桂枝茯苓丸抗大鼠子宮肌瘤作用機(jī)制研究

姚祺 郭輝 陳玲玲 陳秀萍 林東梅 陳山源

摘要 目的：探討桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤模型大鼠的作用機(jī)制。方法：60只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組：分為空白（Control）組、模型（Hys）組、桂枝茯苓丸低劑量（G-L）組、桂枝茯苓丸高劑量（G-H）組，每組15只。除假手術(shù)組外，其余3組均進(jìn)行子宮肌瘤造模。G-L組、G-H組分別接受濃度為1.32 g/mL、2.64 g/mL的桂枝茯苓丸混懸液1 mL灌胃，其中Control組及Hys組大鼠給予等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)8周。記錄各組大鼠子宮及卵巢系數(shù)，HE染色觀察子宮形態(tài)學(xué)變化，透射電鏡觀察子宮超微結(jié)構(gòu)變化，ELISA法檢測子宮組織E2、P、ER含量，Western Blot法檢測子宮組織中PI3K/Akt信號通路蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與Control組比較，Hys組的子宮和卵巢系數(shù)、E2、P、ER的含量及抗凋亡蛋白PI3K、p-Akt表達(dá)增高（P<0.05），促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)減少（P<0.05），G-L組、G-H組上述指標(biāo)均有所改善（P<0.05），但G-H組明顯優(yōu)于G-L組（P<0.05）。HE染色及透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察提示Hys組大鼠子宮平滑肌增厚，細(xì)胞邊界不清晰，細(xì)胞核固縮呈橢圓形或畸形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，部分嵴斷裂消失，可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，肌纖維排列紊亂無序，可見明顯炎性細(xì)胞浸潤;G-L組子宮平滑肌細(xì)胞排列較Hys組有序，平滑肌層仍有所增厚，炎性細(xì)胞浸潤亦較Hys組組減少，細(xì)胞核較Hys組稍增大，線粒體腫脹和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張減少;G-H組子宮平滑肌細(xì)胞排列較Hys組明顯有序、緊密，僅見輕微炎性細(xì)胞浸潤，平滑肌層無明顯增生，且平滑肌細(xì)胞核較正常，線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)接近正常。結(jié)論：桂枝茯苓丸有效改善子宮肌瘤模型大鼠的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT通路，下調(diào)E2、P、ER的表達(dá)，上調(diào)Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 桂枝茯苓丸;大鼠;子宮肌瘤;雌二醇;孕酮;雌激素受體;PI3K/Akt;作用機(jī)制

Study on the Mechanism of Guizhi Fuling Pill on Uterine Leiomyoma in Rats

YAO Qi1，GUO Hui1，CHEN Lingling1，CHEN Xiuping1，LIN Dongmei1，CHEN Shanyuan2

（1 Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University，F(xiàn)uzhou 350007，China; 2 Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Guizhi Fuling Pill in the treatment of uterine leiomyoma model rats.Methods：A total of 60 adult female SD rats were randomly divided into 4 groups：a blank （Control） group （n=15），a model （Hys） group （n=15），a low dose Guizhi Fuling pill （G-L） group （n=15） and a high dose Guizhi Fuling Pill （G-H） group （n=15）.Except for the sham operation group，the other 3 groups were modeled by uterine leiomyoma.G-L group and G-H group received 1.32 g/mL and 2.64 g/mL Guizhi Fuling Pill suspension 1 mL respectively，and the rats in the control group and Hys group were given the same dose of normal saline once a day for 8 weeks.The coefficients of uterus and ovary were recorded，the morphological changes of uterus were observed by HE staining，the ultrastructural changes of uterus were observed by transmission electron microscope，the contents of E2，P and ER in uterine tissue were detected by ELISA method，and the expression of PI3K/Akt signal pathway protein in uterine tissue was detected by Western Blot method.Results：Compared with Control group，the coefficient of uterus and ovary，the content of E2，P，ER and the expression of anti-apoptotic protein PI3K and p-Akt increased （P<0.05） and the expression of pro-apoptotic protein Caspase-3 decreased （P<0.05） in Hys group.The above-mentioned indexes were improved in G-L group and G-H group （P<0.05），but the expression of anti-apoptotic protein PI3K and p-Akt in G-H group was significantly better than that in G-L group （P<0.05）.The morphological observation of HE staining and transmission electron microscope showed that the uterine smooth muscle of Hys group thickened，the cell boundary was not clear，the nuclear pyknosis was oval or abnormal，the mitochondria in the cytoplasm swelled，part of the crest ruptured and disappeared，the rough endoplasmic reticulum dilated，the muscle fibers were disordered，and obvious inflammatory cell infiltration could be seen.The arrangement of uterine smooth muscle cells in G-Lgroup was more orderly than that in Hys group，the smooth muscle layer was still thicker，the infiltration of inflammatory cells was less than that in Hys group，the nucleus was slightly larger，and the swelling of mitochondria and dilatation of rough endoplasmic reticulum in G-L group were less than those in Hys group.The arrangement of uterine smooth muscle cells in G-H group was more orderly and compact than that in Hys group，only slight inflammatory cell infiltration，no obvious proliferation of smooth muscle layer，normal smooth muscle nucleus，mitochondria and rough endoplasmic reticulum were close to normal.Conclusion：Guizhi Fuling Pill can effectively improve the morphological indexes of uterine leiomyoma model rats，and its mechanism may be related to the activation of PI3K/AKT pathway，down-regulation of E2，P，ER expression and up-regulation of Caspase-3 expression.

Keywords Guizhi Fuling Pill; Rat; Hysteromyoma; Estradiol （E2）; Progesterone （P）; Estrogen receptor （ER）; PI3K/Akt; Mechanism

中圖分類號：R285.5;R273;R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.006

子宮肌瘤是好發(fā)于30～50歲女性[1]，且因子宮平滑肌增生形成的常見性激素依賴性良性腫瘤[2]，臨床表現(xiàn)以下腹部疼痛和陰道異常出血為主，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[3-4]，目前有研究人員推測可能與遺傳因素，未分化成熟的子宮肌細(xì)胞突變，及局部雌、孕激素的水平等因素密切相關(guān)[5-6]。我們通過對近10年的文獻(xiàn)梳理，打破了細(xì)胞過度凋亡現(xiàn)象僅存于惡性腫瘤的傳統(tǒng)認(rèn)知，發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤等良性婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞過度凋亡亦存在密不可分的關(guān)系[7-11]。PI3K/AKT信號通路磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）信號參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié);有研究顯示子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞數(shù)量增減不僅與細(xì)胞增殖旺盛程度有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡速度有關(guān)[12]。

在中醫(yī)學(xué)中，子宮肌瘤屬于“癥瘕”“積聚”的范疇，癥瘕的形成因臟腑血?dú)馓撊?，外邪乘虛而入，正邪相搏結(jié)于下焦，久留不去，而成氣滯、血瘀和痰濁之邪膠結(jié)不解，變生而成氣滯、血瘀和痰濁之邪膠結(jié)不解，變生而成癥瘕，一下腹部的腫塊，或脹痛為主癥，伴有寒熱不欲食、腰脅酸痛、水腫等全身證候。癥瘕的治療原則是留者攻之，且切不可攻伐太過。桂枝茯苓丸首載于張仲景《金匱要略》：“婦人宿有癥病，經(jīng)斷未及三月，而得漏下不止，胎動在臍上者，為癥痼害。妊娠六月動者，前三月經(jīng)水利時，胎也。下血者，后斷三月血不也。所以血不止者，其瘕不去故也，當(dāng)下其癥，桂枝茯苓丸主之”。該方由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、芍藥等5味藥組成，具有和緩化癥而不傷胎的特點(diǎn)?，F(xiàn)代研究表明桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤的機(jī)制可能與抑制纖維結(jié)締組織增生、降低雌激素和孕激素及其受體水平等相關(guān)[13]。筆者通過多年的臨床工作經(jīng)驗(yàn)明確桂枝茯苓丸對子宮肌瘤的療效，現(xiàn)以子宮肌瘤模型大鼠為研究對象，探討桂枝茯苓丸抑制子宮肌瘤的可能生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 購買60只平均體質(zhì)量為（230±20）g的SPF級健康成年雌性SD鼠，所有大鼠均購自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，（合格證號：SCXK（滬）2017-0001）。所有大鼠購買后均飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，進(jìn)行為期7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±0.5）℃，濕度（50±1）%，12 h/12 h晝夜交替，自由攝食、飲水。本研究方案經(jīng)廈門大學(xué)動物管理委員會批準(zhǔn)通過（28932-005），實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照國際條例進(jìn)行。

1.1.2 藥物 桂枝茯苓丸（山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號：392839），苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：321201），黃體酮注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，批號：434-9）。

1.1.3 試劑與儀器 PMSF（碧云天公司，批號：232-01），SDS-PAGE電泳膠（碧云天公司，批號：65443），BCA工作液（碧云天公司，批號：293-07），PI3K（CST公司，美國，貨號：s039023）、Akt（CST公司，美國，貨號：s19203）、p-Akt（CST公司，美國，貨號：t493291）、Caspase-3 p-Akt（CST公司，美國，貨號：s38432）及β-actin p-Akt（CST公司，美國，貨號：s07382）一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔（CST公司，美國，貨號：392032），SDS-PAGE電泳膠（碧云天公司，貨號：34332），BCA工作液（碧云天公司，貨號：3920-3），E2 ELISA試劑盒（Promega公司，美國，貨號：66435）、P ELISA試劑盒（Promega公司，美國，貨號：24934）、ER ELISA試劑盒（Promega公司，美國，貨號：29321）。

高速冷凍離心機(jī)[Thermo Fisher公司，美國，型號TGL-20M/18M（S）]，切片機(jī)（Leica公司，德國，型號：RM2235），普通光學(xué)顯微鏡（Leica公司，德國，型號：DCM8），酶標(biāo)儀（Leica公司，德國，型號：9602），電泳槽（Bio-rad公司，美國，型號：3923-K），轉(zhuǎn)膜儀（Bio-rad公司，美國，型號：390-Q2），透射電子顯微鏡（JEOL公司，日本，型號：EM-2100PlusJEM-2100Plus），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad公司，美國，型號：GelDoc 2000）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：60只雌性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白（Control）組、模型（Hys）組、桂枝茯苓丸低劑量（G-L）組、桂枝茯苓丸高劑量（G-H）組，每組15只。

2）模型制備：除假手術(shù)組外，其余3組均給予苯甲酸雌二醇注射液（0.50 mg/kg）肌內(nèi)注射，3次/周，共12周;隨后肌內(nèi)注射黃體酮注射液（5 mg/kg），2次/周，共4周，建立子宮肌瘤模型?？瞻讓φ战M在相同時間給予等量生理鹽水。

1.2.2 干預(yù)方法 第17周開始藥物干預(yù)，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》[14]中人和動物藥物間按體表面積折算的等效劑量換算公式，以成人臨床用藥劑量計(jì)算動物用藥劑量，計(jì)算得出G-L組、G-H組分別接受濃度為1.32 g/mL、2.64 g/mL的桂枝茯苓丸混懸液1 mL灌胃，其中空白組及模型組大鼠接受等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)8周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 子宮與卵巢系數(shù) 各組大鼠常規(guī)麻醉處死后，解剖取出子宮和卵巢組織，小心剔除組織表面脂肪和其他組織，分別稱取子宮和卵巢濕重，計(jì)算子宮和卵巢系數(shù)。子宮系數(shù)=子宮濕重/大鼠體質(zhì)量（取材時）×100%;卵巢系數(shù)=卵巢濕重/大鼠體質(zhì)量（取材時）×100%。

1.2.3.2 子宮形態(tài)學(xué)觀察 取子宮分角上病理改變較典型部位的組織，進(jìn)行常規(guī)甲醇固定、脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察觀察子宮平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞排列、體積及數(shù)量等形態(tài)變化，觀察是否有炎性浸潤等。

1.2.3.3 子宮超微結(jié)構(gòu)觀察 取子宮分角上病理改變較典型部位的組織在3%戊二醛固定液中，并迅速將其修剪成2 mm×2 mm的小方塊，后經(jīng)3%戊二醛/1.5%多聚甲醛前固定4 h（4 ℃），l%鋨酸/1.5%亞鐵氰化鉀后固定2 h，經(jīng)0.1 mol/LPBS沖洗3次后，進(jìn)行脫水、包埋、固化、切片，透射電鏡下觀察各組子宮肌瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.2.3.4 雌二醇、孕酮、雌激素受體含量檢測 采用雙抗體/夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法檢測子宮組織均漿中雌二醇（E2）、孕酮（P）、雌激素受體（ER）的含量，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照各指標(biāo)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀讀取結(jié)果并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3.5 PI3K/Akt信號通路蛋白表達(dá)的檢測 以1 mL裂解緩沖液裂解200 mg子宮組織，離心，取上清液。BCA法測蛋白濃度，蛋白變性。按等量蛋白（50 μg）上樣至SDS-PAGE凝膠，電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h），轉(zhuǎn)膜（100 V，250 mA），時間依據(jù)各指標(biāo)分子量大小而定。5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入抗PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3及β-actin（1∶5 000）一抗抗體孵育，將靶PVDF膜放于搖床上孵育，并置于4 ℃環(huán)境中過夜。次日將辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗按照1∶1 000的濃度加入靶PVDF膜，室溫下孵育50 min后取出PVDF膜，用TBST清洗3次后將其置于掃描儀上，滴加ECL顯色液，避光反應(yīng)1 min后進(jìn)行曝光顯影，利用生物圖像分析系統(tǒng)對所得圖像進(jìn)行分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，其中符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)利用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組子宮與卵巢系數(shù)的比較 與Control組比較，Hys組、G-L組、G-H組的的子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)均明顯增加（P<0.05）;G-L組和G-H組較Hys組均明顯下調(diào)（P<0.05），其中G-H組下調(diào)程度優(yōu)于G-L組（P<0.05）。見表1。

2.2 各組子宮形態(tài)學(xué)的變化 各組大鼠子宮組織HE染色顯示：Control組大鼠子宮平滑細(xì)胞排列整齊、緊密，形態(tài)正常，色澤均一，肌層未見炎性細(xì)胞浸潤，未出現(xiàn)增生;Hys組大鼠子宮平滑肌增厚，細(xì)胞邊界不清晰，細(xì)胞核呈現(xiàn)扁圓形狀，肌纖維排列紊亂無序，可見明顯炎性細(xì)胞浸潤;G-L組子宮平滑肌細(xì)胞排列較Hys組有序，平滑肌層仍有所增厚，炎性細(xì)胞浸潤亦較Hys組組減少;G-H組子宮平滑肌細(xì)胞排列較Hys組明顯有序、緊密，見輕微炎性細(xì)胞浸潤，平滑肌層無明顯增生。見圖1。

2.3 各組子宮超微結(jié)構(gòu)的情況 各組大鼠子宮組織電鏡下觀察結(jié)果顯示：Control組大鼠子宮平滑肌細(xì)胞核大小、形態(tài)正常，胞質(zhì)中細(xì)胞器正常，細(xì)胞周圍膠纖維排列規(guī)則;Hys組子宮平滑肌細(xì)胞核固縮呈橢圓形或畸形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，部分嵴斷裂消失，可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，且局部有大量溶酶體聚集，細(xì)胞內(nèi)含有較豐富的肌微絲，并見脂褐素;G-L組子宮平滑肌細(xì)胞核較Hys組稍增大，見部分線粒體腫脹和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張;G-L組子宮平滑肌細(xì)胞核較正常，線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)接近正常。見圖2。

2.4 各組子宮E2、P、ER含量的比較 與Control組比較，Hys組、G-L組、G-H組的子宮組織中E2、P和ER表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P<0.05）;G-L組和G-H組較Hys組均明顯下調(diào)（P<0.05），其中G-H組下調(diào)程度優(yōu)于G-L組（P<0.05）。見表2。

2.5 各組子宮PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的比較 與Control組比較，Hys組、G-L組、G-H組的子宮組織中PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P<0.05），G-L組和G-H組的PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)較Hys組均明顯下調(diào)（P<0.05），其中G-H組下調(diào)程度大于G-L組（P<0.05）;與Control組比較，Hys組、G-L組、G-H組的子宮組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P<0.05），G-L組和G-H組的表達(dá)較Hys組均明顯增多（P<0.05），其中G-H組上升程度大于G-L組（P<0.05）。見圖3，表3。

3 討論

3.1 桂枝茯苓丸對子宮形態(tài)學(xué)的影響 桂枝茯苓丸現(xiàn)常用于治療子宮肌瘤，《金匱要略·婦女妊娠病》有云：婦人宿有癥病……桂枝茯苓丸主之。凡癥之初必因寒，其中桂枝與芍藥一陰一陽，謂之于陰中宣陽以調(diào)理陰陽而消其寒，癥之成，必挾濕熱而自成窠囊，牡丹皮性寒，與桂枝寒溫相濟(jì)，宣通血中熱結(jié)，茯苓滲濕與牡丹皮一氣一血，以調(diào)寒溫而扶正氣，桃仁善于破惡血，消癥痼，有病則病受之，則不傷胎血也，是故養(yǎng)正即所以去邪也。“丸者緩也”，桂枝茯苓丸在用法上“煉蜜和丸，如兔屎大”，使用的藥量小，又加以蜂蜜緩和藥性，體現(xiàn)了妊娠之體雖消除癥病，法當(dāng)緩圖的原則，令藥適以勝病，而不害胎。臨床上使用桂枝茯苓丸來治療子宮肌瘤的研究屢見不鮮，周瓊[15]采用高強(qiáng)度聚焦超聲結(jié)合桂枝茯苓丸口服治療子宮肌瘤短期臨床有效率達(dá)93.67%，同時表明其能更快的改善臨床癥狀，縮小肌瘤的體積;林景美等[16]選擇桂枝茯苓丸與米非司酮治療子宮肌瘤，改善了子宮體積，并減少了最大肌瘤的體積，使治療有效率達(dá)到93.94%。本研究通過HE染色和透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤模型大鼠，結(jié)果顯示Hys組大鼠的子宮平滑肌出現(xiàn)增厚，細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞核畸形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體部分嵴出現(xiàn)斷裂消失，可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，肌纖維的排列無序，提示明顯的炎性細(xì)胞浸潤;G-L組的子宮平滑肌細(xì)胞排列就較Hys組有序，平滑肌層雖仍有所增厚，但炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，細(xì)胞核也較Hys組增大，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張減少;G-H組的子宮平滑肌細(xì)胞則排列較Hys組更為緊密有序，平滑肌層未見明顯的增生，僅可見輕微的炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核也較正常，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)與正常形態(tài)類似。提示桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤模型大鼠有效改善其病理形態(tài)。

3.2 基于PI3K/AKT通路探討桂枝茯苓丸的作用機(jī)制 子宮肌瘤在青春期前較為少見，絕經(jīng)后也逐步的萎縮或消退，更多是好發(fā)于育齡女性，這是因?yàn)槌霈F(xiàn)外源性的雌激素刺激或妊娠時，子宮肌瘤會迅速增大，而低雌二醇狀態(tài)則會導(dǎo)致子宮肌瘤縮小、甚至消失，說明子宮肌瘤與卵巢性激素水平密切，是一種激素依賴型腫瘤。研究表明雌孕激素在經(jīng)過一系列反應(yīng)，與細(xì)胞中ER、PR進(jìn)行結(jié)合后才能具有生物學(xué)效應(yīng)[17-18]。之前學(xué)者普遍認(rèn)為E可以促進(jìn)血管生成，并影響血管通透性，通過與ER的結(jié)合改變了細(xì)胞的形態(tài)，增加DNA的合成，從而為P、ER創(chuàng)造肌瘤增殖的環(huán)境，是子宮肌瘤發(fā)生與發(fā)展的重要促進(jìn)因素。隨著目前組織、生化和臨床方面的研究進(jìn)展，又有新的證據(jù)顯示孕激素和雌激素在子宮肌瘤的生長中起著同等重要的作用。學(xué)者在使用抗P制劑治療子宮肌瘤患者后，發(fā)現(xiàn)肌瘤體積出現(xiàn)明顯的減小[19]。在子宮平滑肌瘤內(nèi)，細(xì)胞有絲分裂活性于黃體期達(dá)到高峰，大劑量孕激素治療增強(qiáng)其細(xì)胞核分裂活性，提示P有促進(jìn)肌瘤細(xì)胞有絲分裂的作用，此外，P還具有激活細(xì)胞增生、分化、增殖的作用。本研究中結(jié)果顯示與Control組比較，Hys組的子宮卵巢系數(shù)、E2、P、ER的表達(dá)增高，隨著桂枝茯苓丸的干預(yù)，G-L組、G-H組上述指標(biāo)均有所改善，且G-H組明顯優(yōu)于G-L組（P<0.05）。

ER作為一種受體，存在于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)，是一種能選擇性與相應(yīng)的遞質(zhì)、激素等相結(jié)合，并產(chǎn)生特定生理效應(yīng)的大分子物質(zhì)，其生物效應(yīng)受諸多因素的影響，其中PI3K/AKT通路的激活情況與子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)。在P13K/AKT信號通路中，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide 3 kinase，P13K）作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，進(jìn)一步活化下游的AKT，啟動其對細(xì)胞凋亡因子Caspase-3的調(diào)控[20]。本研究結(jié)果顯示，與Control組比較，Hys組的抗凋亡蛋白PI3K、p-Akt表達(dá)增高（P<0.05），促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)減少（P<0.05），隨著桂枝茯苓丸的治療，G-L組、G-H組上述指標(biāo)均有所改善（P<0.05），但G-H組明顯優(yōu)于G-L組（P<0.05）。提示桂枝茯苓丸抗大鼠子宮肌瘤作用機(jī)制可能通過介導(dǎo)PI3K/AKT通路促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。

3.3 細(xì)胞凋亡與子宮組織形態(tài)學(xué) 子宮肌瘤臨床病理組織形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為平滑肌細(xì)胞增多。以往研究認(rèn)為，細(xì)胞數(shù)目增多主要是由細(xì)胞增殖引起的。目前已有研究證實(shí)，細(xì)胞數(shù)量增減不僅與細(xì)胞增殖的劇烈程度有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡的速度有關(guān);抑制細(xì)胞凋亡可延長細(xì)胞存活期，降低死亡率，間接增加細(xì)胞數(shù)量，間接促進(jìn)細(xì)胞數(shù)目增多[21-22]。Caspase-3對細(xì)胞的增殖速度不產(chǎn)生影響，而是通過促進(jìn)多種形式的細(xì)胞死亡，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少，從而抑制子宮肌瘤的生長[23-24]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣游镒訉m組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，子宮平滑肌明顯增厚，平滑肌細(xì)胞明顯增多;HE染色在平滑肌層未觀察到細(xì)胞凋亡，證實(shí)子宮肌瘤模型動物中細(xì)胞凋亡受抑制只發(fā)生在子宮平滑肌層。提示，細(xì)胞凋亡受抑制可能是促進(jìn)子宮平滑肌細(xì)胞增多的機(jī)制之一。由于凋亡受抑制，細(xì)胞增殖與凋亡失衡，導(dǎo)致子宮平滑肌細(xì)胞增多。本研究通過桂枝茯苓丸治療后，激活PI3K/AKT信號通過，促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，打破了病理狀態(tài)下細(xì)胞增殖與凋亡的失衡狀態(tài)，抑制子宮平滑肌細(xì)胞的增殖，從而縮小子宮肌瘤。

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（2020-08-02收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81804228）;福建省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)科研項(xiàng)目（WZY0939）作者簡介：姚祺（1983.12—），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：婦科內(nèi)分泌及不孕癥中西醫(yī)結(jié)合診療，婦科疾病微創(chuàng)治療，E-mail：yaoqi1215@163.com通信作者：陳山源（1984.08—），男，碩士，講師，研究方向：內(nèi)科疾病的中醫(yī)診療，E-mail：32077069@qq.com