骨碎補(bǔ)及其主要成分對小鼠子宮內(nèi)膜同源盒基因10 mRNA、白血病抑制因子和整合素α_νβ₃的影響

石玥 劉雁峰 穆國華 王鐵楓 姜晶 何波琳 喬婷 王佳楣

摘要 目的：探索骨碎補(bǔ)及其主要成分對胚泡著床障礙模型小鼠子宮內(nèi)膜的影響。方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為7組：空白組、模型組、西藥組I（補(bǔ)佳樂組）、西藥組II（阿司匹林組）、骨碎補(bǔ)組、骨碎補(bǔ)總黃酮組、骨碎補(bǔ)柚皮苷組，以GnRHa+HMG+HCG方法造模，干預(yù)后檢測各組相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)量。結(jié)果：骨碎補(bǔ)組及總黃酮組小鼠子宮內(nèi)膜同源盒基因10（HOXA-10）mRNA表達(dá)明顯增加（P<0.05）;骨碎補(bǔ)組、總黃酮組及柚皮苷組白血病抑制因子（LIF）表達(dá)明顯增加（P<0.05）;骨碎補(bǔ)組整合素ανβ3表達(dá)明顯增加（P<0.05），總黃酮組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但積分光密度值明顯增加（P<0.05）。結(jié)論：骨碎補(bǔ)可能通過調(diào)節(jié)胚泡著床期子宮內(nèi)膜HOXA 10、LIF、整合素ανβ3的表達(dá)，有利于胚泡對子宮內(nèi)膜的黏附，從而改善子宮內(nèi)膜容受性?？傸S酮作為骨碎補(bǔ)藥材的主要活性成分，亦可改善子宮內(nèi)膜容受性。

關(guān)鍵詞 骨碎補(bǔ);總黃酮;柚皮苷;子宮內(nèi)膜容受性;同源盒基因A10;白血病抑制因子;整合素ανβ3

Effect of Rhizoma Drynariae and Its Main Component on HOXA-10 mRNA，LIF and Integrin ανβ3 Expression in Mice Endometrium

SHI Yue1，LIU Yanfeng2，MU Guohua2，WANG Tiefeng2，JIANG Jing1，HE Bolin1，QIAO Ting1，WANG Jiamei1

（1 Haidian Maternal & Child Health Hospital，Beijing 100080，China; 2 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：To observe effects of rhizoma drynariae and its main components on endometrium of mice with blastocyst implantation disorder.Methods：Divide the experimental animals into 7 groups：a blank group，a model group，a western medicine treated group 1 （progynova group），a western medicine treated group 2 （aspirin group），a rhizoma drynariae group，an osteopractic total flavone group and a rhizoma drynariae naringin group.Mice model with GnRHa+HMG+HCG was established.We administrated drugs and tested the expression amount of each index in mice endometrium.Results：Expression of HOXA-10 mRNA in mice endometrium of rhizoma drynariae group and total flavone group increased significantly （P<0.05）.Rhizoma drynariae group，total flavone group and naringin group had increased LIF expression in mice endometrium （P<0.05）.Rhizoma drynariae group had an increased integrin ανβ3 expression in mice endometrium （P<0.05），there was no significant difference in total flavone group （P>0.05），but the integral optical density was significantly increased （P<0.05）.Conclusion：Rhizoma drynariae may regulate the expression of HOXA-10，LIF and integrin ανβ3 in endometrium during embryo implantation，which is conducive to the adhesion of blastocyst to endometrium，in order to improve endometrial receptivity.As the main active component of rhizoma drynariae，total flavonoids can also improve endometrial receptivity.

Keywords Rhizoma drynariael; Total flavone; Naringin; Endometrial receptivity; Homeobox A10; Leukaemia inhibitory factor; Integrin ανβ3

中圖分類號(hào)：R285.5;R271.41;R733.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.007

骨碎補(bǔ)本是著名的骨傷科常用中藥，因其補(bǔ)腎氣，行血脈，益筋骨，為名老中醫(yī)肖承悰教授治療子宮內(nèi)膜容受性低的經(jīng)驗(yàn)方——二補(bǔ)助育湯的君藥之一。子宮內(nèi)膜容受性與體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的成功與否具有較高相關(guān)性，通過中藥來提高子宮內(nèi)膜容受性逐漸成為被認(rèn)可的治療手段。針對二補(bǔ)助育湯開展的臨床及實(shí)驗(yàn)研究取得了較好的研究結(jié)果[1-6]，但關(guān)于該方的生物活性及其影響子宮內(nèi)膜容受性的確切作用機(jī)制仍在探索階段，中藥單體對藥物機(jī)制探討更有針對性。

骨碎補(bǔ)有補(bǔ)腎活血功用，骨碎補(bǔ)黃酮類化合物是其主要活性成分，柚皮苷為主要鑒定標(biāo)準(zhǔn)。故本實(shí)驗(yàn)選用骨碎補(bǔ)及其主要成分總黃酮、柚皮苷作為干預(yù)，以同源盒基因A10（Homobox Gene，HOX）、白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）以及整合素ανβ3等影響子宮內(nèi)膜容受性的公認(rèn)指標(biāo)開展研究，初步確定骨碎補(bǔ)影響子宮內(nèi)膜容受性的主要活性成分及作用機(jī)制，為后續(xù)相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用SPF級(jí)ICR小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2012-0001），8～12周齡，體質(zhì)量（25±2）g。對全部小鼠進(jìn)行陰道涂片，檢查動(dòng)情周期，連續(xù)觀察2個(gè)動(dòng)情周期正常者。

1.1.2 藥物

1）骨碎補(bǔ)：顆粒劑30 g、骨碎補(bǔ)總黃酮（強(qiáng)骨膠囊）（北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030007），購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥房;柚皮苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：N1007345），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2）GnRHa{醋酸曲普瑞林注射液，達(dá)必佳[輝凌制藥（Ferring GmbH），德國，進(jìn)口批號(hào)H20100365]};注射用尿促性素（HMG，國藥準(zhǔn)字H20033108）;注射用絨促性素（HCG，國藥準(zhǔn)字H44020674）。以上藥品均購自北京婦產(chǎn)醫(yī)院。

3）戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂，法國DELPHARM Lille股份有限公司，進(jìn)口批號(hào)：H20120368）;阿司匹林腸溶片（Bayer股份有限公司，國藥準(zhǔn)字J20130078）。以上藥品均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院。

1.1.3 試劑 抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，Dako Denmark A/S，貨號(hào)K5007;LIF（稀釋比1∶100;Novus，貨號(hào)：NBP2-27406）;整合素ανβ3（稀釋比1∶100;Abbiotec，貨號(hào)：251672）;引物序列及其內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）序列。見表1。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成7組，即：空白組、模型組、骨碎補(bǔ)組、骨碎補(bǔ)總黃酮組、柚皮苷組、西藥組I（補(bǔ)佳樂組）、西藥組II（阿司匹林組）。每組有小鼠10只。

造模方法：GnRHa+HMG+HCG。模型組，西藥組I（補(bǔ)佳樂組），西藥組II（阿司匹林組）、骨碎補(bǔ)組、骨碎補(bǔ)總黃酮組、骨碎補(bǔ)柚皮苷組，觀察上述各組小鼠陰道涂片，以動(dòng)情日為第1天，于每天上午9：00定時(shí)腹腔內(nèi)注射達(dá)必佳（GnRHa）40? IU/100 g體質(zhì)量，連續(xù)9 d，至第9天同時(shí)注射尿促性素（HMG）1 U/100 g體質(zhì)量，48 h后注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）10 IU/100 g體質(zhì)量，造成胚泡著床障礙模型。

1.2.2 給藥方法 于造模同步為空白組和模型組小鼠每天灌服生理鹽水0.2 mL，每日骨碎補(bǔ)組按0.03 g/20 g體質(zhì)量、骨碎補(bǔ)總黃酮組按0.02 g/20 g體質(zhì)量、骨碎補(bǔ)柚皮苷組按0.01 g/20 g體質(zhì)量的各自相應(yīng)濃度灌服（骨碎補(bǔ)以前期工作中取全方的中劑量，相當(dāng)于臨床成人劑量140 g/60 kg體質(zhì)量，總黃酮及柚皮苷劑量以其在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究關(guān)報(bào)道的有效劑量范圍取中值[7-8]），西藥組I每日灌服補(bǔ)佳樂6 μg/20 g體質(zhì)量（相當(dāng)于臨床體質(zhì)量60 kg的成人劑量2 mg/60 kg），西藥組II每日灌服阿司匹林225 μg/20 g體質(zhì)量（相當(dāng)于臨床體質(zhì)量60 kg的成人劑量75 mg/60 kg），連續(xù)10 d。

1.2.3 取材 在第11天處死小鼠（斷頸），取各組小鼠子宮，一角迅速放入液氮，以qPCR對各組小鼠子宮內(nèi)膜檢測HOXA-10 mRNA的表達(dá);另一角則于4%多聚甲醛中固定，以免疫組化HRP法，對各組小鼠子宮內(nèi)膜測定LIF、整合素ανβ3的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間比較采用單因素ANOVA。相對定量2-△△CT法分析計(jì)算各個(gè)樣本目的基因的表達(dá)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA表達(dá)情況

2.1.1 HOXA-10擴(kuò)增曲線和溶解曲線 從圖1和圖2可以看出，各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，且未見非特異性擴(kuò)增。

2.1.2 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA表達(dá)情況 各組正態(tài)性檢驗(yàn)P均大于0.10，均為正態(tài)（見表2）。方差齊性檢驗(yàn)P=0.03<0.05，各組方差不齊，取Welch檢驗(yàn)F′=6.603，P=0.011，P<0.05，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多重比較后，模型組表達(dá)明顯低于空白組（P=0.010）;與模型組比較，骨碎補(bǔ)組及總黃酮組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA表達(dá)明顯增加（與骨碎補(bǔ)組P=0.008，與總黃酮組P=0.009，P<0.05），與柚皮苷組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西藥組比較，骨碎補(bǔ)組、總黃酮組與補(bǔ)佳樂組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（與骨碎補(bǔ)組P=0.218，與總黃酮組P=0.245，P>0.05），柚皮苷組與阿司匹林組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.519>0.05）。

2.2 各組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)情況

2.2.1 顯微鏡100倍觀察到LIF在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá) 見圖3。

2.2.2 各組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)情況 在LIF表達(dá)中，各組正態(tài)性檢驗(yàn)P均大于0.10，均為正態(tài)。方差齊性檢驗(yàn)P=0.260>0.05，各組方差齊。ANOVA檢驗(yàn)F=95.217，P=0.000，P<0.05，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多重比較后，模型組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)明顯低于空白組（P=0.000）;與模型組比較，骨碎補(bǔ)組、總黃酮組及柚皮苷組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)明顯增加（P均等于0.000，P<0.05）;與西藥組比較，骨碎補(bǔ)組子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)與阿司匹林組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.488，P>0.05），但低于補(bǔ)佳樂組（P=0.006，P<0.05）;總黃酮組與骨碎補(bǔ)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084，P>0.05）。

2.3 各組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)情況

2.3.1 顯微鏡200倍觀察到整合素ανβ3在各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá) 見圖4。

2.3.2 各組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)情況?? 模型組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)明顯低于空白組（t=-7.355，P=0.000）;與模型組比較，骨碎補(bǔ)組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)明顯增加（t=2.684，P=0.017，P<0.05），而總黃酮組及柚皮苷組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，分別為t=-1.775，P=0.095，t=1.651，P=0.119）;骨碎補(bǔ)組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（骨碎補(bǔ)與補(bǔ)佳樂t=-1.781，P=0.093>0.05，骨碎補(bǔ)與阿司匹林t=-1.321，P=0.205>0.05）。見表4。

在小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)面積的對比中，總黃酮組及柚皮苷組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以針對小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)的積分光密度值（OD值），做進(jìn)一步比較。與模型組比較，總黃酮組OD值明顯增加（P<0.05），柚皮苷組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

3 討論

3.1 HOXA10、LIF及整合素ανβ3與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系 因本研究以單味藥及其成分作為干預(yù)手段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不如全方，而且側(cè)重于活性成分的初步探索，而并非子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)機(jī)制的因素探究，所以選用目前公認(rèn)的、可視為標(biāo)志性、并非探索性的指標(biāo)進(jìn)行研究，即HOXA 10、LIF和整合素ανβ3。

HOXA10的表達(dá)已被普遍認(rèn)為與子宮內(nèi)膜容受性具有密切關(guān)系，其以調(diào)節(jié)因子的身份在胞飲突形成、子宮內(nèi)膜容受性和胚胎植入等的建立過程中必不可少[9]。

LIF在胚胎移植中的子宮轉(zhuǎn)變?yōu)榻邮軤顟B(tài)、蛻膜化、胚泡生長、胚胎-子宮內(nèi)膜相互作用，以及免疫調(diào)制等諸多過程中均發(fā)揮重要的作用[10]，LIF被認(rèn)為是種植著床預(yù)測的金標(biāo)準(zhǔn)。

整合素ανβ3表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮的時(shí)間與植入窗期一致，子宮內(nèi)膜中低水平的整合素ανβ3與子宮內(nèi)膜容受性下降有關(guān)[11]，其作為細(xì)胞黏附分子，是衡量子宮內(nèi)膜容受性的一個(gè)公認(rèn)指標(biāo)。

3.2 骨碎補(bǔ)及其主要成分與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系 骨碎補(bǔ)原本是著名的一味骨傷科常用中藥，性味苦、溫，入肝、腎經(jīng)，功用補(bǔ)腎、活血，主治腎虛腰痛、跌打閃挫、骨傷、風(fēng)濕痹痛。二補(bǔ)助育湯為肖承悰教授治療子宮內(nèi)膜容受性低的經(jīng)驗(yàn)方，骨碎補(bǔ)就作為其君藥之一。全方補(bǔ)腎氣，通胞脈，臨床應(yīng)用取得良好療效[2-3]。

骨碎補(bǔ)的相關(guān)研究多集中于總黃酮和柚皮苷[7-8，12-14]。黃酮類化合物是骨碎補(bǔ)藥材的主要活性成分[12]。骨碎補(bǔ)總黃酮為天然的植物雌激素源，如強(qiáng)骨膠囊，即是以其為有效成分開發(fā)的藥品。在鑒定方面，除形態(tài)特征外，中藥骨碎補(bǔ)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)多參照柚皮苷的含量。骨碎補(bǔ)中的柚皮苷是其中重要的二氫黃酮類化合物，能夠發(fā)揮多種藥理活性作用，如成骨細(xì)胞誘導(dǎo)、抗過敏、抗病毒、抗氧化等[12]。在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，柚皮苷具有顯著的植物雌激素作用[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)組及總黃酮組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA表達(dá)明顯增加，柚皮苷組與西藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LIF表達(dá)方面，骨碎補(bǔ)組、總黃酮組及柚皮苷組均明顯增加;整合素ανβ3，骨碎補(bǔ)組能明顯提高表達(dá)，與西藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總黃酮能明顯提高OD值，使內(nèi)膜光密度增加，柚皮苷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

故我們推測，骨碎補(bǔ)改善子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制為上調(diào)HOXA-10 mRNA、LIF及整合素ανβ3的表達(dá)?？傸S酮作為骨碎補(bǔ)藥材的主要活性成分，亦可改善子宮內(nèi)膜容受性，而作為鑒定主要成分的柚皮苷，可能因?yàn)閯┝繂栴}，在此實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)的療效有限。

關(guān)于骨碎補(bǔ)對子宮內(nèi)膜容受性直接影響，目前尚未有相關(guān)報(bào)道，骨碎補(bǔ)在婦科方面最多見于婦女骨質(zhì)疏松的研究，所以沒有在子宮內(nèi)膜容受性方面可行的骨碎補(bǔ)有效成分及用量可參考。本實(shí)驗(yàn)初步探索，為此提供了依據(jù)，今后可將骨碎補(bǔ)有效成分細(xì)化，并設(shè)立梯度，開展進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]梁嘉玲，劉雁峰，申萌萌，等.二補(bǔ)助育湯對胚胎著床障礙模型小鼠子宮內(nèi)膜自噬基因Beclin-1、LC3B表達(dá)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，42（11）：910-915.

[2]石玥，劉雁峰，穆國華，等.二補(bǔ)助育改良方對反復(fù)體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜容受性的影響[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（9）：2514-2518.

[3]申萌萌，劉雁峰，梁嘉玲，等.二補(bǔ)助育湯對反復(fù)體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜超聲學(xué)指標(biāo)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，42（2）：167-170.

[4]申萌萌，劉雁峰，趙青竹，等.二補(bǔ)助育湯對胚胎著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突及環(huán)氧合酶-2表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（5）：2065-2069.

[5]石玥，吳麗婷，穆國華，等.二補(bǔ)助育湯及改良方對小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3、SCF mRNA及HOXA-10 mRNA表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（5）：1997-2000.

[6]石玥，穆國華，吳麗婷，等.二補(bǔ)助育改良方對小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突、LIF、ER和PR表達(dá)的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2017，10（4）：425-429.

[7]李建國，謝興文，李晶，等.骨碎補(bǔ)總黃酮防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2019，39（2）：229-233.

[8]張樂其，柳毅，徐高麗，等.中藥柚皮苷誘導(dǎo)成骨作用的研究進(jìn)展[J].口腔醫(yī)學(xué)，2016，36（3）：277-280.

[9]Bagot CN，Kliman HJ，Taylor HS.Maternal Hoxa10 is required for pinopod formation in the development of mouse uterine receptivity to embryo implantation[J].Dev Dyn，2001，222（3）：538-544.

[10]Salleh N，Giribabu N.Leukemia inhibitory factor：roles in embryo implantation and in nonhormonal contraception[J].Scientific World Journal，2014，2014：201514.

[11]Tan G，Guo W，Zhang B，etc.Temporary reduction and slow recovery of integrin ανβ3 in endometrium after uterine arterial embolization[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.2012，160（1）：66-70.

[12]錢茜.骨碎補(bǔ)化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志，2015，35（3）：186-188.

[13]封傳華，李剛，張靜，等.燙骨碎補(bǔ)中總黃酮及柚皮苷的含量測定[J].中國藥業(yè)，2016，25（1）：63-65.

[14]張新濤，江華基，梁祖儒，等.骨碎補(bǔ)總黃酮通過激活mTOR信號(hào)通路促進(jìn)大鼠腱骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國骨傷，2018，31（3）：248-253.

[15]楊利娟，黃君梅，王飛.何首烏、骨碎補(bǔ)和淫羊藿的植物雌激素作用研究[J].中藥與臨床，2012，3（13）：37-40.

（2020-03-24收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473721）;國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)肖承悰教授學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)研究及傳承工作室作者簡介：石玥（1988.02—），女，博士，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)婦科，E-mail：october5845@163.com通信作者：劉雁峰（1963.02—），女，博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)婦科，Tel：（010）84013157，E-mail：liuyaf8888@sina.com