遼藁本內(nèi)生細(xì)菌ZHAB63鑒定與拮抗菌篩選

張芳芳，田義新*，盧寶慧，王志清，劉桂英

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.白山市江源區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，吉林 白山 134700）

隨著中藥材市場(chǎng)需求擴(kuò)大，東北地區(qū)道地藥材如人參、細(xì)辛、刺五加、防風(fēng)、蒼術(shù)等人工栽培模式不斷完善，但植物病害成為阻礙中藥材健康生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素?；瘜W(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生環(huán)境污染，生物農(nóng)藥以其低毒高效無殘留且使用方便等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注，利用植物內(nèi)生細(xì)菌開發(fā)生物農(nóng)藥成為藥用植物病害防治研究熱點(diǎn)[1-2]，植物內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)期存活于健康植物組織內(nèi)部，可與宿主植物共生而不致其表現(xiàn)明顯病害癥狀[3]。

自20世紀(jì)90年代，Wei等首次提出“內(nèi)生細(xì)菌”概念后[4]，現(xiàn)已分離鑒定內(nèi)生細(xì)菌多達(dá)50余屬120余種[5-6]。其中，解淀粉芽孢桿菌可用于多種植物病害防治，效果較好[7-8]。植物內(nèi)生細(xì)菌作為一種寶貴資源，應(yīng)用前景廣闊[9]，但大部分植物組織中內(nèi)生細(xì)菌資源未被分離，仍處于空白階段，亟待深入研究。

遼藁本（Ligusticum jeholense Nakai et Kitag）是傘形科藁本屬草本植物，以干燥的根及根莖入藥，味辛，性溫，具有祛風(fēng)、散寒、止痛等功效[10]。主要分布在吉林、遼寧、河北等省，是我國(guó)東北地區(qū)常見道地藥材之一[11]。具有一定療效及藥用價(jià)值，但目前有關(guān)遼藁本研究主要集中于化學(xué)成分及生理生化方面[12-13]，遼藁本內(nèi)生細(xì)菌研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究以東北地區(qū)道地藥材遼藁本為試驗(yàn)材料，首次開展內(nèi)生細(xì)菌相關(guān)研究，從遼藁本2個(gè)吉林主產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)春、通化采集根及根莖部組織，分離內(nèi)生細(xì)菌，篩選高效抑制植物病原真菌內(nèi)生細(xì)菌，選取一株分離自遼藁本根部并表現(xiàn)較強(qiáng)拮抗作用ZHAB63菌株，對(duì)其作分子鑒定，優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，旨在填補(bǔ)東北道地藥材遼藁本內(nèi)生細(xì)菌研究領(lǐng)域空白，發(fā)掘廣譜性內(nèi)生細(xì)菌作為生物制劑開發(fā)原料，為遼藁本內(nèi)生細(xì)菌開發(fā)利用及生物防治新途徑探索提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

健康遼藁本植株分別于2018年6月采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物示范園、吉林省通化縣富江鄉(xiāng)富裕村種植基地，經(jīng)鑒定均為傘形科植物遼藁本（L.jeholense）。

1.1.2 供試病原菌

本研究所用人參病原菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，其他植物病原菌均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院提供。具體見表1。

表1 供試指示菌株Table 1 Tested indicator microbe

1.1.3 供試培養(yǎng)基

病原真菌由馬鈴薯葡萄糖（Potato dextrose agar）培養(yǎng)基保存[14]：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、無菌水1 000 mL；內(nèi)生細(xì)菌純化、培養(yǎng)為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NACl 5 g、瓊脂粉20 g、無菌水1 000 mL、pH 7.4～7.6；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、無菌水1 000 mL。培養(yǎng)基滅菌條件均為1×105Pa滅菌30 min。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌分離和純化

將新鮮遼藁樣本于流水下沖洗，除去表面泥沙及雜物，無菌紙吸干表面附水，挑選完好根及根莖切成約1.5 cm小段，先用75%乙醇試劑漂洗1 min，無菌水沖洗5次，再依次浸入0.1%HgCl2消毒試劑處理，無菌水沖洗5次。接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基28℃暗培養(yǎng)，15 d無污染后，除去外表皮，切成約0.5 cm小段，再接入新牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，每皿接入6個(gè)樣品，重復(fù)3次，28℃暗培養(yǎng)。取最后1次用于表面清洗的無菌水涂布在培養(yǎng)基平板上作為對(duì)照組，置于相同環(huán)境下，檢驗(yàn)消毒效果。對(duì)照組若無菌落生長(zhǎng)，表明遼藁本表面消毒徹底，同時(shí)獲得遼藁本內(nèi)生細(xì)菌。劃線法純化多次至單一菌種后，轉(zhuǎn)接至新牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面并編號(hào)，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)生細(xì)菌拮抗活性檢測(cè)

首先采用生長(zhǎng)速率法初篩，即在90 mm培養(yǎng)皿中倒入10 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，待溫度40℃左右每個(gè)培養(yǎng)皿倒入1 mL待測(cè)內(nèi)生細(xì)菌菌株發(fā)酵液（取一環(huán)菌體接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝液量為50 mL，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)，180 r·min-1搖菌2 d），混勻。待培養(yǎng)基凝固后，在中央放置直徑6 mm供試植物病原菌菌餅，28℃暗培養(yǎng)，每日定時(shí)觀察培養(yǎng)基中菌株生長(zhǎng)狀況及是否具有抑菌作用，將有拮抗效果菌株4℃斜面保存?zhèn)溆茫瑴?zhǔn)備復(fù)篩。復(fù)篩同樣利用生長(zhǎng)速率法（方法同初篩），對(duì)照組則以1 mL蒸餾水替代內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液混勻于培養(yǎng)基，當(dāng)對(duì)照組病原菌菌落直徑超過40 mm時(shí)，十字交叉法測(cè)量。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.4 菌株ZHAB63鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察

將待測(cè)菌株ZHAB63在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線，28℃培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色、透明度、干濕度等特征；采用革蘭氏染色法判斷是否為革蘭氏陽性菌。

1.4.2 分子鑒定

取一環(huán)ZHAB63菌體接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量為50 mL），于28℃恒溫、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)15 h，使菌液OD值為1～2，按照離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取ZHAB63內(nèi)生菌株DNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA是否提取成功。對(duì)其16SrDNA基因片段作PCR擴(kuò)增。引物由上海生物工程股份有限公司合成。序列如下：

正向引物27f：5'AGAGTTTGATCCTGGCTC AG 3'

反向引物1492r：5'GGTTACCTTGTTACGAC TT 3'

PCR擴(kuò)增體系為：Template（DNA模板）5 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL，27f和1492r引物均2.5 μL，加ddH2O 15 μL，使擴(kuò)增體系達(dá)50 μL。

PCR循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s（35個(gè)循環(huán)），55℃退火1 min（35個(gè)循環(huán)），72℃延伸90 s（35個(gè)循環(huán)），72℃修復(fù)延伸10 min，4℃復(fù)性（無限循環(huán)）直至終止反應(yīng)，

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得拼接序列用NCBI中Blast檢索，在核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析相近序列，MEGA7.0軟件分析，以Neigh?bor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)，作親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 拮抗菌ZHAB63發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 正交試驗(yàn)

以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為對(duì)照，采用單因素試驗(yàn)法分別研究不同碳源（葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉）、不同氮源（蛋白胨，酵母粉，氯化銨，硝酸銨）、不同無機(jī)鹽（氯化鈉，氯化鈣，硫酸鋅，硫酸銅，硫酸鎂）在其他條件不變情況下，測(cè)定ZHAB63菌株對(duì)細(xì)辛菌核病菌抑菌率，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)資料，選擇液體發(fā)酵培養(yǎng)基主要組成成分（A-蔗糖、B-酵母粉、C-蛋白胨、D-硫酸鎂）作正交試驗(yàn)，見表2，以確定最佳配方。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 2 L9 （34） orthogonal test factor level table

1.5.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

基于優(yōu)化的培養(yǎng)基，取分離純化后保存的內(nèi)生細(xì)菌ZHAB63，對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速和pH作單因素條件優(yōu)化，檢測(cè)菌株在不同培養(yǎng)條件下獲得發(fā)酵液抑菌效果。培養(yǎng)時(shí)間：設(shè)置12、24、36、48、60、72、84 h 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在pH為7，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)條件下，測(cè)定抑菌率，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間；培養(yǎng)溫度：設(shè)置26、27、28、29、30、31、32 ℃，在pH為7，180 r·min-1培養(yǎng)48 h，測(cè)定抑菌率，確定最適培養(yǎng)溫度；轉(zhuǎn)速：設(shè)置 160、170、180、190、200、210、220 r·min-1，在pH為7，28℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)定抑菌率，確定最佳轉(zhuǎn)速；pH：設(shè)置5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，測(cè)定抑菌率，確定最適pH。每組3次重復(fù)。測(cè)定不同培養(yǎng)條件下內(nèi)生細(xì)菌ZHAB63對(duì)細(xì)辛菌核病菌抑菌率，確定遼藁本根部?jī)?nèi)生細(xì)菌ZHAB63最佳培養(yǎng)條件。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1設(shè)計(jì)試驗(yàn)，Excel 2007計(jì)算統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和制作圖表，SPSS 25.0作方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化與篩選

從遼藁本植株中共分離到內(nèi)生細(xì)菌64株，其中根中31株；根莖中33株。發(fā)現(xiàn)23株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)11株植物病原菌中至少1種供試植物病原菌產(chǎn)生拮抗作用（見表3），長(zhǎng)春產(chǎn)區(qū)遼藁本根中分離到29株內(nèi)生細(xì)菌，通化產(chǎn)區(qū)遼藁本根中僅分離2株內(nèi)生細(xì)菌，長(zhǎng)春產(chǎn)區(qū)根中分離內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量高于通化產(chǎn)區(qū)，根中具有拮抗作用株菌占總菌數(shù)17.19%；兩產(chǎn)區(qū)根莖部位分離內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量相近，根莖中具有拮抗作用株菌占總菌數(shù)18.75%。

遼藁本內(nèi)生細(xì)菌采用生長(zhǎng)速率法初篩，對(duì)至少一種植物病原菌存在拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌有23株（見表4）。部分內(nèi)生細(xì)菌復(fù)篩抑菌結(jié)果如圖1所示。

表3 兩產(chǎn)區(qū)樣品中具有拮抗作用內(nèi)生細(xì)菌分布比例Table 3 Proportion of antagonistic endophytic bacteria in samples from two regions

表4 內(nèi)生細(xì)菌初篩結(jié)果Table 4 Endophytic bacterial preliminary screening results

圖1 部分內(nèi)生細(xì)菌復(fù)篩抑菌結(jié)果Fig.1 Partial endophytic bacteria rescreening and bacteriostatic results

其中對(duì)細(xì)辛菌核病菌、人參灰霉病菌有拮抗作用菌株最多，占有抑菌作用拮抗菌總數(shù)91.30%；其次對(duì)人參根腐病菌有拮抗作用菌株，占有抑菌作用拮抗菌總數(shù)82.61%；對(duì)防風(fēng)灰霉病菌、防風(fēng)根腐病菌及蒼術(shù)立枯病菌有拮抗作用內(nèi)生菌株大致相同，占65.22%；對(duì)細(xì)辛葉枯病病菌具有拮抗作用菌株最少，僅12株，占拮抗菌株52.17%。對(duì)9種以上供試植物病原菌存在拮抗作用內(nèi)生菌株6株，其中分離于根部ZHAB63菌株對(duì)11種供試病原菌均產(chǎn)生明顯抑制作用，且拮抗率均大于50.00%，該內(nèi)生菌菌株在對(duì)供試植物病原菌抑制作用具有廣譜性。抑菌率≥70%內(nèi)生菌株2株，遼藁本內(nèi)生細(xì)菌ZHAB3及ZHAB63菌株分別對(duì)人參疫病病菌及細(xì)辛菌核病菌抑菌率均大于70%，說明遼藁本內(nèi)生細(xì)菌對(duì)這2種供試植物病原菌抑制作用具有專一性。就細(xì)辛菌核病菌而言，ZHAB63菌株的抑菌率大于70%，達(dá)極顯著差異（P＜0.01）；對(duì)人參疫病病菌拮抗篩選中，ZHAB3菌株抑制效果較好，為最高抑菌率，達(dá)顯著差異（P＜0.05）；其余供試植物病原菌拮抗作用不明顯，拮抗率均未達(dá)到70%。

對(duì)ZHAB63菌株拮抗11種植物病原菌結(jié)果作方差分析（見表5），對(duì)細(xì)辛菌核病菌抑菌效果達(dá)極顯著（P＜0.01），抑菌率在11種供試植物病原菌中最高，故將細(xì)辛菌核病病菌作為測(cè)定ZHAB63條件優(yōu)化抑菌率的供試植物病原菌。

表5 菌株ZHAB63復(fù)篩結(jié)果Table 5 Rescreening results of strain ZHAB63

2.2 菌株ZHAB63鑒定

2.2.1 形態(tài)特征觀察

菌株ZHAB63接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h后，菌落呈淡黃色無光澤，表面干燥、粗糙、不透明，培養(yǎng)基上無色素積累，液體培養(yǎng)基表面形成一層薄膜。通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，革蘭氏染色為陽性。

2.2.1 分子鑒定

PCR擴(kuò)增使用通用引物獲得菌株ZHAB63的16SrDNA序列長(zhǎng)度為1 460 bp。將所得16SrDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)作BLAST比對(duì)分析，采用MEGA7.0中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，內(nèi)生菌株ZHAB63與芽孢桿菌屬（Bacillus）相似度高達(dá)99%，由此判斷ZHAB63菌株為芽孢桿菌屬中一個(gè)種。通過選取NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與ZHAB63序列同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。菌株ZHAB63與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefa?ciens）（HQ831399.1）聚于同一分支，其序列同源性為99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步將菌株ZHAB63鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.am?yloliquefaciens）。

2.3 ZHAB63菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 正交設(shè)計(jì)確定最佳組合

R值（極差）高低順序（RD＞RC＞RB＞RA）表明，影響菌株ZHAB63發(fā)酵液抑菌活性因子強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為硫酸鎂、蛋白胨、酵母粉和蔗糖。K值反映每個(gè)因素在3個(gè)不同水平中抑菌能力差異。從4個(gè)因素K1、K2、K3中選擇最大值，即每個(gè)因素最優(yōu)水平；4因素最優(yōu)水平組合即ZHAB63菌株發(fā)酵液最優(yōu)組合。故ZHAB63菌株培養(yǎng)基最優(yōu)組合為A2B2C2D2（如表6所示），即蔗糖（15.0 g·L-1）、酵母粉（20.0 g·L-1）、蛋白胨（20.0 g·L-1）、硫酸鎂（5.0 g·L-1）。

2.3.2 菌株ZHAB63培養(yǎng)條件優(yōu)化

結(jié)果見圖3。

圖2 ZHAB63菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZHAB63

表6 正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果及極差分析Table 6 Analysis of range and result of orthogonal experiment

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)ZHAB63菌株抑菌率的影響Fig.3 Effects of different culture conditions on inhibition rate of ZHAB63

由圖3可知，各因素抑制細(xì)辛菌核病菌生長(zhǎng)。菌株培養(yǎng)48 h時(shí)，抑菌率達(dá)84.99%，后緩慢進(jìn)入衰退期，抑菌率呈下降趨勢(shì)；菌株在26～32℃均可生長(zhǎng)，菌株抑菌率隨溫度升高而增大，但隨溫度升高，拮抗率呈下降狀態(tài)，菌株隨溫度變化甚至死亡；轉(zhuǎn)速180 r·min-1時(shí)，菌株抑菌率最大，達(dá)83.12%，超過180 r·min-1后，隨轉(zhuǎn)速增大，抑制率呈下降趨勢(shì)；菌株適合在偏弱酸（pH 6.5）環(huán)境下培養(yǎng)，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均抑制菌株生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡。

最佳培養(yǎng)條件為：48 h，30 ℃，180 r·min-1，pH 6.5時(shí)抑菌率最高為84.99%（見圖1A-Ⅰ）。結(jié)果表明，優(yōu)化后ZHAB63菌株等量發(fā)酵液置于相同發(fā)酵條件下抑菌率為84.99%，顯著大于NA培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌率72.22%（見圖1A-Ⅱ），優(yōu)化前后拮抗效果如圖1A所示。

3 討論與結(jié)論

3.1 內(nèi)生細(xì)菌分離與拮抗菌株篩選

內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)普遍存在，但從不同植物體內(nèi)分離到內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量存在較大差異，主要與分離方法、培養(yǎng)條件及環(huán)境因素等有關(guān)[15]。在杜仲、連翹、細(xì)葉小檗、明黨參等藥用植物內(nèi)生菌與宿主關(guān)系研究中，不同地區(qū)同一種植物分離的內(nèi)生細(xì)菌會(huì)因植株生長(zhǎng)環(huán)境等因素導(dǎo)致內(nèi)生菌種類、數(shù)量存在明顯差異，同一株植物不同部位內(nèi)生菌種類也存在差異[16-17]。本研究采用傳統(tǒng)組織表面消毒法共分離64株內(nèi)生細(xì)菌，長(zhǎng)春產(chǎn)區(qū)分離得到內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)多于通化產(chǎn)區(qū)，長(zhǎng)春產(chǎn)區(qū)根中分離內(nèi)生細(xì)菌多于根莖，通化產(chǎn)區(qū)則相反?？赡芘c遼藁本栽種環(huán)境及土壤中存活微生物種類有關(guān)。但目前普遍采用的組織表面消毒法可能存在局限性，需進(jìn)一步優(yōu)化內(nèi)生細(xì)菌分離方法加以證實(shí)。

藥用植物特殊內(nèi)環(huán)境，通過拮抗活性試驗(yàn)，大多數(shù)植物可篩選出具有拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌。饒小莉等從烏拉爾甘草根莖葉組織中分離內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對(duì)峙法篩選6株對(duì)植物病原菌存在拮抗作用菌株[18]。趙智靈等分離篩選吉林省12個(gè)主產(chǎn)區(qū)人參，采用濾紙片法篩選4株對(duì)人參病原真菌具有拮抗活性內(nèi)生細(xì)菌[14]。

從吉林省2個(gè)主產(chǎn)區(qū)采集遼藁本根、根莖組織分離內(nèi)生細(xì)菌，獲得多株內(nèi)生細(xì)菌，同時(shí)采用生長(zhǎng)速率法獲得一株廣譜性ZHAB63菌株，對(duì)細(xì)辛菌核病菌具有極顯著抑制作用，該研究將豐富藥用植物遼藁本生防菌菌種資源庫(kù)，為人參、細(xì)辛、防風(fēng)等植物病害生物防治提供新資源和新途徑。

3.2 內(nèi)生細(xì)菌ZHAB63鑒定

物種鑒定是內(nèi)生細(xì)菌研究基礎(chǔ)性工作，遼藁本內(nèi)生細(xì)菌鑒定采用菌株形態(tài)觀察、16SrDNA基因序列測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育樹相結(jié)合方法，與大多植物如人參[14]、水稻[19]等內(nèi)生細(xì)菌鑒定方法一致。16SrDNA序列分析是分子遺傳學(xué)鑒定法中重要鑒定方法之一，可快速準(zhǔn)確鑒定目前尚無法人工培養(yǎng)微生物，準(zhǔn)確率相對(duì)較高。脂肪酸鑒定廣泛應(yīng)用于植物細(xì)菌鑒定和多樣性研究[20-21]，但鑒定方法相對(duì)落后。需有相對(duì)全面基因序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，否則鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率較低，與其他鑒定技術(shù)結(jié)果差異較大，故逐漸被新鑒定技術(shù)替代。16S rDNA序列分析是目前標(biāo)準(zhǔn)微生物鑒定方法。將PCR測(cè)序拼接結(jié)果在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，查詢相似度最高序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定菌株種屬地位，可準(zhǔn)確定位植物內(nèi)生細(xì)菌，為遼藁本內(nèi)生細(xì)菌ZHAB63鑒定提供快速有效技術(shù)手段，為后續(xù)深入研究提供基礎(chǔ)。

芽孢桿菌屬內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病原真菌多具有抑菌性[22-23]。本研究篩選解淀粉芽孢桿菌ZHAB63，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及16SrDNA序列分析，根據(jù)已報(bào)道解淀粉芽孢桿菌特征描述[22]，鑒定ZHAB63菌株為芽孢桿菌屬Bacillus中解淀粉芽孢桿菌B.amylo?liquefaciens。菌株ZHAB63對(duì)11株藥用植物病原真菌均具有高于50%拮抗率，其中對(duì)細(xì)辛菌核病菌拮抗率達(dá)72.22%，且經(jīng)多次驗(yàn)證后抑菌效果均較為穩(wěn)定?？赡苡捎趦?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)過程分泌的代謝產(chǎn)物中含有降解植物病原菌酶類，對(duì)細(xì)辛菌核病菌抑制效果比較顯著，因此對(duì)細(xì)辛菌核病菌拮抗作用最明顯，但需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 ZHAB63菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

研究表明，優(yōu)化生防菌培養(yǎng)液組分及培養(yǎng)條件可提高菌體抗菌活性含量，其中關(guān)于解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化較多。章小洪等報(bào)道B.amylo?liquefaciens BW-13菌株以玉米粉、蛋白胨為培養(yǎng)基主要成分，pH 5，28℃，200 r·min-1，發(fā)酵144 h后，菌株拮抗率最高[24]；張淑梅等優(yōu)化內(nèi)生菌株TF28液體發(fā)酵條件發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、碳酸鈣，初始pH 7.5，30 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)48 h為最佳發(fā)酵條件[25]。本研究通過不同碳源氮源無機(jī)鹽篩選優(yōu)化B.amyloliq?uefaciens ZHAB63最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為蔗糖15.0 g·L-1，酵母粉 20.0 g·L-1，蛋白胨20.0 g·L-1，硫酸鎂5.0 g·L-1，與多數(shù)解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分相似。B.amyloliquefaciens可利用大多數(shù)生物無法利用的單碳或非C-C鍵多碳化合物，菌株ZHAB63液體發(fā)酵培養(yǎng)基所需最佳碳源為蔗糖，優(yōu)于葡糖糖等其他碳源。ZHAB63菌株對(duì)復(fù)合氮源利用能力較單一氮源強(qiáng)，將蛋白胨和酵母粉以同等比例混合作培養(yǎng)基氮源，其抗菌活性較單一氮源高，達(dá)顯著水平。同時(shí)，菌株ZHAB63對(duì)無機(jī)鹽需求較高，加入硫酸鎂對(duì)菌株影響最大，可能與分泌抗菌活性成分有關(guān)。B.amyloliquefaciens ZHAB63最適溫度為30℃，pH 6.5為弱酸性，與張淑梅等報(bào)道溫度結(jié)果一致，但弱堿性適合B.amyloliquefa?ciens菌株生長(zhǎng)存在差異[25]?？赡苡捎诮獾矸垩挎邨U菌來自不同宿主植物，其適宜生長(zhǎng)環(huán)境不同，植株中內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)特性及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)能力不同。優(yōu)化后轉(zhuǎn)速為180 r·min-1、發(fā)酵時(shí)間48 h，與張淑梅等發(fā)酵時(shí)間一致[25]，轉(zhuǎn)速差異較小。優(yōu)化后抑菌率達(dá)84.99%，比優(yōu)化前72.22%有所提高，表明優(yōu)化后更有利于菌株ZHAB63中抑菌活性物質(zhì)生成。因此，探究?jī)?yōu)勢(shì)內(nèi)生菌株ZHAB63最佳發(fā)酵條件為后續(xù)研究及推廣應(yīng)用提供重要理論依據(jù)，為內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究表明，遼藁本中含有豐富內(nèi)生細(xì)菌資源，存在拮抗東北常見藥用植物病原真菌的高活菌株，可作為防治人參、細(xì)辛等東北道地藥材常見植物病原真菌病害新方法，尤其對(duì)細(xì)辛菌核病防治開發(fā)前景較好。培養(yǎng)條件優(yōu)化后，菌株ZHAB63對(duì)植物病原菌拮抗作用增強(qiáng)。后續(xù)研究需進(jìn)一步測(cè)定解淀粉芽孢桿菌ZHAB63菌株在遼藁本植株內(nèi)定殖情況及對(duì)遼藁本生長(zhǎng)的影響，評(píng)估其對(duì)細(xì)辛菌核病菌、人參菌核病菌等多種植物病菌生物防治的安全性及田間防病效果，同時(shí)注意提高植物內(nèi)生細(xì)菌在藥用植物病害生物防治中的廣譜性和安全性。