α6/α3β2β3乙酰膽堿受體在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的表達(dá)及其條件優(yōu)化

施西子， 毛楷林， 朱曉鵬， 長孫東亭， 羅素蘭

(海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院， ?？?570228)

煙堿型乙酰膽堿受體( Nicotinic acetylcholine receptor, nAChRs)是一類重要的配體門控離子通道，它們廣泛存在于動(dòng)物與人體內(nèi)，具有重要的生理功能和臨床意義[1]. 按其組織分布及功能可分為兩大類：一類是遍及外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)的神經(jīng)元受體，它們參與快速突觸傳遞. 另一類是介導(dǎo)神經(jīng)肌肉傳遞并位于神經(jīng)-肌肉接頭處的肌肉型受體. nAChRs是五聚體跨膜蛋白，由5個(gè)相同或不同的亞基互相組合形成功能各異的不同亞型. 目前，已發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)型亞基包括α(2～10)和β(2～4)，共12種[2]. 這些亞基可以形成同型五聚體和異型五聚體. 同型五聚體由5個(gè)相同的α亞基構(gòu)成，而異型五聚體為α亞基與β亞基等共同組合而成[3]. 各個(gè)亞型的結(jié)構(gòu)非常相似，但它們的生理學(xué)和藥理學(xué)功能卻截然不同. 因此，急需發(fā)現(xiàn)能區(qū)分各個(gè)亞型的高選擇性分子探針或工具藥. 每個(gè)亞型的高選擇性阻斷劑或激動(dòng)劑(配體)將有可能直接開發(fā)為與之相關(guān)的某種疾病的治療藥物. 建立nAChRs各個(gè)亞型的體外表達(dá)技術(shù)體系和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，對于受體功能的研究與新型藥物的篩選至關(guān)重要.

α6是nAChRs中的一類重要亞基，它在高等動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的幾個(gè)重要區(qū)域都有表達(dá)，包括下丘腦和上丘、視神經(jīng)、內(nèi)側(cè)韁核、腹側(cè)膝狀體、紋狀體、椎弓根間核和脊髓背角等[4-8]. α6亞基所組成的亞型在調(diào)節(jié)紋狀體多巴胺釋放中起關(guān)鍵作用[9-10]，并與基底神經(jīng)節(jié)相關(guān)疾病，如：成癮、帕金森綜合征等有關(guān)[11-12]. 目前，α6亞基參與組成的2種重要亞型分別是α6β2β3和α6β4. α6β2β3受體的天然存在區(qū)域非常局限，因?yàn)檫@些受體僅在非常有限的大腦區(qū)域中以低水平表達(dá)，并且α6β2*表達(dá)始終伴有大量其他nAChR亞型的表達(dá)并被遮蓋，與此同時(shí)，α6β2β3在體外也難于表達(dá). 而α6亞基與α3亞基具有高度的同源性，特別是胞外配體結(jié)合區(qū)域，發(fā)現(xiàn)特異作用于α6β2*并能區(qū)分其他亞型、特別是能區(qū)分α6β2*與α3β2*的配體和先導(dǎo)藥物，對于研究相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和治療新藥的研發(fā)至關(guān)重要. 在體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，為了提高α6β2*的表達(dá)，研究者利用嵌合體技術(shù)構(gòu)建了α6/α3亞基，建立了α6/α3β2β3(簡寫為α6β2*，*代表其他亞基)亞型的體外表達(dá)模型[13],即方法主要利用α6亞基胞外配體結(jié)合區(qū)域與α3亞基的跨膜和胞內(nèi)部分形成的嵌合體α6/α3，在保留了α6亞基的配體結(jié)合域的同時(shí)，提高了受體的表達(dá). 雖然該方法實(shí)現(xiàn)了α6β2β3亞型的體外表達(dá)，但由于亞基存在不正確組裝、表達(dá)不穩(wěn)定和電流過小等因素，使得穩(wěn)定表達(dá)該模型仍面臨一些挑戰(zhàn)[14]，這也限制了基于該受體活性化合物的篩選等工作. 因此，本文擬對α6/α3β2β3 nAChRs亞型進(jìn)行體外重組表達(dá)研究，并對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

包含 nAChRs亞基 α6/α3、β2、β3基因的質(zhì)粒獲贈于美國猶他大學(xué)( Salk Institute，CA， USA); 大腸桿菌(E.coli)DH5α，本實(shí)驗(yàn)室保存; 雌性非洲爪蟾(Xenopuslaevis) 購自美國 eNaso公司，實(shí)驗(yàn)所用的爪蟾均已在(17±1)℃溫度下于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3月以上. 限制性內(nèi)切酶(SalⅠ、AflⅢ和NheⅠ)，MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0購于寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)、膠原酶、乙酰膽堿購于Sigma公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMESSAGE、mMACHINE T7 kit和MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit 購于美國Thermo Fisher Scientific公司；OR2 溶液(82.5 mmol/L NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2，5 mmol/L HEPES，pH 7.5); ND96 溶液(96 mmol/L NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2·6H2O，1.8 mmol/L CaCl2·2H2O， 5 mmol/L HEPES，pH 7.5);其他試劑與抗生素均為國產(chǎn)分析純試劑.

分光光度計(jì)(Bio-RAD Smart SpecTMPlus)、膜片鉗(Axon 900A，Molecular Devices, USA)、微電極拉制儀(P97, Sutter)、顯微注射儀(Nanoliter 2000, Sutter)、研究級體視顯微鏡(SZX-ILLD2-200,OLYMPUS)、恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱(KCL-2000A, EYELA)、小型水平電泳儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(ALPHA, Protein Simple)和灌流系統(tǒng)(ALA Corp.)等.

1.2 受體亞基質(zhì)粒的提取和酶切

包含鼠源(Rat, r)nAChRs亞基α6/α3、β2、β3基因的質(zhì)粒保存于E.coliDH5α菌株中. 菌種可放置于-80 ℃長期保存. 在提取質(zhì)粒之前，先將菌種活化后，接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)12 h后，用質(zhì)粒抽提試劑盒大量提取其質(zhì)粒. 將提取出的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶使其線性化[15]. 取1 μg質(zhì)粒DNA、2 μL 10×Enzyme Buffer、1 μL Enzyme以及適量滅菌ddH2O進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為20 μL. 不同亞基的限制性內(nèi)切酶見表1. 酶切完全后，利用MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作流程見試劑盒手冊，每次的DNA片段(50 bp～20 kb)純化量可達(dá)1.5～2.0 μg. 純化后產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外分光光度計(jì)測定線性化質(zhì)粒模板的濃度.

表1鼠源α6/α3、β2、β3nAChRs亞基質(zhì)粒對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶

Table1Therestrictionendonucleaseofplasmidwhichcontainedα6/α3,β2,β3nAChRssubtypes(rat)

包含的亞基質(zhì)粒載體啟動(dòng)子限制性內(nèi)切酶rα6/α3pT7TST7SalⅠrβ2pGEMHET7AflⅢrβ3pGEMHET7NheⅠ

注:r為大鼠(rat)來源.

1.3 cRNA的制備

以線性化的質(zhì)粒DNA作為模板，利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲取對應(yīng)亞基的cRNA. 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒存于-80 ℃，使用前需將試劑管取出并置于4 ℃冰上，將10× Reaction Buffer 放置于室溫下，待試劑完全溶解后，短暫離心以防試劑粘壁. 取無RNase離心管，依次將線性化質(zhì)粒DNA模板、10×Reaction Buffer、2×NTP /CAP、Enzyme Mix、無RNase ddH2O加入管內(nèi)，徹底混勻后短暫離心，密封離心管，將其置于37 ℃水浴鍋，反應(yīng)1～6 h(不同基因的反應(yīng)時(shí)長不等).

轉(zhuǎn)錄完成后，使用RNA純化試劑盒(MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit)對產(chǎn)物進(jìn)行純化. 具體操作見試劑盒手冊. 取2 μL 制得的cRNA于2%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，另取1 μL RNA用分光光度計(jì)測定其純度與質(zhì)量濃度，將制備所得的cRNA，稀釋分裝為0.3、0.5、0.8 μg/μL 3種規(guī)格，置于-80 °C 保存?zhèn)溆?

1.4 非洲爪蟾卵母細(xì)胞的獲取

取性成熟非洲爪蟾，置于冰上1 h左右麻醉后，解剖取其卵母細(xì)胞[16]. 將取出的卵母細(xì)胞團(tuán)塊置于OR2溶液中反復(fù)清洗，清洗過程中盡可能把卵細(xì)胞團(tuán)塊用機(jī)械力分開，清洗干凈的卵細(xì)胞加入至20 mL OR2溶液中，并加入稱好的20 mg 膠原酶進(jìn)行酶解. 酶解消化過程中，注意觀察細(xì)胞團(tuán)塊的消化程度，避免酶解過度使得蛙卵易破裂. 消化40 min～1 h后，用OR2溶液多次洗滌已經(jīng)酶解分開的單個(gè)卵母細(xì)胞，清洗到溶液不再渾濁為止. 選取黑白分明的單個(gè)蛙卵細(xì)胞，置于含抗生素(分別加入青霉素10 μg/mL、鏈霉素10 μg/mL、慶大霉素100 μg/mL )的ND96 溶液中培養(yǎng). 于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中17 ℃培養(yǎng)12 h后，選取生長狀態(tài)良好的蛙卵細(xì)胞進(jìn)行顯微注射.

1.5 顯微注射

使用硅酸鹽玻璃針(內(nèi)徑0.69 mm，外徑1.2 mm) 拉制玻璃電極和注射針. 注射針尖端拋光，直徑10～15 μm. 在注射針中灌入礦物油，將制得的各亞基的cRNA根據(jù)其質(zhì)量濃度進(jìn)行等量混合后，吸入注射針內(nèi)，再注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi). 如：各取1 μL質(zhì)量濃度為0.3 μg/μL的α6/α3、β2、β3亞基的cRNA以1∶1∶1的比例等量混勻，則1 μL的cRNA混合液中，每個(gè)亞基的質(zhì)量濃度為0.1 μg/μL. 依次類推，獲得單個(gè)亞基質(zhì)量濃度為0.10、0.17、0.27 μg/μL的cRNA注射液. 注射體積分為46.0、50.6、55.2 nL(顯微注射儀以2.3 nL為一個(gè)注射單位). 將注射后的蛙卵置于60 mm培養(yǎng)皿中，加入滅菌后含抗生素的ND96溶液，置于17 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng). 注意每天更換新鮮的含抗生素培養(yǎng)液. 培養(yǎng)3 d后，利用雙電極電壓鉗技術(shù)進(jìn)行檢測.

1.6 電生理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集

室溫條件下，吸取單個(gè)蛙卵置于細(xì)胞槽中(體積為50 μL)，灌流液ND96(含0.1 mg/mL BSA)，灌流速度2 mL/min. 電極針中灌滿3 mol/L KCl溶液，電阻在0.5～2.0 MΩ. 當(dāng)電極尖端進(jìn)入細(xì)胞槽液面后，在IC模式下，雙電極入液后，電壓調(diào)零. 調(diào)零后，將2個(gè)電極輕輕刺入卵母細(xì)胞，將程序轉(zhuǎn)換至TEVC模式，設(shè)置鉗制電壓為-70 mV，采樣頻率為Slow 100 Hz，F(xiàn)ilter 10 Hz[16]. 用Clamp 10.2軟件記錄下電流情況. 蛙卵在1 min的記錄時(shí)間內(nèi)，給予2 s的ACh(100 μmol/L)激活，檢測通道的表達(dá)情況. 記錄時(shí)，一組數(shù)據(jù)包含3個(gè)連續(xù)的灌流，每個(gè)灌流時(shí)長為1 min. 每個(gè)灌流起始時(shí)，給予2 s的ACh(100 μmol/L)激活，記錄誘導(dǎo)電流的表達(dá)情況. 電流穩(wěn)定后，用α6/α3β2β3 nAChRs專一性拮抗劑α-芋螺毒素TxIB檢測受體表達(dá)情況. 將5 μL(濃度為10-5mol/L)TxIB加入到容量為50 μL的細(xì)胞槽中，孵育5 min，記錄給藥后電流值，給藥前后電流值的比值即為該受體亞型下α-芋螺毒素的阻斷率.

ACh 誘發(fā)的內(nèi)向電流為3～6個(gè)蛙卵所記錄的平均值，利用 Clampfit 10.2 軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，利用 Graphpad Prism 軟件對結(jié)果進(jìn)行作圖，以最高濃度1 000 μmol/L的ACh激活通道開放的電流為分母，計(jì)算不同 ACh 濃度對應(yīng)的反應(yīng)率，即 Response(%). 將各濃度下的反應(yīng)率(Response，%)輸入 Graphpad Prism 軟件進(jìn)行作圖[15].

1.7 條件優(yōu)化設(shè)置

為找到α6/α3β2β3 nAChRs的最優(yōu)表達(dá)條件，本研究將從蛙卵團(tuán)塊酶解時(shí)間、注射單個(gè)亞基cRNA的質(zhì)量濃度與單次cRNA注射總體積、ACh 濃度這幾個(gè)方面來進(jìn)行比較. 蛙卵細(xì)胞酶解時(shí)間分別為45、50、55 min；單個(gè)亞基cRNA注射的質(zhì)量濃度分別為0.10、0.17、0.27 μg/μL；注射cRNA總體積分別為46.0、50.6、55.2 nL；ACh 濃度分別為0、10、50、100、200、500、1 000 μmol/L.

2 結(jié)果與分析

2.1 nAChR亞基質(zhì)粒的制備和酶切

提取的 α6/α3、β2、β3亞基基因質(zhì)粒于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒純度，結(jié)果如圖 1 所示，M泳道是DNA maker DL 10 000，泳道1、2分別為rα6/α3 酶切前與酶切后，泳道3、4分別為rβ2酶切前與酶切后，泳道5、6分別為rβ3 酶切前與酶切后. 圖1可見：泳道1、3、5的質(zhì)粒純度高，完整性好，適合進(jìn)一步酶切線性化. 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度均在0.30 μg/μL以上(表2). 圖1中泳道2、4、6為質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的純度檢測，可見環(huán)狀質(zhì)粒已經(jīng)完全線性化，只顯示了一條清晰的DNA條帶，未見其他雜質(zhì). 與環(huán)狀質(zhì)粒的條帶進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)線性化后的DNA具有明顯滯后性，且線性化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度約為0.20～0.30 μg/μL (表2).

2.2 cRNA的制備和檢測

體外轉(zhuǎn)錄完成后的純化產(chǎn)物，取樣2 μL于2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測制備所得cRNA的純度，結(jié)果如圖2所示，其中泳道M為DNA marker DL 15 000，泳道1～3分別為α6/α3、β2、β3的cRNA. 經(jīng)測定，3種亞基α6/α3、β2、β3的cRNA質(zhì)量濃度分別為0.88、0.83、0.92 μg/μL(表2). 制備所得的各亞基cRNA分別分裝為0.3、0.5、0.8 μg/μL 3種規(guī)格，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?

M: DNA Marker DL 10 000; 1: rα6/α3 質(zhì)粒; 2: rα6/α3 質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶切后; 3: rβ2 質(zhì)粒; 4: rβ2 質(zhì)粒經(jīng)AflⅢ酶切后; 5： rβ3 質(zhì)粒; 6：rβ3 質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ酶切后

圖1 含有nAChRs亞基基因的質(zhì)粒及其酶切線性化產(chǎn)物的電泳圖

Figure 1 The agarose gel electrophoresis of nAChRs plasmids and their linearized DNA

表2 nAChRs亞基r α6/α3、r β2、r β3 基因的質(zhì)粒、線性化 DNA 和體外轉(zhuǎn)錄 cRNA的質(zhì)量濃度Table 2 The concentration of nAChRs subunit α6/α3, β2 and β3 plasmid, linearized DNA and cRNA

M:DNA Marker DL 15 000;1:rα6/α3 cRNA;2:rβ2 cRNA;3:rβ3 cRNA

Figure 2 The agarose gel electrophoresis of rα6/α3, rβ2 and rβ3 cRNA

2.3 非洲爪蟾卵母細(xì)胞的篩選

對比蛙卵團(tuán)塊的不同酶解時(shí)間可發(fā)現(xiàn)(圖3)，以50 min 左右的酶解效果最佳，此時(shí)的蛙卵顆粒顏色鮮亮，彈性良好且多為單個(gè)的游離狀，蛙卵表面無附著卵巢膜與濾泡膜(圖3A). 酶解時(shí)間為45 min時(shí)出現(xiàn)團(tuán)塊狀的卵母細(xì)胞，蛙卵黏連在一起，蛙卵外部包裹的透明部分是未能完全去除的卵巢膜與濾泡膜(圖3B). 酶解時(shí)間55 min時(shí)，蛙卵過度酶解，雖然無黏連與薄膜，但細(xì)胞膜變軟失去彈性(圖3C). 蛙卵的質(zhì)量對α6/α3β2β3 nAChRs 的表達(dá)有較大影響，宜選用兩極分明的成熟蛙卵(圖3D)，注射時(shí)挑選酶解50 min的蛙卵來滿足實(shí)驗(yàn)條件的要求.

2.4 α6/α3β2β3 nAChRs亞型表達(dá)檢測

使用等比混勻后的cRNA注射，單個(gè)亞基的質(zhì)量濃度分別為0.10、0.17、0.27 μg/μL，注射體積分別選擇46.0、50.6、55.2 nL，比較單個(gè)亞基cRNA質(zhì)量濃度和單次注射總體積對電流表達(dá)情況的影響，結(jié)果如圖4A. 從圖4A可見:當(dāng)cRNA質(zhì)量濃度為0.10 μg/μL時(shí)，3種注射體積下的蛙卵均不能表達(dá)受體；cRNA質(zhì)量濃度為0.17 μg/μL時(shí)，只有注射體積大于50.6 nL時(shí)部分蛙卵可檢測到少量電流，此時(shí)單個(gè)蛙卵內(nèi)單個(gè)亞基的cRNA注射量為8.4 ng；當(dāng)注射質(zhì)量濃度為0.27 μg/μL時(shí)，3種注射體積下均可以表達(dá)受體，此質(zhì)量濃度下,單個(gè)蛙卵內(nèi)每種亞基的cRNA注射量分別為12.27、13.49、14.72 ng. 當(dāng)質(zhì)量濃度為0.27 μg/μL、注射體積為55.2 nL時(shí)，表達(dá)受體的情況最佳.

ACh激活α6/α3β2β3 nAChRs的劑量效應(yīng)曲線顯示(圖4B)：ACh的半最大效應(yīng)濃度(Concentration for 50% of Maximal Effect, EC50)為100 μmol/L左右. 注射質(zhì)量濃度與體積優(yōu)化前的蛙卵，電流普遍較小(圖4C)，而優(yōu)化后，蛙卵的電流明顯增加，較優(yōu)化前提升了近6倍，200 μmol/L ACh作用下的電流最高可達(dá)600 nA左右(圖4D)，更高濃度的ACh(1 000 μmol/L)激活受體產(chǎn)生的電流最高可達(dá)800 nA，但受體易脫敏.

圖3 非洲爪蟾卵母細(xì)胞的酶解效果圖

圖4 單亞基 cRNA質(zhì)量濃度、注射體積和ACh濃度對α6/α3β2β3受體電流表達(dá)的影響

Figure 4 The effect of cRNA concentration (single subunit), injection volume and ACh concentration on the current of α6 / α3β2β3 receptor

成功表達(dá)α6/α3β2β3亞型后，利用α6/α3β2β3亞型專一的拮抗劑α-芋螺毒素 TxIB[17]進(jìn)行了受體敏感性的檢測，圖5A為ND96對照組. 結(jié)果(圖 5B)顯示：1 μmol/L TxIB對α6/α3β2β3 亞型的阻斷率約為14%，且洗脫速度快，與文獻(xiàn)[17]中的結(jié)果一致，說明受體具有良好的生理功能與敏感性.

圖5 α-芋螺毒素 TxIB對α6/α3β2β3 nAChRs 的阻斷情況

注:箭頭所指為藥物阻斷后電流.

3 討論

煙堿乙酰膽堿受體作為一類重要的配體門控離子通道，廣泛分布于肌肉、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，可參與調(diào)節(jié)生物體一系列的生理功能，如學(xué)習(xí)、記憶、應(yīng)答、鎮(zhèn)痛、興奮和睡眠等[18]. 其各種亞型已作為相關(guān)疾病治療新藥研發(fā)的重要靶點(diǎn)[19-21]. 為了研究nAChRs結(jié)構(gòu)與功能以及其體外活性表達(dá)，目前國內(nèi)外大都采用非洲爪蟾卵母細(xì)胞作為外源受體和通道蛋白的表達(dá)系統(tǒng)[22-23]，并結(jié)合顯微注射技術(shù)和雙電極電壓鉗技術(shù)檢測受體的體外表達(dá)情況. 現(xiàn)已成功在體外表達(dá)了α3β2 nAChRs[15]、α4β2 nAChRs[24]和α7 nAChRs[16]等多種乙酰膽堿受體. α6β2β3作為nAChRs中重要的一種亞型，在神經(jīng)生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，也是藥理學(xué)研究和藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn). 但作為體外較難表達(dá)的一種受體亞型，α6β2β3一直存在體外表達(dá)率低且表達(dá)電流小等諸多問題，尚無對其表達(dá)優(yōu)化的相關(guān)研究.

含α6 亞基的nAChRs 與許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，其主要表達(dá)于與獎(jiǎng)懲途徑和運(yùn)動(dòng)行為有關(guān)的多巴胺能神經(jīng)元以及于去甲腎上腺素能神經(jīng)元、視覺系統(tǒng)和其他一些區(qū)域[14]. α6亞基的組裝模式多變且復(fù)雜，故在最早期的嘗試中、異源系統(tǒng)的表達(dá)只能進(jìn)行簡單的亞基組合，而這樣的受體在體外表達(dá)時(shí)通常表達(dá)量較低且?guī)缀鯖]有功能活性[25]. 為了增加功能性表達(dá)，后來的研究利用α6/α3嵌合亞基成功實(shí)現(xiàn)了與β2、β3的共表達(dá)，所形成的α6/α3β2β3受體與天然受體具有相似的結(jié)合活性，可以作為體外藥物篩選的模型[13,26].

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，期望在非洲爪蟾卵母細(xì)胞建立穩(wěn)定高表達(dá)的α6/α3β2β3 nAChRs受體模型. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對于α6/α3β2β3 nAChRs表達(dá)起決定性的因素是卵母細(xì)胞的酶解過程與cRNA的注射量. 酶解時(shí)間直接影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量，當(dāng)酶解不完全時(shí)，細(xì)胞表面黏連的卵膜會影響cRNA注射，且殘留的卵膜會影響電流檢測，細(xì)胞膜上表達(dá)的受體通道蛋白與ACh 并未完全接觸，這是導(dǎo)致檢測電流小的原因之一；而當(dāng)酶解過度時(shí)，外觀上蛙卵細(xì)胞無殘留的卵膜，但在cRNA注射時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜失去彈性，注射過后大量細(xì)胞內(nèi)容物由注射孔流出，蛙卵細(xì)胞存活時(shí)間普遍較短；酶解時(shí)間控制在50 min左右時(shí)，蛙卵細(xì)胞分散度高，死亡細(xì)胞較少，細(xì)胞膜彈性佳，利于后續(xù)的受體表達(dá).

優(yōu)化cRNA注射體積發(fā)現(xiàn)，cRNA質(zhì)量濃度高且注射體積大更有利于受體的表達(dá)，隨著注射體積增大，也會影響蛙卵細(xì)胞內(nèi)外壓力，造成蛙卵細(xì)胞破裂. 因此，注射體積不可過度增加，控制在55.2 nL以內(nèi)較適宜.

每個(gè)亞基的注射量是影響受體表達(dá)的關(guān)鍵因素，每顆蛙卵內(nèi)單個(gè)亞基cRNA的注射量超過8.4 ng時(shí)，蛙卵即可表達(dá)出受體，但電流很小. 由于α6/α3β2β3 nAChRs五聚體的組裝模式為(α6/α3)2(β2)2β3，因此，提升單個(gè)亞基cRNA的注射量是有效提高表達(dá)的措施. 當(dāng)單個(gè)亞基cRNA的注射量達(dá)到13.5 ng及以上時(shí)，蛙卵已經(jīng)可以穩(wěn)定表達(dá)α6/α3β2β3 nAChRs，且電流值較大，易于檢測. 需注意的是，非洲爪蟾卵母細(xì)胞的質(zhì)量與其本身生長發(fā)育和健康狀況密切相關(guān)，蛙卵能承受的注射體積也會有差別，因此實(shí)驗(yàn)過程中宜針對實(shí)際情況進(jìn)行微調(diào)以達(dá)到最佳效果，確保單個(gè)蛙卵內(nèi)單個(gè)亞基的cRNA注射量在13.5 ng以上即可.

檢測電流時(shí)，ACh濃度對電流大小產(chǎn)生直接的影響，濃度過低時(shí)無法有效激活通道產(chǎn)生穩(wěn)定電流；而濃度太大時(shí)，雖可以產(chǎn)生大電流，但會使通道因?yàn)檫^度開放而失活脫敏，不利于目標(biāo)化合物的篩選. 為了模擬體內(nèi)正常的生理過程，且保證有效激活α6/α3β2β3 nAChRs通道開放，在體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用ACh的濃度為100 μmol/L，較α9α10 nAChRs亞型(10 μmol/L)的ACh誘導(dǎo)濃度高了10倍[27]，與α3β2 nAChRs 亞型的誘導(dǎo)濃度(50～200 μmol/L ACh)基本一致[15]. 此外，本實(shí)驗(yàn)cRNA注射體積控制在55.2 nL為最佳，這與房立叢等[16]體外表達(dá)α7 nAChRs亞基的結(jié)果不一致，在表達(dá)α7 nAChRs 亞基時(shí)，cRNA在3種注射劑量(41.4、50.6、60.9 nL)均表達(dá)出受體，但以41.4 nL注射量下的卵母細(xì)胞表現(xiàn)最佳，且存活時(shí)間最長；而注射量為50.6、60.9 nL時(shí)，分別會出現(xiàn)不同程度的卵細(xì)胞破損而影響α7 nAChRs亞基的表達(dá)水平[16]. 而這種差異的產(chǎn)生可能與蛙卵的大小與質(zhì)量、受體亞基的類型或各自所用的cRNA純度或質(zhì)量濃度有關(guān)，有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

本研究成功地在非洲爪蟾卵母細(xì)胞上建立了α6/α3β2β3 亞型的表達(dá)模型，并對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化. 研究表明：爪蟾卵母細(xì)胞的最佳酶解時(shí)間為50 min 左右，以顯微注射單個(gè)亞基cRNA質(zhì)量濃度為0.27 μg/μL、注射體積為55.2 nL時(shí)，α6/α3β2β3 亞型在體外表達(dá)情況最佳. 為保證受體的良好表達(dá)，需保證每個(gè)蛙卵內(nèi)單個(gè)亞基的cRNA注射量大于13.5 ng. 選擇的檢測條件為100 μmol/L ACh，優(yōu)化后的α6/α3β2β3 亞型的表達(dá)率基本穩(wěn)定在85% ，電流可基本穩(wěn)定在300～400 nA左右，上陽性藥阻斷后易洗脫，可以用于后續(xù)的藥物篩選與分子探針的研究. α6/α3β2β3 nAChRs 體外表達(dá)模型的成功建立不僅為以后針對2種受體的區(qū)分提供研究的基礎(chǔ)，也為新藥篩選提供了有效的模型；所建立的實(shí)驗(yàn)方法也可以為其他未能表達(dá)的模型提供一個(gè)借鑒，具有重要的意義.