外源激素處理接穗對海南油茶高接換冠的影響

張 健，葉天文，陳 雅，李艷民，王篤雄，羅 健，袁德義

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004； 2.澄邁樂香種苗管理有限公司，海南 澄邁 571900）

油茶是我國特有的木本油料樹種，也是海南島的傳統(tǒng)植物資源，海南島特有的氣候環(huán)境條件孕育了豐富而具有特色的油茶資源。海南種植油茶歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，所產(chǎn)茶籽油的口感與品質(zhì)有別于內(nèi)地，茶油具有獨特的香味，在當(dāng)?shù)乇环Q為“山柚油”，價格較為昂貴[1]。但海南省油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分滯后，其主要原因是缺乏優(yōu)良品種，尤其是長期使用實生苗造林，導(dǎo)致品種退化嚴(yán)重，產(chǎn)量低；同時經(jīng)營管理方式粗放，大多處于半野生和原始栽培狀態(tài)，形成了大面積的低產(chǎn)林[2]。本課題組自承擔(dān)國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項以來，對海南特色油茶種質(zhì)資源進(jìn)行了深入調(diào)查研究[3-4]，并于2016年選育出‘海油1 號’ ‘海油2 號’‘海油3 號’‘海油4 號’4 個品種，為海南油茶種質(zhì)資源的開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了優(yōu)良品種?，F(xiàn)階段亟待運用嫁接技術(shù)進(jìn)行新品種的擴(kuò)繁來改善海南地區(qū)油茶低產(chǎn)的現(xiàn)狀。

大樹高接換冠是較為便捷高效的經(jīng)濟(jì)林樹種無性系改造方法之一。應(yīng)用該方法進(jìn)行經(jīng)濟(jì)林樹種的改造，不但成活率高，而且2 a 恢復(fù)樹勢，3 a可掛果，5 a 即能達(dá)到豐產(chǎn)，是油茶優(yōu)良品種推廣、低產(chǎn)林改造的關(guān)鍵技術(shù)[5]。愈合是嫁接成活的首要條件，接穗能否成活，取決于砧穗能否產(chǎn)生愈傷組織，快速連接并分化出形成層及輸導(dǎo)組織[6]。在植株嫁接愈合過程中，愈傷組織的分化、產(chǎn)生及其延伸速度是決定愈合時間的一個關(guān)鍵因素，外源激素在嫁接愈合過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。利用外源激素處理接穗在核桃[7]、棗樹[8]、白玉芒[9]等樹種的嫁接方面均有相關(guān)研究，但在油茶嫁接方面的應(yīng)用僅有少量報道。鄭碧娟等[10]以100、200、300 mg/L 的KT 溶液浸泡油茶芽苗砧接穗，研究KT 處理后的油茶芽苗砧接穗對其嵌合體發(fā)育的影響，結(jié)果表明接穗經(jīng)低濃度KT 浸泡后再進(jìn)行嫁接，有利于嵌合體的愈合及成活率的提高。蘇麗芳等[11]在研究外源IAA 對油茶芽苗砧嵌合體愈合的影響試驗中發(fā)現(xiàn)，外源IAA 的使用使油茶芽苗砧嵌合體的各項生理指標(biāo)發(fā)生了變化，加劇了愈合過程中可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化，也使嫁接苗體內(nèi)保護(hù)酶活性發(fā)生變化，使愈合的關(guān)鍵時期提前。本試驗中以海南本地實生播種的8年生油茶樹為砧木，將接穗用外源激素處理后進(jìn)行嫁接，探究外源激素對油茶高接換冠的影響，以確定外源激素的最佳應(yīng)用濃度和處理方式，為油茶良種繁育和生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地在海南省澄邁縣福山鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)教學(xué)實習(xí)基地。該基地位于北緯19°56′45″、東經(jīng)109°45′56″，屬熱帶季風(fēng)氣候，長夏無冬，熱雨同季，年平均氣溫23.8 ℃，土壤為赤紅壤，pH5.0 ～5.5，且富硒程度高，具備栽培油茶的優(yōu)良環(huán)境[12]。

1.2 試驗材料

以該基地海南本地實生油茶苗造林的8年生油茶樹為砧木，株行距為3 m×4 m，嫁接前 1 個月對試驗地進(jìn)行墾覆清理，同時對樹體進(jìn)行整形定干，每棵樹選留4 ～5 個分枝角度適合、干直光滑、無病蟲害的主枝，其余枝全部從基部剪除。嫁接高度控制在60 ～70 cm，嫁接部位砧木直徑控制在20 ～30 mm。接穗采自該基地2017年營建的采穗圃，接穗品種為‘海油3 號’，選取發(fā)育健壯、芽眼飽滿的當(dāng)年生半木質(zhì)化新梢為接穗。

1.3 試驗方法

2018年8月，采用L9(34)正交試驗法進(jìn)行試驗，各試驗因素及其水平見表1，正交設(shè)計方案見表2。以無處理為對照，共10 個處理組合，每個處理嫁接30 個接穗，3 次重復(fù)。

表1 以外源激素處理海南油茶接穗的試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in the using exogenous hormone treat C.hainanica scions test

在3 種處理方式中，速蘸和浸泡均在削穗后進(jìn)行，嫁接時將配制好的溶液倒于干凈的塑料盆中，將削好的接穗切面浸在溶液中。由同一人員采用插皮接的方法進(jìn)行所有嫁接操作。接后綁保濕罩，并用上部剪有小口的信封進(jìn)行遮陰。按照常規(guī)方法統(tǒng)一進(jìn)行田間土肥水管理，做好病蟲害防治和除萌。

1.4 測量指標(biāo)與方法

1.4.1 愈傷組織形成率調(diào)查

嫁接后，每隔5 d 觀測嫁接口愈合情況，統(tǒng)計砧穗結(jié)合部位產(chǎn)生瘤狀愈傷組織的接穗數(shù)量。愈傷組織形成率=愈傷組織形成數(shù)/嫁接數(shù)×100%。

1.4.2 成活率和抽梢率調(diào)查

嫁接50 d 后調(diào)查嫁接成活率和抽梢率。接穗芽眼仍然青綠則視為嫁接成活，芽眼發(fā)黑干枯則為嫁接失敗。成活率=成活數(shù)/嫁接數(shù)×100%。芽眼萌動且新梢長度大于2 cm 視為抽梢，抽梢 率=抽梢數(shù)/嫁接數(shù)×100%。

1.4.3 枝條生長量測量

嫁接60、120 d 后調(diào)查新梢生長量，新梢長度采用卷尺測量，新梢直徑采用游標(biāo)卡尺測量。

1.4.4 生理生化指標(biāo)測定

嫁接65 d 后，將各處理已抽梢的枝條隨機(jī)剪取10 枝，每枝條選取3 片葉，用剪刀剪下，放入塑料袋內(nèi)，并立即裝入冰盒中，帶回實驗室后置于超低溫冰箱中保存，用于各生理生化指標(biāo)的測定?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G-250 染色法測定?？扇苄蕴呛坎捎幂焱壬y定。葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用硝基四唑藍(lán)還原法，過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用過氧化氫法[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對嫁接成活和抽梢的影響

通過試驗發(fā)現(xiàn)，使用不同種類和濃度的激素采用不同方式處理接穗對嫁接成活率及抽梢率影響較大。使用激素處理接穗后的嫁接成活情況見表2。由表2 可知，處理1、2、5、8 的成活率和抽梢率均高于對照，其中處理1 的效果最好，成活率比對照高12.22 百分點，抽梢率比對照高26.67 百分點。從K值來看，10 組處理對嫁接成活率和抽梢率的影響一致，最佳組合為A1B1C1（用50 mg/L NAA 速蘸接穗），與試驗結(jié)果相符。通過R值可以看出，對接穗成活及抽梢影響最大的是因素B（激素濃度），其次為因素C（處理方式）。從試驗結(jié)果來看，選用的3 種激素均可在一定程度上促進(jìn)嫁接成活及抽梢，但不同激素的最適應(yīng)用濃度不同。本試驗中結(jié)果表明，50 mg/L GA3對油茶嫁接具有促進(jìn)作用，作用效果僅次于50 mg/L NAA，成活率為93.33%，抽梢率為80.56%，與唐輝等[14]發(fā)現(xiàn)GA3對銀杏嫁接成活具有抑制作用的試驗結(jié)論不同。但250 mg/L GA3處理接穗對嫁接成活抑制作用明顯，嫁接成活率比對照低43.34 百分點，抽梢率比對照低48.88 百分點?？梢姴煌瑵舛鹊腉A3處理對油茶嫁接的影響也不同。對因素C（處理方式）的試驗結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗 （表3），C1與C2的嫁接成活率和抽梢率差異達(dá)極顯著水平，C2與C3僅成活率有顯著差異，因此在使用激素處理接穗時，時間不宜過長，速蘸1 ～ 2 s 即可。

表2 以外源激素處理海南油茶接穗試驗的正交設(shè)計及嫁接成活和抽梢情況Table 2 Orthogonal design, grafting survival and shooting status in the using exogenous hormone treat C.hainanica scions test

表3 C 因素各水平海南油茶嫁接成活率和抽梢率的差異顯著性比較?Table 3 Signifciance comparison of differences between grafting survival rates and shooting rates in C.hainanica at each level of C-factor

2.2 不同處理對嫁接口愈合情況的影響

不同處理對油茶嫁接愈合過程中愈傷組織的形成影響顯著（圖1）。除處理7 外，其他處理均在嫁接10 d 時開始愈合，至嫁接40 d 時愈傷組織形成率達(dá)到最大。其中，處理1、2、4、5、8 的愈傷組織形成率高于對照，處理1（50 mg/L NAA速蘸）的效果最好，嫁接40 d 時愈傷組織形成率為97.89%，比對照高10.11 百分點?？赡苁怯捎贜AA 通過抑制隔離層的形成并促進(jìn)形成層活動，促使細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，從而加快砧穗愈合速度，加快了愈傷組織的形成[15]。處理7（250 mg/L GA3噴施）的效果最差，愈傷形成率僅為46.67%，比對照低41.11 百分點，可見高濃度的GA3處理對嫁接口愈傷組織的形成具有一定的抑制作用。

圖1 不同處理對海南油茶嫁接口愈傷組織形成的影響Fig.1 Effect of different treatments on interface callus formation in C.hainanica

2.3 不同處理對枝條生長量的影響

分別在嫁接60、120 d 時測量枝條生長量，發(fā)現(xiàn)不同處理的枝條生長量存在顯著差異（表4）。處理1、8 的枝條生長量顯著高于CK，其中處 理1（50 mg/L NAA 速蘸）的枝條生長量最大，嫁接60 d 時的枝條長度為12.51 cm，直徑為 3.30 mm；嫁接120 d 時的枝條長度為64.56 cm，直徑為6.35 mm。處理2、4、5、6、9 與CK 差異不顯著，處理3（250 mg/L NAA 浸泡）和處理7 （250 mg/L GA3噴施）的枝條生長量顯著低于CK，其中處理7 的枝條生長量最小，嫁接60 d 時的枝條長度為4.03 cm，直徑為1.90 mm；嫁接 120 d 時的枝條長度為23.16 cm，直徑為4.35 mm。

2.4 不同處理對葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

可溶性糖和可溶性蛋白是葉片光合作用的主要產(chǎn)物。使用不同濃度外源激素處理接穗，對接穗新梢葉片的可溶性蛋白和可溶性糖含量有顯著影響，不同處理對葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量影響不同（表5）。處理1、4、5、6、8 的葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量較CK 均有顯著提高。其中處理1（50 mg/L NAA 速蘸）的效果最好，葉片可溶性蛋白含量為15.26 μg/g，較CK 提高30.09%，可溶性糖含量為15.85%，較CK 提高29.07%。處理2、7、9 的葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量均低于CK，其中處理7（250 mg/L GA3噴施）的葉片可溶性蛋白含量最低，較CK 降低19.86%；處理9（150 mg/L GA3速蘸）的葉片可溶性糖含量最低，較CK 降低26.55%。

表4 不同處理對油茶新梢生長量的影響Table 4 Effect of different treatments on new shoot increment in C.hainanica

表5 不同處理對海南油茶葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Table 5 Effect of different treatments on contents of soluble protein and soluble sugar in C.hainanica leaves

2.5 不同處理對葉片保護(hù)酶活性的影響

在植物嫁接愈合過程中，植物激素通過影響砧穗的生理生化性質(zhì)以及組織結(jié)構(gòu)分化等，影響砧穗間的嫁接親合性，SOD、CAT、POD 活性是衡量植物抗性的主要指標(biāo)[16]。在對接穗新梢葉片進(jìn)行理化性質(zhì)分析后發(fā)現(xiàn)，不同處理對葉片酶活性的影響不同（表6）。枝條生長量得以提高的處理中，葉片保護(hù)酶的活性較CK 有顯著提高。處理1（50 mg/L NAA 速蘸）中葉片3 種保護(hù)酶活性最高，較CK 分別提高153.14%、78.63%、43.99%。使得POD 活性增加的為處理1、2、4、5、8；使得SOD 酶活性增加的為處理1、2、4、5、6、8；使得CAT 酶活性增加的為處理1、2、4、5、6、8。說明適當(dāng)濃度的外源激素的使用提高了油茶嫁接后的生理抗性，為枝條的生長提供了有利條件。處理3（250 mg/L NAA 浸泡）、處理7（250 mg/L GA3噴施）、處理9（150 mg/L GA3速蘸）的葉片保護(hù)酶活性均較CK 顯著降低。

表6 不同處理對油茶葉片保護(hù)酶活性的影響Table 6 Effects of different treatments on activities of protective enzymes in C.hainanica leaves

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明：使用適當(dāng)濃度的外源激素處理接穗后再進(jìn)行嫁接，有效提高了嫁接成活率和抽梢率，并促進(jìn)枝條生長。在使用外源激素處理接穗時，處理時間不宜過長，速蘸1 ～2 s 即可，接后噴施和浸泡15 min 的效果不明顯。采用50 mg/L NAA 處理接穗的效果最好，其次為50 mg/L GA3和250 mg/L IAA；50 mg/L NAA 處理接穗且嫁接60 d 時，其枝條長度為12.51 cm，直徑為 3.30 mm；嫁接120 d 時枝條長度為64.56 cm，直徑為6.35 mm，顯著高于對照。高濃度的GA3處理接穗后對嫁接成活和新梢生長具有明顯的抑制作用。通過對新梢葉片進(jìn)行理化性質(zhì)分析后發(fā)現(xiàn)，不同處理對葉片的影響不同，枝條生長量得以提高的處理，其葉片可溶性蛋白和可溶性糖的含量及3 種保護(hù)酶的活性較CK 有顯著提高。由于外源激素的使用直接促進(jìn)了愈傷組織的形成，使砧穗連接的維管束形成時間縮短，較未采取處理的對照組愈合快、成活早，對枝條生長具有前期優(yōu)勢，同時外源激素的應(yīng)用對植株內(nèi)源激素也有一定的誘導(dǎo)作用，在一定時間內(nèi)可促進(jìn)砧穗的物質(zhì)交流和營養(yǎng)運輸，使嫁接苗生長速度加快[17]。

愈傷組織的形成是植物嫁接成活的關(guān)鍵，而嫁接口愈傷組織的形成受到多種因素的影響[18]。在生產(chǎn)中使用生長調(diào)節(jié)劑來處理葡萄、蘋果、核桃等的接穗或砧木，均有促進(jìn)愈合的作用[19-21]。 傅遠(yuǎn)志等[22]在水杉異砧嫁接中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源激素GA3的含量有顯著的峰值。還有研究指出，用IAA 和KT 的混合物處理接穗，可以促進(jìn)形成層活動，產(chǎn)生大量愈傷組織，形成維管束橋[23]。周乃富等[24]使用石蠟切片技術(shù)觀察核桃嫁接愈合過程，發(fā)現(xiàn)愈傷組織依次分化形成導(dǎo)管和形成層，并由新形成層進(jìn)一步分化產(chǎn)生木質(zhì)部組織來完成砧穗維管組織的連通，愈合時間短，嫁接成活率高。

在本研究中，使用適宜濃度的外源激素處理接穗后，對嫁接口愈傷組織的形成起到了一定的促進(jìn)作用，這可能是由于NAA、IAA、GA3有利于細(xì)胞的生長，促進(jìn)了形成層細(xì)胞的活化，增加了植體內(nèi)多種酶的活性，促進(jìn)接口周圍的細(xì)胞快速生長和分裂，從而加快愈傷組織的形成[25]。使用高濃度的IAA 處理接穗取得了較好的效果，可能是由于促進(jìn)了乙烯含量的增加，從而提高萌芽力和嫁接成活率。高濃度的GA3抑制維管束的形成。本試驗結(jié)果表明，250 mg/L GA3處理油茶接穗后嫁接成活率比對照低43.34 百分點，抽梢率比對照低48.88 百分點，驗證了其對油茶嫁接親合性有一定的抑制作用。相關(guān)研究結(jié)果表明，使用低濃度GA3處理接穗對嫁接成活及枝條生長有較好的促進(jìn)作用，高濃度處理有抑制作用[26-27]，這與本研究中所得結(jié)論一 致。李瑞高[28]分別用1.0×10-4、2.0×10-4、3.0×10-4的萘乙酸浸泡枝條基部24 h 后進(jìn)行嫁接，對嫁接成活率沒有影響，與本試驗中所得結(jié)果有所不同，這可能與處理方式和處理時間有關(guān)。

崔克明[29]通過試驗證明，5 類植物激素（生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯）均參與了形成層通過平周分裂或斜向橫分裂增加自身和向內(nèi)形成木質(zhì)部、向外形成韌皮部的過程。盧善發(fā)等[30]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物激素通過影響砧木和接穗間維管束橋形成的時間和數(shù)目來調(diào)控嫁接體的發(fā)育，參與接穗和砧木間愈傷組織的產(chǎn)生和維管束橋的分化等。

通過試驗可以證明，合理使用外源激素能影響嫁接親和力，從而提高接口愈合速度和枝條生長量。外源激素在油茶大樹嫁接方面的應(yīng)用較少，在生長過程中植株的生理生化變化以及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。