檸檬苦素抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移的作用及機制研究

劉伯霞， 申 琴， 焦海燕， 李 濤， 陳 靜

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤外科，銀川 750004）

胃癌是一種嚴重威脅人類生命的致死性疾病，全球每年約723000 人死于胃癌[1]。由于胃癌早期一般沒有明顯癥狀，胃癌被確診時通常已是晚期，并伴有肝、肺、腹膜和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。一旦形成遠處轉(zhuǎn)移灶，患者5 年生存率下降到10%以下，中位生存期為9～10 個月[2]。目前，手術(shù)、放療以及化療是治療胃癌的主要手段，但由于晚期胃癌患者術(shù)后會出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)，提高患者總體生存率仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)[1]。因此，開發(fā)有效抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物顯得尤為迫切。有研究證實[3]，源于中草藥的單體和提取物不僅毒性小，且具有顯著的抗腫瘤效果，已成為目前抗癌藥物研究的熱點。2017 年歐洲科學家調(diào)查發(fā)現(xiàn)，柑橘屬水果，對消化系統(tǒng)和上呼吸道癌癥有很好的預防作用[4]。隨著柑橘綜合利用的深入，各種有效成分逐步被提取和分離出來，尤其以存在于桔皮及柚皮中檸檬苦素（limonin）在預防和控制腫瘤方面顯示良好的效果[5]。因其藥理作用強，毒性低，不良反應輕而受到越來越多學者的重視與青睞，但其對于胃癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用及相關(guān)信號通路和靶點的研究，國內(nèi)外鮮見報道。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）作為一種已知與癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的致癌轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化后與STAT 家族的其他成員形成同源二聚體或異二聚體。隨后，活化的STAT3 復合物易位到細胞核中，啟動STAT3 靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中就包括基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）[6]，而MMP-9 的表達與胃癌的惡性程度呈正相關(guān)[7]，提示MMP-9 是胃癌轉(zhuǎn)移過程中的一個重要因素。因此，本研究旨在初步探討檸檬苦素抑制胃癌細胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的作用以及與STAT3/MMP-9 信號通路的相關(guān)性，以便為闡明檸檬苦素的抗癌新功能和抗腫瘤新機制以及研發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的腫瘤生物治療藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS 公司），PCR 儀（Bio-Rad 公司），SDSPAGE 電泳設(shè)備（Bio-Rad 公司），低溫離心機（4 ℃）（Eppendorf 公司），全波長酶標儀（Thermo Fisher

公司）。

1.1.2 細胞 人源的胃癌細胞（BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS）均受贈于上海華東師范大學生科實驗室。

1.1.3 試劑及抗體 RPMI 1640 培養(yǎng)基（Multi－Cell Technologies 公司），DMEM 培養(yǎng)基（MULTICELL 公司），胎牛血清（MultiCell Technologies 公司），0.25%Trypsin-EDTA（1X）（Gibco 公司），icro BCATMProtein Assay Kit（Thermo Fisher 公司），TRIzol（Life Technologies 公司），RecertAid First Strand cDNA Synthesis Ki（tThermo Fisher 公司），CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega 公司），Rabbit mAb（Cell Signaling Technology 公司），Mouse mAb pTyr705-STAT3（D3A7）XP（Cell Signaling Technology 公司），GAPDH（北京中杉金橋公司），anti-CD31 antibody（Arigobio 公司），MMP-9（D603H）XPRabbit mAb（Cell Signaling Technology 公司）。

1.1.4 實驗動物 SPF 級6 周齡雌/雄性BALB/CA（nu/nu）裸鼠，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 MTS 增殖實驗檢測胃癌細胞存活率 取生長狀態(tài)良好的胃癌細胞株（BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803）用0.25%含EDTA 的胰酶消化處理后，以每孔4.5×104～5.0×104個細胞接入96 孔板。貼壁后進行不同濃度檸檬苦素（0、180、260、340、420、500 μmol·L-1）處理。干預72 h 后加入20 μL CellTiter 96AQueous One Solution 繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，使用酶標儀測該樣品在490 nm 處的光密度（OD）值，獨立重復實驗3 次。將未加藥孔作為空白對照組，加藥孔為實驗組，存活率（%）=（實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%，作圖，通過GraphPad Prism 進行IC50的計算。

1.2.2 劃痕愈合實驗方法檢測胃癌細胞遷移率 取對數(shù)生長期的胃癌細胞（BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803），用胰酶消化后分別接種在6 孔板中，當細胞密度達到95%時，用黃槍頭沿培養(yǎng)皿底部呈“一”字形劃痕，PBS 沖洗細胞3 次后，檸檬苦素（0、20、40、60 μmol·L-1）處理12～24 h，待對照組（0 μmol·L-1）劃線部分愈合后，4%多聚甲醛固定20 min 后拍照，觀察檸檬苦素對細胞遷移能力的影響。遷移率（%）=（實驗組遷移細胞數(shù)目/對照組遷移細胞數(shù)目）×100%，然后作圖。

1.2.3 裸鼠胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移模型 將生長狀態(tài)相似的健康BALB/CA（nu/nu）裸鼠［雌雄數(shù)量各半，體質(zhì)量（20±2）g］隨機分為空白對照組（無菌1×PBS）、檸檬苦素低劑量組（12.5 mg·kg-1）和檸檬苦素高劑量組（25 mg·kg-1），每組12 只。每只裸鼠腹腔注射給藥50 μL/次。提前連續(xù)給藥7 d后，將胃癌細胞BGC-823 株以每只裸鼠腹腔注射0.2 mL 細胞懸液（1×107個細胞）接種后，連續(xù)給藥至28 d。造模成功后，每7 d 每組隨機處死2 只裸鼠，取出肺、腸拍照觀察腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和體積變化，然后用4%多聚甲醛固定進行組織石蠟包埋和常規(guī)免疫組織化學染色。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測胃癌細胞中STAT3 磷酸化水平 胰酶處理收集經(jīng)檸檬苦素（0、20、40、60 μmol·L-1）處理后的胃癌細胞株BGC-823，用預冷PBS 清洗細胞3 遍，加入預冷RIPA 裂解細胞30 min 后，離心15 min 收集上清液，進行BCA 蛋白定量。使用5×還原型上樣緩沖液稀釋混勻，沸水煮10 min 后，SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，之后將蛋白轉(zhuǎn)運到PVDF 膜上，用5% BSA 封閉1 h 后，加入相應的一抗稀釋液4 ℃慢孵過夜后，二抗室溫孵育1～2 h，使用ECL 化學發(fā)光液曝光檢測pTyr705-STAT3、STAT3 和內(nèi)參的表達情況，利用Image J 軟件分析各條帶灰度值，相對表達強度=pTyr705-STAT3灰度值/ STAT3 條帶灰度值。

1.2.5 免疫組織化學方法檢測胃癌組織中pTyr705-STAT3 和MMP-9 表達水平 對石蠟包埋標本的5 μm 切片進行免疫組織化學染色，并用Ki-67，p-STAT3 和MMP-9 抗體進行染色。使用Leica 顯微鏡（Leica，DM4000b）拍照。200 倍顯微鏡下觀察到胞核內(nèi)有棕色顆粒者即為陽性細胞，每個樣本隨機選取10 個視野，通過Image J 軟件進行細胞計數(shù)，陽性表達率（%）=（陽性細胞數(shù)／全部細胞數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Dunnet-t檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 檸檬苦素對胃癌細胞增殖的影響

MTS 細胞增殖實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檸檬苦素在500 μmol·L-1濃度下對多種胃癌細胞增殖的半數(shù)抑制率不足50%（IC50），尤其對BGC-823 增殖的抑制率僅為7.47%。提示檸檬苦素對腫瘤細胞的增殖無抑制作用（圖1）。

2.2 檸檬苦素對胃癌細胞遷移的影響

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，在較低濃度下（40、60 μmol·L-1），檸檬苦素能抑制具有高遷移能力的多種胃癌細胞（BGC-823、SGC-7901、AGS 和MGC-803）向空白區(qū)域遷移，且在40 μmol·L-1濃度下抑制率高于50%（P<0.05），在60 μmol·L-1濃度下抑制率進一步增強，實驗組與對照組抑制率差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）（圖2）。

2.3 檸檬苦素對體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響

為了驗證檸檬苦素在體內(nèi)預防腫瘤和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，在建立裸鼠胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移模型之前，首先給予7 d 的檸檬苦素預處理。如圖3A 結(jié)果顯示，對照組中，裸鼠給藥處理后7 d 組與0 d 組比較，裸鼠各器官的顏色均無明顯差異；裸鼠給藥后14 d 組和21 d 組與7 d 組對比，腫瘤的數(shù)量和體積均明顯增加。加藥組中，檸檬苦素實驗組較對照組可顯著減少腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量以及腫瘤的體積，隨著檸檬苦素劑量的增加，腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和體積越來越少，肉眼下腸系膜上轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和體積變化顯著。從壁腹膜的局部圖能夠看出，21 d 時25 mg·kg-1檸檬苦素的劑量下，壁腹膜中的腫瘤數(shù)量和體積較對照組明顯減少（圖3B），且小鼠體質(zhì)量改變不明顯（圖3C），提示檸檬苦素在該劑量下對小鼠的毒性較小且能顯著抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

2.4 檸檬苦素對胃癌組織中p-STAT3、MMP-9、Ki-67 表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，0、12.5、25 mg·kg-1檸檬苦素實驗組中經(jīng)p-STAT3 染色后的陽性細胞數(shù)逐漸降低［（32.13±0.4787）%、（23.48±0.6455）%、（8.973±0.7071）%］，檸檬苦素實驗組與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.01），其下游MMP-9 的陽性率也明顯下降［（40.59±0.9129）%、（11.27±1.472）%、（7.353±1.780）%］，檸檬苦素實驗組與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.01），對細胞增殖相關(guān)因子Ki-67 無明顯影響（圖4），提示檸檬苦素抑制胃癌轉(zhuǎn)移可能是通過STAT3 介導的MMP-9 信號通路發(fā)揮生物學功能。

2.5 檸檬苦素對胃癌細胞中STAT3 磷酸化的影響

Western blot 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，在20、40、60 μmol·L-1的檸檬苦素作用下，均阻斷胃癌BGC-823 細胞磷酸化STAT3（Tyr705）的激活（P均<0.01），STAT3 總蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin的表達量不變（圖5）。

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。中國是全球胃癌發(fā)病率最高的國家之一。而腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)是有效和成功治愈癌癥的主要障礙，并且與多種癌癥的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)[8]。STAT3 是一種潛在的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，其在多種癌癥中被結(jié)構(gòu)性激活，并且在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。靶向STAT3 激活可以在不影響正常細胞的情況下，在體內(nèi)外抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，表明STAT3 可能是腫瘤治療的有效分子靶點[9]。因此，尋找合適的STAT3 抑制劑成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的重要策略。

從柑橘柚子類果核中提取的檸檬苦素，作為一類中草藥單體化合物，研究證實其具有顯著的抗腫瘤作用，能夠抑制肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的生長。Langeswaran 等[10]發(fā)現(xiàn)檸檬苦素主要通過穩(wěn)定Wnt 信號通路誘導HepG2 細胞凋亡，是一種對人類肝癌HepG2 細胞有效的抗增殖劑。Kim 等[11]發(fā)現(xiàn)柑橘類檸檬苦素類似物可能通過caspase-7 相關(guān)的通路預防ER-乳腺癌（MCF-7）。Somasundaram 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬苦素可能有益于乳腺癌患者的化療療效?？傊?，現(xiàn)有關(guān)于檸檬苦素抗癌活性已被逐漸證實，但是對于抗胃癌轉(zhuǎn)移的研究尚未報道[13]。本研究首次探討檸檬苦素與STAT3 信號通路之間的關(guān)系，并研究其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的效果及作用機制，從體內(nèi)和體外水平證實檸檬苦素作為STAT3 信號通路潛在的抑制劑，通過抑制STAT3 的活化從而達到抗胃癌轉(zhuǎn)移的作用。在體外的功能研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞（BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803）經(jīng)檸檬苦素處理后，顯著抑制細胞遷移能力，在40 μmol·L-1的低濃度下，對其增殖的影響微小，這也說明低濃度的檸檬苦素對細胞無毒性，提示檸檬苦素可能成為一種安全、經(jīng)濟的抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療藥物。鑒于檸檬苦素在許多類型的癌癥中具有降低風險的潛力，本研究提前7 d 腹腔注射檸檬苦素，結(jié)果表明檸檬苦素可以預防和治療胃癌的腹腔轉(zhuǎn)移。具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶數(shù)量的減少和體積的減小。且7 d 組解剖后與0 d 組解剖的結(jié)果對比，肉眼觀察小鼠各器官的色澤、大小、黏度均無明顯變化，提示該劑量下檸檬苦素對小鼠無明顯毒性。

MMP-9 與多種類型的實體瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)[14]，在檸檬苦素誘導的抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移的過程中起關(guān)鍵作用。本研究通過免疫組織化學染色證明，檸檬苦素處理顯著抑制了裸鼠胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶中MMP-9 的表達。MMP 能夠降解ECM 和基底膜的各種成分。一旦MMP-9 被激活，它能夠降解ECM 中的膠原蛋白，從而增加癌細胞的轉(zhuǎn)移[15]。因此，檸檬苦素對MMP-9 蛋白表達的抑制可能是檸檬苦素抑制胃癌轉(zhuǎn)移的重要機制之一。此外，檸檬苦素處理可抑制STAT3 的激活。STAT3 的異常激活與惡性腫瘤的進展密切相關(guān)[16]。因此，檸檬苦素抑制STAT3 激活可能會阻礙腫瘤的進展。此外，STAT3/MMP-9 途徑已被證明參與結(jié)腸癌細胞的侵襲[17]。本研究在胃癌細胞中獲得了類似的結(jié)果，提示STAT3/MMP-9 途徑可能介導檸檬苦素對胃癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。這表明檸檬苦素可以作為一種廣譜的STAT3抑制劑，本研究只對檸檬苦素與STAT3/MMP-9信號通路之間的聯(lián)系進行了研究，而關(guān)于檸檬苦素抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面可能還存在一些未知的機制，有待進一步的深入探究。

綜上，檸檬苦素能夠抑制多種胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，其機制可能是通過調(diào)控STAT3 介導的MMP-9 信號通路而發(fā)揮作用。本項目的理論成果進一步延伸性提示，檸檬苦素及其結(jié)構(gòu)衍生物可能是一類具有潛在低毒性的預防及抗癌藥物，因此，對檸檬苦素類似化合物進一步的開發(fā)具有重要的社會意義和潛在的經(jīng)濟價值。