ℃的密閉冰盒中帶回實驗室，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水涮洗幷晾干，將所采果實分別按青皮、內種皮、去皮種仁 3 個器官分離。將樣品迅速用液氮冷凍搗碎混勻，分裝后存放于-80 ℃的超低溫冰箱中以備用。

1.3 方 法

1.3.1 主要儀器及藥品

儀器：LC-15C 型高效液相色譜儀（帶自動進樣 器），日本島津；UV-2550 型紫外可見分光光度計，日本島津；KQ5200DE 型超聲波清洗儀，昆山超聲儀器；SORVALL?Stratos 型高速冷凍離心機，美國賽默飛。

藥品：Folin-酚試劑、普通甲醇、色譜甲醇，碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉，除色譜甲醇外均為分析純試劑，均購買于北京寶萊生物科技有限公司；綠原酸、香草酸、沒食子酸、鞣花酸、蘆丁、表兒茶素、丁香酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香醛、對香豆酸、兒茶素、楊梅素、槲皮素、胡桃醌標準品，均購買自美國Sigma 公司。

1.3.2 多酚提取

采用超聲波輔助法[16]（略有改進）提取多酚：稱取0.5 g 鮮樣組織，加入50%的甲醇10 mL，充分研磨，在50 ℃下以超聲波清洗儀40 kHz 輔助提取40 min，接著經5 ℃冷凍離心機以8 000 r·min-1的轉速離心10 min，取上清液，用50%甲醇定容至10 mL，即為多酚提取液。

1.3.3 總酚、總黃酮及單體酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu 法[17]測定總酚含量；采用鋁離子絡合法[18]測定總黃酮含量；采用高效液相色譜法[19]測定單體酚含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

所有樣品測試均設3 次生物學重復。采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖，采用SPSS 19.0 進行方差分析，采用Duncan 新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 標準品的高效液相色譜分析

在既定的色譜條件下，沒食子酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛、表兒茶素、兒茶素標準品混合液于280 nm 處測定，結果如圖1A 所示；鞣花酸、楊梅素、槲皮素、蘆丁、胡桃醌標準品混合液在251 nm處測定，結果如圖1B 所示；15 種多酚物質在35 min 內可全部分離，且其峰形和分離效果均較好，均能滿足酚類物質的檢測。

圖1 分別在251 和280 nm 處測定的標準品色譜圖Fig.1 Standard chromatograms measured at 251 and 280 nm

2.2 不同器官中總酚和總黃酮的含量分析

‘黔核6 號’和‘黔核7 號’不同器官中總酚和總黃酮含量的檢測結果如圖2 所示。從圖2中可以看出，兩個品種不同器官中總酚、總黃酮的含量差異顯著。葉片中的總酚含量，‘黔核6 號’略高于‘黔核7 號’；內種皮和根中的總黃酮含量，‘黔核7 號’略高于‘黔核6 號’；其余器官中的總酚和總黃酮含量，兩個品種相差均較小?？偡雍?，不同器官間的差異均達到顯著水平；內種皮顯著高于其它器官，而去皮種仁顯著低于其它器官?！? 號’各器官中的總酚含量，葉片顯著高于枝和根；而‘黔核7 號’各器官中的總酚含量，根顯著高于葉和枝?？傸S酮含量，除‘黔核7 號’的枝和根、青皮和去皮種仁間其含量均無差異外，其余器官間其總黃酮的含量差異均達到顯著水平，且其含量大小順序為內種皮＞葉＞枝＞根＞青皮＞去皮種仁?？傮w而言，內種皮的總酚、總黃酮含量整體表現(xiàn)最高，葉、枝、根次之，青皮中的含量中等，去皮種仁中的含量最低。

圖2 兩個品種不同器官的總酚和總黃酮含量Fig.2 Contents of total phenolic and total flavones in different organs of two varieties

2.3 不同器官中多酚的組分及含量分析

‘黔核6 號’和‘黔核7 號’相同器官中多酚的組分基本相同而含量略有差異，而兩個品種不同器官中多酚的組分及含量的差異均明顯，檢測結果見表1 ～2。從供試材料中共檢出14 種多酚物質：酚酸類8 種，包括咖啡酸、對香豆酸、沒食子酸、綠原酸、香草酸、丁香酸、丁香醛、阿魏酸；黃酮類5 種，包括兒茶素、表兒茶素、楊梅素、槲皮素、蘆?。惠刘? 種，即胡桃醌。其中，沒食子酸、對香豆酸、咖啡酸、丁香酸和蘆丁在所有器官中均可檢測到，綠原酸、阿魏酸和丁香醛在除去皮種仁外的其它器官中均可檢測到；兒茶素在除枝外的其它器官中均可檢出，表兒茶素只在根、枝和青皮中才可檢出；槲皮素只在葉片、內種皮和去皮種仁中才可檢出；楊梅素只在根和青皮中才可檢測到；香草酸只在青皮中才可檢測到；胡桃醌在除內種皮和去皮種仁外的其它器官中均能檢出。

根和內種皮是酚類物質總含量最高的兩個器官。從‘黔核6 號’和‘黔核7 號’的根中檢測到11種單體酚，其酚類總含量的變異范圍為10 571.5～ 12 326.1 μg·g-1；從‘黔核6 號’和‘黔核7 號’的內種皮中檢測到10 種單體酚，其酚類總含量的變異范圍為9 371.8 ～13 306.1 μg·g-1。葉片、枝和青皮中酚類物質的含量水平均為中等，其中，葉片中酚類總含量的變異范圍為3 538.6 ～ 4 938.6 μg·g-1，青皮中酚類總含量的變異范圍為 3 060.2 ～3 720.9 μg·g-1；從‘黔核6 號’和‘黔核7 號’的葉片與青皮中均檢測到了12 種單體酚（從‘黔核6 號’的青皮中只檢出10 種）?！? 號’和‘黔核7 號’的枝中均檢測到11 種單體酚，其酚類總含量的變異范圍為1 927.6 ～ 2 009.8 μg·g-1。去皮種仁是多酚組分及含量最少的器官，從‘黔核7 號’的去皮種仁中可檢出7 種單體酚，而從‘黔核6 號’的去皮種仁中只測到 6 種單體酚，兩個品種去皮種仁中酚類物質總含量的變異范圍為32.7 ～58.8 μg·g-1。

在檢測到的酚酸類物質中，綠原酸是含量最高的酚酸類物質，其次是沒食子酸，而咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、丁香酸等酚酸類物質的含量均較少。綠原酸是核桃葉片、枝、青皮等器官中的主要酚酸類物質。綠原酸在葉片中的含量最高，其在‘黔核6 號’與‘黔核7 號’葉片中的含量分別為1 757.1、734.5 μg·g-1；另外，‘黔核7 號’的內種皮中也有較高含量的綠原酸，其含量為574.8 μg·g-1。黃酮類物質中，蘆丁的含量最高，其平均含量為1 777.6 ～2 650.9 μg·g-1。各器官中的蘆丁含量，內種皮顯著高于其它器官；‘黔核6號’和‘黔核7 號’內種皮中的蘆丁含量分別為12 636.2 與8 092.1 μg·g-1。胡桃醌是含量最高的酚類物質，其在‘黔核6 號’與‘黔核7 號’的平均含量分別為3 588.8、4 088.2 μg·g-1，是根、青皮、枝等器官中含量最高的單體酚；且其在根中的含量顯著高于在其它器官中的含量，其在‘黔核6 號’和‘黔核7 號’的根中的含量分別為9 623.5、 11 843.0 μg·g-1。

表1 ‘黔核6 號’不同器官中多酚的組分及含量?Table 1 Components of polyphenols and their contents in different organs of ‘Qianhe 6’ μg·g-1

表2 ‘黔核7 號’不同器官中多酚的組分及含量Table 2 Components of polyphenols and their contents in different organs of ‘Qianhe 7’ μg·g-1

2.4 不同器官中多酚物質的含量分布情況

兩個核桃品種不同器官中酚類物質的含量分布情況如圖3 所示。由圖3 可知，兩個核桃品種的根、枝、青皮中的主要酚類物質均為胡桃醌，其根和青皮中的胡桃醌含量均占90%以上，而其它器官中的含量僅占10%左右；其枝中的胡桃醌含量占55.21%～64.58%，同時還含有一定量的綠原酸、蘆丁和楊梅素，其含量占比為5.97%～17.15%。葉片中的酚類物質以綠原酸和蘆丁為主，‘黔核6 號’葉片中綠原酸和蘆丁的含量占比分別為35.10%與45.23%，‘黔核7 號’葉片中綠原酸和蘆丁的含量占比分別為20.76%與53.51%；同時，兩個品種的葉片中均含有阿魏酸、兒茶素、槲皮素、楊梅素、胡桃醌等組分，其含量占比為2.13%～9.83%。內種皮中蘆丁的含量占比為86.35%～94.03%，蘆丁是其內種皮中的主要多酚物質，而沒食子酸、丁香酸、兒茶素等組分的含量占比僅在1%左右。去皮種仁中的多酚物質以沒食子酸、兒茶素、蘆丁和槲皮素為主，其含量占比為12.77%～37.18%。

圖3 兩個核桃品種不同器官中酚類物質的含量分布情況Fig.3 Distribution of phenols content in different organs of two J.sigillata varieties

2.5 不同酚類物質的含量分布情況

兩個核桃品種不同類別多酚物質的含量分布情況如圖4 所示。由圖4 可知，酚酸類物質主要存在于核桃葉片和內種皮中，其在‘黔核6 號’葉片和內種皮中的含量占比分別為59.78%與17.39%，其中以葉片中的含量為主；其在‘黔核7號’葉片和內種皮中的含量占比分別為37.65%與45.67%，其中以內種皮的含量為主。黃酮類物質主要存在于核桃內種皮中，其在‘黔核6 號’和‘黔核7 號’內種皮中的含量占比分別為74.90%與71.78%；而其在兩個核桃品種葉片中的含量占比為17.59%～19.96%，其在兩個核桃品種根和枝中的含量占比均為3.01%～4.91%，而在兩個核桃品種青皮和去皮種仁中的含量占比均僅有0.19%～0.56%。萘醌類物質主要分布在核桃的根、枝、青皮之中，其在根中的含量最高，占比為67.04%～72.42%；其次是青皮中的含量，其占比為17.84%～24.07%；而其在枝中的含量占比僅有7.61%～7.66%，在葉片中的含量占比也僅有1.23%～2.13%。

3 討論與結論

在對植物抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn)，總酚、總黃酮含量的高低與植物抗氧化能力的強弱有關，這在一定程度上可以反映植物體內酚類物質的總體狀況[20-22]?！? 號’與‘黔核7 號’不同器官中總酚、總黃酮的含量分布一致，不同器官間其含量差異均明顯，兩個核桃品種的總體表現(xiàn)均為內種皮＞葉＞枝＞根＞青皮＞去皮種仁。這與張鵬飛等[23]對其果實中青皮、內種皮和去皮種仁總酚含量的測定結果一致。相關研究結果都表明，核桃內種皮中的酚類物質含量最高，說明核桃中的多酚物質多積累于其內種皮之中。

檢測中發(fā)現(xiàn)，相同器官中多酚的組分基本相同，但兩個品種間略有差異。從‘黔核6 號’與‘黔核7 號’的根、枝、葉、內種皮中均檢測出相同組分，但只有從其青皮和去皮種仁中檢測到的結果存在差異；在去皮種仁中，‘黔核7 號’比‘黔核6 號’多檢測出對香豆酸；而在青皮中，‘黔核7 號’比‘黔核6 號’多檢測出香草酸和表兒茶素這兩種組分。不同器官間多酚組分的差異較大，從葉片和青皮中可檢測到12 種單體酚，而從去皮種仁中只檢測到7 種單體酚；只有沒食子酸、對香豆酸、咖啡酸、丁香酸、蘆丁這5 種單體酚在所有器官中均可檢出，而香草酸僅在‘黔核7 號’的青皮中檢出。此次未檢出鞣花酸，這一結果與Regueiro 等[14]、Bhargava 等[24]在普通核桃和黑核桃中檢出較高含量的鞣花酸及其衍生物的研究結果有所不同，這可能與不同核桃類型、地域環(huán)境等因素均有關。酚類組分差異還與核桃品種和器官分布有關。Akbari 等[25]在6 個不同核桃品種中發(fā)現(xiàn)，咖啡酸只存在于‘Kanikareh1’‘Kanikareh2’ ‘Birgholi1’‘Birgholi2’中，而‘Gerdakaneh1’和‘Kanikareh3’中均未檢測到咖啡酸；其中，在‘Kanikareh1’的內種皮中同時檢出丹寧酸、8-羥基喹啉、水楊酸、咖啡酸這4 種單體酚，而在去皮種仁中只測到咖啡酸；且只在‘Kanikareh2’的內種皮中檢出香草酸，而在其它器官中均未檢出，這與只在‘黔核7 號’青皮中測到香草酸的結果類似，這可能是不同品種和器官特異表達的結果。

圖4 兩個核桃品種不同類別多酚物質的含量分布情況Fig.4 Distribution of different kinds of polyphenols in two J.sigillata varieties

核桃多酚物質具有明顯的器官特異性，根、枝、青皮均有較高含量的胡桃醌，其在‘黔核 6 號’和‘黔核7 號’不同器官中的含量順序均為根＞青皮＞枝，是根、枝、青皮中的主要多酚物質。在枝、葉片和內種皮中還發(fā)現(xiàn)有較高含量的綠原酸，綠原酸在‘黔核7 號’和‘黔核6 號’葉片中的含量分別為734.5、1 757.1 μg·g-1，這與Cheniany等[26]、Gutiérrez-ortiz 等[27]報道的結果相似。此外，從兩個品種的各個器官中均檢測到較高含量的蘆丁，其中，‘黔核7 號’和‘黔核6 號’葉片中的蘆丁含量分別為1 893.4 與2 264.4 μg·g-1， 這一結果與Cosmulescu 等[28]測得的9 個核桃品種葉片中的蘆丁含量平均為989 μg·g-1，其中，‘Vina’‘Hartley’‘Valcor’葉片中的蘆丁含量分別為1 502、1 539、1 867 μg·g-1的研究結果一致。內種皮中的蘆丁含量最高，‘黔核7 號’和‘黔核6 號’內種皮中的蘆丁含量分別為8 092.1 與 12 636.2 μg·g-1。萬政敏等[15]、曲清莉等[29]也都在內種皮中檢測到了高含量的蘆丁，這些研究結果進一步證明，核桃中富含蘆丁，且其主要富集于內種皮上。

本研究從泡核桃的根、枝、葉、果實（青皮、內種皮、去皮種仁）中檢測核桃多酚，共檢測到14 種多酚物質，綠原酸、蘆丁和胡桃醌是核桃中的主要酚類物質。不同器官多酚的組分及含量差異均明顯，內種皮是多酚物質富集程度最高的器官。多酚物質具有明顯的器官特異性，根、枝、青皮中的胡桃醌含量最高，其適合用以提取胡桃醌；葉片和內種皮中均含有豐富的酚酸和黃酮類物質，其中內種皮中蘆丁的含量最高，其可作為提取蘆丁的最佳器官。此外，核桃酚類物質的組分眾多，僅用液相色譜分析會存在一定的局限性，可進一步使用液質聯(lián)用（LC-MS）、氣質聯(lián)用（GC-MS）、核磁共振聯(lián)用質譜（NMR-MS）等更先進的聯(lián)用技術探析酚類物質的分布狀況[30-31]。同時，還應關注果實發(fā)育過程中多酚物質的合成與積累，從相關基因克隆與表達、酶活等分子水平上研究其代謝途徑和調控機理，從而為核桃多酚的研究提供更多的信息。