外源海藻糖對堿脅迫下不同品種水稻幼苗生長及生理特性的影響

鄒德堂，王 爍，孫 健，李嘉明，尹天嬌，王敬國，劉化龍，鄭洪亮，楊洛淼

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

土壤鹽堿化已成為重要環(huán)境問題之一，我國土地鹽堿化問題較嚴(yán)重[1]。土壤中堿份積累對植物生長具有較大危害，破壞土壤養(yǎng)分有效性，不利于土壤良性發(fā)育和作物生長發(fā)育[2]。水稻是世界上主要糧食作物，且對堿脅迫表現(xiàn)為中度敏感，在幼苗期影響最為顯著[3]。當(dāng)堿濃度較高時(shí)，嚴(yán)重干擾離子穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生活性氧，降低膜脂透性，導(dǎo)致生理代謝紊亂，抑制水稻生長，造成減產(chǎn)[4-5]。因此，研究提高水稻耐堿性有效方法對鹽堿地利用和提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

海藻糖是一種非還原性雙糖，廣泛存在于低等植物、藻類、昆蟲、酵母及無脊椎動(dòng)物中，在水稻、小麥、煙草和玉米等高等植物中含量較低，但卻發(fā)揮重要作用[6]。近年來，海藻糖因其獨(dú)特理化性質(zhì)，且對調(diào)節(jié)植物響應(yīng)環(huán)境壓力具有良好作用，顯著提高植物抗逆境能力。研究表明，外源施加海藻糖可提高植物在干旱、高溫、高鹽等逆境條件下抗性。周林等研究發(fā)現(xiàn)，外源海藻糖有效提高雙胞蘑菇菌株耐高溫能力[7]。劉旋研究表明，外源海藻糖提高玉米耐低溫能力[8]。劉巖研究表明，外源海藻糖提高鹽脅迫下番茄可溶性糖、脯氨酸含量積累，提高過氧化物酶活性，進(jìn)而提高番茄耐鹽性[9]；孫夢利等研究表明，海藻糖對西瓜具有維持細(xì)胞生長、保護(hù)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)抗性反應(yīng)的功能[10]。

目前對外源海藻糖是否提高水稻耐堿能力研究較少，不同濃度下外源海藻糖對水稻各種生理指標(biāo)、水稻抗逆性，尤其是耐堿性的影響也鮮有報(bào)道。

本研究以6個(gè)耐鹽堿性不同水稻品種為材料，在水稻幼苗期作堿脅迫處理，葉面噴施不同濃度海藻糖，測定其形態(tài)、生理指標(biāo)，旨在探究堿脅迫的水稻幼苗形態(tài)及生理變化和緩解水稻堿害作用的最適外源海藻糖濃度，為水稻耐堿品種培育和耐堿栽培措施優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以水稻強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號，堿敏感品種東農(nóng)425等6個(gè)品種為試驗(yàn)材料，開展堿脅迫處理和外源海藻糖噴施試驗(yàn)，所有材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻研究所保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇籽粒飽滿水稻種子于75%乙醇中浸泡10 s，放入2%次氯酸鈉溶液中消毒5 min，自來水沖洗數(shù)次，室溫下浸泡36～48 h，直至種子發(fā)芽。將發(fā)芽水稻種子播種于秧盤中，秧盤規(guī)格為：長100 cm、寬50 cm、高10 cm，共32孔，每孔規(guī)格為：長10 cm、寬10 cm、高10 cm。待秧苗長到三葉一心時(shí)脅迫處理，設(shè)置6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。將每個(gè)品種種子均勻分為6份播于秧盤中，其中5份0.2%Na2CO3溶液處理，1份為自來水空白對照。

0、5、10、15、20 mmol·L-1海藻糖分別記作CK、T1、T2、T3、T4和T5。為避免堿沖擊水稻幼苗，Na2CO3濃度每隔6 h增加0.02%，直至營養(yǎng)液中Na2CO3濃度達(dá)0.2%，pH 9.00～9.09，設(shè)定此時(shí)為0 d，土培過程中保持通氣良好，營養(yǎng)液每隔2 d更換1次。處理3 d后取幼苗整株，觀察形態(tài)指標(biāo)、測定相應(yīng)生理指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 幼苗根總長度、根數(shù)、苗高、存活率測定

將整株幼苗從栽培盆中取出，清水沖洗表面雜物，蒸餾水沖凈，濾紙吸干表面水分，測量尺測量相應(yīng)根長、株高，計(jì)數(shù)相應(yīng)根數(shù)、存活數(shù)、死亡數(shù)，并計(jì)算存活率（存活數(shù)/總苗數(shù)）。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量測定

制備磷酸緩沖液A液與磷酸緩沖液B液，稱取0.5 g新鮮樣品制作酶液。硫代巴比妥酸、三氯乙酸和NaOH制備MDA反應(yīng)液，采用硫代巴比妥酸法測定[11]。

1.3.3 脯氨酸（Pro）含量測定

茚三酮、冰醋酸和蒸餾水制備酸性茚三酮，稱取0.6 g新鮮樣品，配制冰醋酸及甲苯，采用茚三酮顯色法測定[12]

1.3.4 可溶性蛋白含量測定

將G-250溶于乙醇、磷酸配制溶液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定[13]。

1.3.5 超氧物歧化酶活性（SOD）測定

將磷酸緩沖液、Met、NBT、EDTA-Na2、核黃素（FD）和H2O按照15∶3∶3∶3∶3∶2.5配置SOD反應(yīng)液，再用配制后酶液與反應(yīng)液采用氮藍(lán)四唑（NBT）測定[14]。

1.3.6 過氧化物酶活性（POD）測定

磷酸緩沖液配制10 mmol·L-1pH 7.0 PBS，PBS與稀釋后0.1 mol·L-1H2O2配制POD反應(yīng)液。采用愈創(chuàng)木酚法測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 18.0和Excel 2016處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度海藻糖對堿脅迫下各水稻品種幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

由表1可知，在T0條件下，6個(gè)品種存活率、苗高、根長、根數(shù)均達(dá)最低值，CK達(dá)最高值，堿處理后外源施加海藻糖使各品種中T1、T2、T3、T4均較T0有不同程度增長，其中尤以T2即海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)增長最顯著。增長趨勢呈先降再增后降趨勢。但葉長無明顯變化，說明外源施加海藻糖可提高堿脅迫下水稻幼苗根數(shù)、根長、苗高，進(jìn)而提高堿脅迫下水稻存活率。尤其對堿敏感品種東農(nóng)425苗高、根數(shù)、根長及存活率提高最顯著。對強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號也有提高。綜上所述，當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，提高最顯著。說明外源海藻糖大幅提高堿敏感品種耐堿性，且最適宜海藻糖濃度為10 mmol·L-1。

2.2 不同濃度海藻糖對堿脅迫下各品種水稻幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1 不同濃度海藻糖對堿脅迫下水稻幼苗丙二醛含量的影響

由圖1可知，6個(gè)品種丙二醛含量堿脅迫前存在差異，由高到低為東農(nóng)425號＞龍粳18號＞吉宏6號＞松粳16號＞龍稻5號＞長白10號。堿脅迫后，各品種丙二醛含量均上升，但東農(nóng)425上升幅度最大，長白10號上升幅度最小。隨海藻糖濃度不斷增加，6個(gè)品種丙二醛含量均表現(xiàn)為先升后降再升。其中，當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，各品種水稻幼苗丙二醛含量均達(dá)到最低值。外源施加不同濃度（T2、T3、T4、T5）海藻糖使丙二醛含量均比堿脅迫（T1）下丙二醛含量低，表明外源施加海藻糖降低堿脅迫下水稻丙二醛含量；其中外源海藻糖對堿處理后堿敏感品種東農(nóng)425丙二醛含量提高最顯著。對堿處理后強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號也有一定提高。結(jié)果表明，外源施加10 mmol·L-1海藻糖時(shí)，對水稻耐堿性提升最大。

表1 堿脅迫下不同濃度海藻糖處理6個(gè)水稻品種幼苗形態(tài)指標(biāo)變化Table 1 Morphological indices of rice seedlings of six varieties treated with trehalose at different concentrations under alkali stress

圖1 堿脅迫下不同濃度海藻糖處理6個(gè)水稻品種幼苗MDA含量變化Fig.1 Changes of MDAcontents of six rice varieties treated with trehalose at different concentrations under alkali stress

2.2.2 不同濃度海藻糖對堿脅迫下水稻幼苗脯氨酸含量的影響

植物受干旱、鹽堿等脅迫時(shí)，植物體內(nèi)Pro含量大量積累。由圖2可知，6個(gè)品種中除東農(nóng)425號外，其他5個(gè)品種Pro含量在堿脅迫前有差異，而東農(nóng)425號Pro含量明顯高于其他品種，長白10號最低。Pro含量由高到低為東農(nóng)425號＞龍粳18號＞吉宏6號＞松粳16號＞龍稻號5號＞長白10號。堿脅迫后，各品種Pro含量均上升，且東農(nóng)425號上升幅度最大，長白10號上升幅度最小。隨施加海藻糖濃度不斷提升，6個(gè)品種Pro含量均表現(xiàn)為先升后降再升。其中，當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，Pro含量達(dá)到最低值。趨勢均保持一致，6個(gè)品種脯氨酸含量均表現(xiàn)為先升后降再升。T1時(shí)達(dá)到峰值，T3時(shí)達(dá)最低值。即堿處理后當(dāng)海藻糖濃度為0 mmol·L-1時(shí)，含量達(dá)到最高值；其中當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，含量達(dá)到最低值。其中外源海藻糖對堿處理后堿敏感品種東農(nóng)425 Pro含量顯著提高。對堿處理后強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號也有一定提高。當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，提高最顯著。說明外源海藻糖可大幅提高堿敏感品種耐堿性，且最適宜海藻糖濃度為10 mmol·L-1。

2.2.3 不同濃度海藻糖對堿脅迫下水稻幼苗SOD、POD活性的影響

由圖3可知，堿脅迫下6種水稻幼苗葉片SOD活性均小于對照（CK）。6個(gè)品種本身SOD含量不同，長白10號含量最高，東農(nóng)425號含量最低，由高到低為長白10號＞龍稻5號＞吉宏6號＞松粳16號＞龍粳18號＞東農(nóng)425號。趨勢均保持一致，6個(gè)品種SOD活性均表現(xiàn)為先降后升再降趨勢。說明堿脅迫后水稻幼苗中SOD含量降低，隨外源施加海藻糖不斷增加，幼苗中SOD含量提高，當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，提升達(dá)到最大值；繼續(xù)增加海藻糖濃度后，幼苗中SOD含量逐漸降低。當(dāng)相同堿處理后，6個(gè)品種所表現(xiàn)變化幅度不同，東農(nóng)425號變化幅度最大，長白10號變化幅度最??；而隨外源施加海藻糖東農(nóng)425幅度最大，長白10號幅度最小。其中外源海藻糖對堿處理后堿敏感品種東農(nóng)425 SOD活性降低效果最顯著。對堿處理后強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號也有降低效果。當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，效果最為顯著。說明外源海藻糖可大幅提高堿敏感品種耐堿性，且最適宜海藻糖濃度為10 mmol·L-1。

圖2 堿脅迫下不同濃度海藻糖處理6個(gè)水稻品種幼苗Pro含量變化Fig.2 Changes of Pro contents of six rice varieties treated with trehalose at different concentrations under alkali stress

圖3 堿脅迫下不同濃度海藻糖處理6個(gè)水稻品種幼苗SOD活性變化Fig.3 Changes of SOD activities of six rice varieties treated with trehalose at different concentrations under alkali stress

由圖4可知，堿脅迫后6種水稻幼苗葉片POD含量均小于對照（CK），因品種POD含量不同，長白10號含量最高，東農(nóng)425號含量最低，由高到低為長白10號＞龍稻5號＞吉宏6號＞松粳16號＞龍粳18號＞東農(nóng)425號。趨勢均保持一致，6個(gè)品種POD含量均表現(xiàn)為先降后升再降趨勢。說明堿脅迫后水稻幼苗中POD含量降低，隨著外源施加海藻糖不斷增加，幼苗中POD含量提高，當(dāng)海藻糖濃度為0 mmol·L-1時(shí)，植物體內(nèi)POD含量達(dá)最低值；當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，達(dá)最高值。繼續(xù)增加海藻糖濃度后，幼苗中POD含量逐漸降低。相同堿處理后，6個(gè)品種表現(xiàn)變化幅度不同，東農(nóng)425變化幅度最大，長白10號變化幅度最小；而隨著外源施加海藻糖同樣呈現(xiàn)東農(nóng)425變化幅度最大，長白10號變化幅度最小。其中外源海藻糖對堿處理后堿敏感品種東農(nóng)425的POD活性降低效果最顯著。對堿處理后強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號也有降低效果。當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，效果最為顯著。說明外源海藻糖可大幅提高堿敏感品種耐堿性，且最適宜海藻糖濃度為10 mmol·L-1。

圖4 堿脅迫下不同濃度海藻糖處理6個(gè)水稻品種幼苗POD活性變化Fig.4 Changes of POD activities of six rice varieties treated with trehalose at different concentrations under alkali stress

2.2.4 不同濃度海藻糖對堿脅迫下水稻幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5可知，堿脅迫后6種水稻幼苗葉片可溶性蛋白含量均顯著高于對照（CK），而當(dāng)施加不同濃度海藻糖后，水稻幼苗可溶性蛋白含量變化呈先升后降趨勢，但不同品種增加程度不同。長白10號可溶性蛋白含量隨濃度遞增，增幅最大；東農(nóng)425增幅最小。其中外源海藻糖對堿處理后堿敏感品種東農(nóng)425可溶性蛋白含量提高效果最顯著。對堿處理后強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號也有提高。當(dāng)海藻糖濃度為10 mmol·L-1時(shí)，效果最顯著。說明外源海藻糖可大幅提高堿敏感品種耐堿性，且最適宜海藻糖濃度為10 mmol·L-1。

圖5 堿脅迫下不同濃度海藻糖處理6個(gè)水稻品種幼苗可溶性蛋白含量變化Fig. 5 Changes of soluble protein contentsof six rice varieties treated with trehalose at different concentrations under alkali stress

3 討 論

鹽堿脅迫下，水稻幼苗根部首先遭受嚴(yán)重傷害，造成根部生長緩慢，根數(shù)減少，甚至死亡。索藝寧等研究表明，堿脅迫較鹽脅迫對水稻根長的影響嚴(yán)重[16]。呂海燕研究結(jié)果表明，堿脅迫下水稻根總長度、根數(shù)、株高均明顯減少[17]。呂丙盛試驗(yàn)結(jié)果表明，堿脅迫顯著抑制水稻幼苗根總長度、根數(shù)[18]。本研究中堿脅迫下，水稻幼苗根長、根數(shù)及苗高均顯著降低，與索藝寧等研究結(jié)果一致。本研究中，0.2%Na2CO3脅迫下，外源施加10 mmol·L-1海藻糖后，各品種水稻幼苗根總長度、根數(shù)、株高、存活率均提升，但對葉長無影響?？赡苁侨~部對堿脅迫表現(xiàn)遲緩，而根部對堿脅迫表現(xiàn)更為敏感，因而施加海藻糖后差異更大。

丙二醛是膜脂過氧化最終產(chǎn)物之一，是反映膜脂損傷程度重要指標(biāo)，其含量反映植物遭受逆境傷害程度。丙二醛濃度越高，代表植物受逆境損傷越嚴(yán)重。胡慧芳等研究表明，外源海藻糖可降低干旱條件下黃瓜MDA含量，使其具有更強(qiáng)的耐干旱能力[19]。陳曉云等研究表明，外源蔗糖可減少鹽脅迫下蕎麥葉片MDA含量，提高蕎麥抗逆能力[20]。本研究表明，正常情況下，水稻幼苗MDA含量較低，堿脅迫后，MDA含量增加。噴施海藻糖后，水稻幼苗葉片中MDA含量顯著降低，可能海藻糖提高細(xì)胞抗脫水性，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能損傷緩解，改變膜通透性，進(jìn)而提高水稻幼苗耐堿能力。噴施10 mmol·L-1海藻糖濃度效果最佳，且對堿敏感品種東農(nóng)425提升更顯著。

SOD、POD是植物體內(nèi)有效清除活性氧重要酶促系統(tǒng)，超氧化物歧化酶在需氧原核生物和真核生物中廣泛存在，是活性氧清除系統(tǒng)中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶。過氧化物酶同SOD發(fā)生協(xié)同作用，幫助植物清理體內(nèi)過剩自由基，使自由基水平維持在正常水平，從而提高植物抗逆性。丁順華等研究表明，小麥葉片中SOD、POD活性在鹽脅迫下顯著降低[21]。本研究表明，堿脅迫下，水稻幼苗SOD、POD活性顯著下降，外源施加海藻糖后，SOD、POD活性提升，尤其10 mmol·L-1濃度效果最佳，且對堿敏感品種東農(nóng)425提升顯著?？赡芎Ｔ逄翘岣邏A脅迫下水稻幼苗SOD、POD活性，提高體內(nèi)活性氧清除能力，保護(hù)膜脂完整性。

脯氨酸、可溶性蛋白等有機(jī)調(diào)節(jié)物質(zhì)使細(xì)胞內(nèi)滲透勢保持相對穩(wěn)定，避免細(xì)胞失水。同時(shí)還使生物大分子功能和結(jié)構(gòu)作用得到保護(hù)與穩(wěn)定[22]。杜錦等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米幼苗中脯氨酸和可溶性蛋白含量在鹽脅迫條件下增加[23]。本研究發(fā)現(xiàn)堿脅迫下水稻幼苗中脯氨酸、可溶性蛋白含量提高，從而提高水稻幼苗對堿環(huán)境抗逆能力，施加10 mmol·L-1海藻糖時(shí)，脯氨酸含量顯著降低，同時(shí)可溶蛋白含量顯著提升。堿敏感品種表現(xiàn)最顯著，從而增加細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)濃度，降低細(xì)胞滲透勢，緩解堿脅迫對水稻幼苗傷害。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究以水稻強(qiáng)耐堿品種長白10號、龍稻5號，中度耐堿品種松粳16號、吉宏6號、龍粳18號以及堿敏感品種東農(nóng)425共6個(gè)品種為試驗(yàn)材料，置于0.2%Na2CO3堿脅迫條件下，觀察各品種水稻幼苗形態(tài)和生理變化。一定時(shí)間后外源施加海藻糖后觀察幼苗形態(tài)和生理變化。比較兩次觀察結(jié)果得出結(jié)論：外源施加海藻糖有效提高各品種耐堿性，特別是對堿敏感品種提高效果最顯著，最適宜海藻糖濃度為10 mmol·L-1。