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    GFP標(biāo)記的4種鏈格孢菌對(duì)棗樹(shù)的侵染研究

    2020-07-01 02:35:16田紅雨史曉夢(mèng)王亞聰張書(shū)蔚冉隆賢
    經(jīng)濟(jì)林研究 2020年2期
    關(guān)鍵詞:潮霉素鏈格棗果

    田紅雨,史曉夢(mèng),張 敏,王亞聰,張書(shū)蔚,冉隆賢

    (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院;b.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071000)

    棗Ziziphus jujubaMill.屬于鼠李科棗屬植物,在我國(guó)最早栽培于7 000年前的黃河中下游地區(qū),是我國(guó)最古老的果樹(shù)之一[1-2]。棗樹(shù)具有抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益均顯著等特點(diǎn),在我國(guó)的栽培十分廣泛,我國(guó)的棗樹(shù)栽培面積和棗果產(chǎn)量均占世界的98%以上[3-6]。棗果是一種藥食同源的果品,棗果含有多種氨基酸、維生素及豐富的礦質(zhì)元素,又有養(yǎng)血安神、補(bǔ)中益氣、強(qiáng)身健脾等功效,具有很高的營(yíng)養(yǎng)與藥用保健價(jià)值[4-5,7-8]。

    棗縮果病是棗樹(shù)生產(chǎn)中危害極為嚴(yán)重的病害之一,普遍發(fā)生于我國(guó)各主要產(chǎn)棗區(qū),棗果受害后變色干縮,果肉呈海綿狀壞死,提前脫落,常導(dǎo)致大面積減產(chǎn)甚至絕收[9]。目前生產(chǎn)上對(duì)此病害的防治效果一直不夠理想,因?yàn)閷?duì)其病原菌的侵入時(shí)間和侵入途徑等尚不明確。有關(guān)研究結(jié)果表明,棗縮果病菌在棗樹(shù)中具有長(zhǎng)期潛伏侵染的特性[10],不同地區(qū)的發(fā)病時(shí)期又存在差異性,侵染時(shí)間最早可發(fā)生于5月下旬,7—8月為發(fā)病初期,8月中下旬至9月上旬為發(fā)病高峰期[11-13],病原菌主要從水孔、氣孔及果洼通過(guò)風(fēng)雨傳播侵入棗果,也可從花、葉片侵入棗樹(shù)體內(nèi)[11,14]。有關(guān)研究者曾報(bào)道,棗縮果病的病原菌種類(lèi)繁多,目前學(xué)術(shù)界對(duì)此仍存在很大的爭(zhēng)議。吳婷等[15]認(rèn)為,真菌和細(xì)菌共同導(dǎo)致了棗縮果病的發(fā)生。韓黨悅[16]和許陽(yáng)[17]都認(rèn)為,棗縮果病的初侵染病原是互隔鏈格孢菌Alternaria alternata。這一研究結(jié)果解決了長(zhǎng)期以來(lái)由于病原不清而導(dǎo)致的防治困難等問(wèn)題,有助于扭轉(zhuǎn)40 多年來(lái)?xiàng)椏s果病病原混雜不清的局面,為生產(chǎn)中棗縮果病的有效防治提供了技術(shù)支撐。何麗等[18]對(duì)新疆病果的病原菌進(jìn)行常規(guī)分離后,選取了有代表性的菌株進(jìn)行了致病性的檢測(cè)和鑒定,也明確了鏈格孢菌是棗縮果病的病原菌。

    鏈格孢屬Alternaria真菌廣泛分布于世界各地,該屬真菌種類(lèi)繁多,寄主范圍廣,適應(yīng)性強(qiáng),目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大約有500 種,可引起包括玉米、小麥、馬鈴薯、番茄和蘋(píng)果、梨等幾十種栽培植物的病害,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失[19-20]。相關(guān)研究結(jié)果表明,蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病、梨黑斑病、馬鈴薯早疫病和番茄黑斑病的病原菌都是鏈格孢屬真菌[21-27],蘋(píng)果、梨等果樹(shù)和馬鈴薯、番茄等農(nóng)作物經(jīng)常栽培于棗園附近,但侵染這些植物的鏈格孢菌是否還可侵染棗樹(shù),引起棗樹(shù)果實(shí)病害的發(fā)生,對(duì)此問(wèn)題的研究尚未見(jiàn)諸報(bào)道。為此,本研究以蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌A.mali、梨黑斑病菌A.kikuchiana、馬鈴薯早疫病菌A.solani和番茄黑斑病菌A.alternata為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標(biāo)記,并對(duì)成功標(biāo)記的菌株在棗果上進(jìn)行致病性檢測(cè),以進(jìn)一步探明棗縮果病初侵染鏈格孢菌的來(lái)源,并通過(guò)在棗樹(shù)花期噴霧接種GFP標(biāo)記的4種鏈格孢菌,進(jìn)一步探究其在棗樹(shù)上的侵染途徑,從而為更有效地防治棗縮果病提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    供試菌株:蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌和馬鈴薯早疫病菌(分別編號(hào)為ZN01、ZN02 與ZN03)均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院曹克強(qiáng)教授和朱杰華教授提供;GFP 標(biāo)記的互隔鏈格孢菌(編號(hào)為CN193)和番茄黑斑病菌(編號(hào)為ZNXR)、根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens gfp基因表達(dá)載體質(zhì)粒,均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理研究室提供。

    試劑和培養(yǎng)基:潮霉素B、卡那霉素、利福平、氨芐青霉素、鏈霉素的濃度分別為10、50、20、100、100 mg·mL-1,乙酰丁香酮(AS) 0.2 mg·mL-1;以IM 為培養(yǎng)基[28],以LB 為液體培養(yǎng)基[29]。

    供試植物:棗樹(shù),栽培于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃。

    1.2 方 法

    1.2.1 4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性的測(cè)定

    采用生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定供試的4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性。分別將ZN01、ZN02、ZN03 和ZN-XR 這4 種鏈格孢菌置于PDA 培養(yǎng)基上,于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d,然后用直徑為 7 mm 的打孔器在所培養(yǎng)菌株的菌落邊緣打取菌碟,分別置于含有濃度依次為5、10、20、50 和100 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上,以不加潮霉素B 培養(yǎng)的菌落作為對(duì)照,每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)。當(dāng)對(duì)照菌落的直徑至少長(zhǎng)到30 mm 時(shí),采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,計(jì)算不同濃度潮霉素B 處理下4 種鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率[30]。將抑菌率(%)轉(zhuǎn)化為幾率值(y),將藥劑濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)(x),求出毒力回歸方程y=a+bx,根據(jù)此方程計(jì)算有效抑制濃度EC50值(μg·mL-1)及相關(guān)系數(shù)(r),并根據(jù)EC50值分析4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性。

    菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(處理菌落直徑)]×100%。

    1.2.2 4 種鏈格孢菌的GFP 標(biāo)記

    取農(nóng)桿菌10 μg 加入到20 mL 的LB 液體培養(yǎng)基(含 有20 μg·mL-1的利福平、50 μg·mL-1的卡那霉素和100 μg·mL-1的鏈霉素)中,在28 ℃、220 r·min-1的搖床中培養(yǎng)24 h 后取出,吸取1 mL轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的離心管內(nèi),以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min,棄上清液,加入1 mL 的IM,吹打使其沉淀懸浮,再次以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心 2 min,棄上清液后加入1 mL 的IM,再次吹打使其沉淀懸浮,然后轉(zhuǎn)移至9 mL 的IM 中,分別加入10 μL 的卡那霉素、鏈霉素、AS,置于搖床上,于28 ℃的溫度條件下以80 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4 h后取出,加入無(wú)菌生理鹽水將光密度值(OD600)調(diào)節(jié)至0.2 ~0.3。將4 種鏈格孢菌的分生孢子懸浮液(1×106個(gè)·mL-1)置于4 ℃冰箱內(nèi)低溫處理 6 h,以提高轉(zhuǎn)化率,然后分別加入等體積的上述農(nóng)桿菌菌液混合,各取200 μL 均勻涂抹于劃線的無(wú)菌濾紙條上,再置于IM 固體培養(yǎng)基上,于 25 ℃的黑暗中培養(yǎng)36 h 后將濾紙條取出并翻轉(zhuǎn)置于含有5 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.3 GFP 標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)

    為了測(cè)定轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性,每種菌各隨機(jī)挑選8 個(gè)轉(zhuǎn)化子,將其接種到不加潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基中,于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)7 d 后,挑取新長(zhǎng)出的菌絲將其轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。按上述方法繼代培養(yǎng)5 代,挑取4 種菌的初代和第5 代轉(zhuǎn)化子的菌絲,將其置于熒光顯微鏡下觀察并照相。為了測(cè)定其生長(zhǎng)的穩(wěn)定性,將 4 種菌的第5 代轉(zhuǎn)化子和野生型菌株分別置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上在25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng),觀察菌落生長(zhǎng)情況并測(cè)量其直徑。

    1.2.4 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌侵染棗果的測(cè)定

    將GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌、棗縮果病互隔鏈格孢菌(編號(hào)為CN193::gfp)和空白的PDA培養(yǎng)基分別制備成4 mm×4 mm 的菌碟,采用刺傷接種的方法分別將其接種在健康的棗果上,每組各設(shè)8 個(gè)點(diǎn),每個(gè)處理各設(shè)6 組,分別以接種CN193::gfp和空白PDA 作為對(duì)照。將接種后的棗果用保鮮膜包裹好,3 d 后取下保鮮膜,7 d 后觀察其發(fā)病情況并計(jì)算發(fā)病率,然后將發(fā)病棗果帶回實(shí)驗(yàn)室,用70%的酒精消毒30 s,用無(wú)菌水沖洗3~ 4 次后取其病健交界處的組織,將其置于含有 10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上,于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng),待其有菌絲長(zhǎng)出后挑取各處理的菌絲,放在熒光顯微鏡下觀察其是否有熒光。

    1.2.5 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌侵染棗花的測(cè)定

    在棗樹(shù)花期于試驗(yàn)地選擇未發(fā)生棗縮果病的棗樹(shù),將GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌和CN193::gfp分別置于PDA 培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d 后,用無(wú)菌水分別配制成濃度為105個(gè)·mL-1的分生孢子懸浮液以備用。以接種經(jīng)GFP 標(biāo)記的 4 種鏈格孢菌為試驗(yàn)組,以接種CN193::gfp為對(duì)照組,每組各選取3 株棗樹(shù),每株棗樹(shù)各選2 個(gè)枝條,在無(wú)風(fēng)雨的天氣且日照較弱的下午對(duì)棗花噴霧接種分生孢子懸浮液,每隔5 d 噴1 次,共噴3 次。待棗果長(zhǎng)出并發(fā)病后采回,用70%的酒精消毒30 s, 用無(wú)菌水沖洗3 ~4 次后取病健交界處的組織,將其置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上,于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng),待其有菌落長(zhǎng)出后挑取菌絲,在熒光顯微鏡下觀察其是否有熒光。

    1.3 統(tǒng)計(jì)方法

    采用SPSS 17.0 軟件用單因素方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析,并用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性

    潮霉素B 的毒力回歸方程和有效中濃度EC50值見(jiàn)表1。蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌對(duì)潮霉素B 的敏感程度有差別,但潮霉素B 的處理濃度與抑制效果間呈正相關(guān),各處理的相關(guān)系數(shù)均在0.91 以上,說(shuō)明這4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 均敏感,因此可使用以潮霉素B 標(biāo)記的gfp基因?qū)@4 種鏈格孢菌進(jìn)行標(biāo)記。

    2.2 GFP 標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性

    分別挑取4 種鏈格孢菌的初代和第5 代轉(zhuǎn)化子的菌絲置于熒光顯微鏡400 倍下觀察,均可觀察到明顯的熒光,觀察結(jié)果如圖1 ~4 所示。從圖1 ~4中可以看出,第5 代與初代轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度均無(wú)差異。培養(yǎng)5 d 后發(fā)現(xiàn),4 種鏈格孢菌的第5 代轉(zhuǎn)化子在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上均可正常生長(zhǎng),且其菌落直徑的大小與野生型菌株間均無(wú)差異。以上結(jié)果表明,經(jīng)GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌其遺傳轉(zhuǎn)化后的特征明顯且穩(wěn)定。

    表1 潮霉素B 的毒力回歸方程和有效中濃度Table 1 Virulence regression equations and median effective concentrations of hygromycin B

    圖1 ZN01::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.1 Fluorescence comparison of hyphae from ZN01::gfp in primary culture and the fifth subculture

    圖2 ZN02::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.2 Fluorescence comparison of hyphae from ZN02::gfp in primary culture and the fifth subculture

    圖3 ZN03::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.3 Fluorescence comparison of hyphae from ZN03::gfp in primary culture and the fifth subculture

    圖4 ZN-XR::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.4 Fluorescence comparison of hyphae from ZN-XR::gfp in primary culture and the fifth subculture

    2.3 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗果的侵染

    分別以GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌、棗縮果病互隔鏈格孢菌(CN193::gfp)和空白的PDA 培養(yǎng)基對(duì)棗果進(jìn)行刺傷接種后發(fā)現(xiàn),接種CN193::gfp和4 種鏈格孢菌的棗果其后期均發(fā)病,接種CN193::gfp和ZN01、ZN02、ZN03、ZN-XR 的棗果其發(fā)病率分別為93.8%與75.0%、87.5%、81.3%、83.3%,且各處理間無(wú)顯著差異(P>0.05),而空白對(duì)照的未發(fā)?。▓D5)。接種4 種鏈格孢菌的棗果均發(fā)病且均有病斑出現(xiàn),其病斑均呈褐色凹陷狀,果肉呈土黃色、海綿狀壞死,提前脫落 (圖6 A—D),此癥狀與接種CN193::gfp的棗果的發(fā)病癥狀(圖6 E)相同。

    圖5 以不同鏈格孢菌刺傷接種后棗果的發(fā)病率Fig.5 Disease incidences of jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

    圖6 以不同鏈格孢菌刺傷接種后棗果的發(fā)病癥狀Fig.6 Symptoms of diseased jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

    對(duì)刺傷接種CN193::gfp和4 種菌株后的發(fā)病棗果進(jìn)行病組織分離,所有病組織在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上均有菌落長(zhǎng)出。分別挑取菌絲放在熒光顯微鏡(400 倍)下觀察,均可觀察到熒光,觀察結(jié)果如圖7 所示。這一觀察結(jié)果進(jìn)一步表明,以蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌刺傷接種均可使棗果發(fā)病,供試菌株對(duì)棗樹(shù)均有致病性。

    2.4 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗花的侵染

    將采回的花期噴霧處理枝條上的發(fā)病棗果置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)后,以4 種鏈格孢菌和CN193::gfp接種處理的病果上均有菌落長(zhǎng)出,分別挑取各處理的菌絲放在熒光顯微鏡(400 倍)下觀察,均可觀察到熒光,觀察結(jié)果如圖8 所示。圖8 表明,蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均能通過(guò)棗花侵入棗樹(shù)。

    圖7 以不同鏈格孢菌刺傷接種后從棗果病組織中分離出的菌絲Fig.7 Hyphae isolated from diseased tissues in jujube fruit inoculated with different Alternaria species through stabbing

    圖8 從花期噴霧接種后的發(fā)病棗果中分離出的菌絲Fig.8 Hyphae isolated from diseased jujube fruits inoculated through spraying at florescence

    3 結(jié)論與討論

    3.1 討 論

    目前,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)在許多重要的病原真菌侵染寄主過(guò)程中都得到了成功的應(yīng)用[31-37]。本研究采用張敏對(duì)棗縮果病菌(CN193)的GFP 標(biāo)記方法[38]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌對(duì)潮霉素B 均敏感,因此,應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法,成功地將潮霉素B 標(biāo)記的gfp基因轉(zhuǎn)入到了這4 種鏈格孢菌中,且轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性良好,可以有效避免田間分離回收病原菌時(shí)雜菌的干擾,并且與篩選抗藥性突變體的方法相比,在對(duì)病原菌的研究過(guò)程中具有更簡(jiǎn)便、直觀、穩(wěn)定的特點(diǎn),今后可利用此方法進(jìn)一步研究棗縮果病菌的侵染規(guī)律和侵染動(dòng)態(tài)。

    本研究采用棗果刺傷接種的方法,檢測(cè)GFP標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗樹(shù)的致病性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),它們均可使棗果產(chǎn)生與接種棗縮果互隔鏈格孢菌CN193::gfp相同的發(fā)病癥狀,從接種了4 種鏈格孢菌菌株的發(fā)病棗果中分離培養(yǎng)長(zhǎng)出的菌絲,在熒光顯微鏡下均可觀察到熒光,說(shuō)明蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均可使棗果發(fā)病,對(duì)棗樹(shù)均有致病性,這一研究結(jié)果與張敏等[39]對(duì)棗縮果病互隔鏈格孢菌潛在寄主的研究結(jié)果一致。因此,在棗園附近應(yīng)避免種植馬鈴薯、番茄、蘋(píng)果、梨及其它易被鏈格孢菌侵染的植物,應(yīng)做好周?chē)胁≈参锏牟『芾砗蛨@區(qū)的綜合防治工作。今后還需進(jìn)一步對(duì)其它鏈格孢屬真菌的致病性進(jìn)行研究,分析其與棗縮果病互隔鏈格孢菌的同源性,從而為進(jìn)一步明確棗縮果病的初侵染病原提供更加可靠的依據(jù)。

    棗縮果病菌最初侵入棗樹(shù)的時(shí)期尚不明確,因此,本研究進(jìn)一步探究了供試GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗樹(shù)的侵染途徑,將其在棗樹(shù)花期噴霧接種,待處理枝條上的棗果長(zhǎng)出并發(fā)病后帶回實(shí)驗(yàn)室分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其病組織分離培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌絲在熒光顯微鏡下均能觀察到熒光,說(shuō)明這4 種鏈格孢菌均能在棗樹(shù)花期通過(guò)棗花侵入棗樹(shù),許陽(yáng)[17]、趙樂(lè)等[40]、張敏[38]也都研究證明了棗縮果病互隔鏈格孢菌在花期即能侵入棗樹(shù),且王森等[41]在觀察不同地區(qū)不同類(lèi)型棗吊的開(kāi)花期后發(fā)現(xiàn),棗樹(shù)盛花期較長(zhǎng),為1 ~2 個(gè)月,所以必須重視在棗樹(shù)花期對(duì)棗縮果病的防治工作,從而更加有效地避免這類(lèi)病原菌對(duì)棗樹(shù)的危害。

    3.2 結(jié) 論

    本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法獲得了GFP 標(biāo)記的蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌,在棗縮果病的研究中為開(kāi)展病原菌對(duì)寄主的侵染研究提供了更加簡(jiǎn)便有效的方法,同時(shí)證實(shí)了這4 種非棗屬植物寄主上的鏈格孢屬真菌對(duì)棗樹(shù)均有致病性,且在花期和幼果期均可以侵入棗樹(shù),由此推測(cè),這 4 種鏈格孢菌也都有可能成為棗縮果病的潛在病原菌,這一研究擴(kuò)大了棗縮果病初侵染病原的研究范圍,并對(duì)棗園規(guī)劃和管理具有一定的指導(dǎo)意義。

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