近紅外二區(qū)成像中通過靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 早期診斷肝癌轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究

李 佳，李 勇，占美曉，忻勇杰，趙 煒，陸驪工

肝癌是全球第5 大常見惡性腫瘤，外科肝切除術(shù)是首選治療方法，然而目前術(shù)后復(fù)發(fā)率高［1］。肝腫瘤周邊伴有微轉(zhuǎn)移灶，肉眼難以識別，為手術(shù)徹底切除病灶帶來一定困難［2］。 近年實(shí)時光學(xué)手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)發(fā)展為此帶來新機(jī)遇，近紅外二區(qū)(second nearinfrared region，NIR-Ⅱ)成像較傳統(tǒng)近 NIR-Ⅰ成像穿透度更深、分辨率更高、自發(fā)熒光更少，故可極大提高術(shù)中成像靈敏度［3-4］。以肝癌高表達(dá)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican,GPC)-3 為靶點(diǎn)，通過特異性靶向多肽［5］與熒光探針相偶聯(lián)，可大大提高熒光探針主動靶向肝癌的能力。 本研究通過構(gòu)建靶向肝癌GPC-3 特異性NIR-Ⅱ熒光探針、肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型［6］并在體觀測NIR-Ⅱ熒光區(qū)，探討NIR-Ⅱ成像對肝癌微小轉(zhuǎn)移灶早期診斷的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

硝酸銀(AgNO3)、牛血清白蛋白(BSA)、氫氧化鈉(NaOH)、 硫化鈉 (Na2S)(北京伊諾凱科技公司)，GPC-3 抗體(ab129381,英國 Abcam 公司)，人 LO-2、HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細(xì)胞系(北京中源合聚生物科技公司)，多肽TJ12P1(杭州中肽生化公司)，NIRvana 640ST 型 NIR-Ⅱ成像系統(tǒng)、 IVIS LuminaⅡ型小動物光學(xué)成像系統(tǒng)(中國科學(xué)院分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

納米探針制備：BSA 用超純水配制濃度為0.5%白蛋白溶液，濃度為0.1 mmol/L 硝酸銀水溶液緩緩滴入10 mL 白蛋白溶液，避光反應(yīng)1 h；反應(yīng)溶液中逐滴加入0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液pH 至12；逐滴加入 0.4 mmol/L 硫化鈉水溶液，控制 Ag∶S離子摩爾比為1∶1，控制溫度40 ℃，避光反應(yīng)過夜；所得溶液置于截留分子量為100 kD 半透膜透析袋中進(jìn)行透析，冷凍干燥得到固體粉末；粉末重新溶解于磷酸緩沖液(PBS)，通過1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)交聯(lián)法偶聯(lián)多肽片段TJ12P1，得到納米探針Ag2S@BSATJ12P1。

基本表征檢測：采用JEM-1200EX 型透射電子顯微鏡(TEM)獲得納米探針形貌結(jié)構(gòu)電鏡圖，島津UV-3600 型紫外可見光分光光度計檢測紫外可見光吸收曲線，日立F-7000 型熒光分光光度計檢測熒光發(fā)射光譜。

穿透深度驗(yàn)證：配制 0.1 mol/L Ag2S@BSATJ12P1 和等量IRdye800-CW 溶液作為對照，制備不同厚度冰凍雞胸肉切片覆蓋樣本并進(jìn)行成像；采集780～900 nm 波段 NIR-Ⅰ信號和 1 100～1 300 nm 波段NIR-Ⅱ信號并采集數(shù)據(jù)，Light-field 軟件讀取信號值。

免疫印跡和免疫熒光驗(yàn)證：取對數(shù)期生長LO2、HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細(xì)胞于共聚焦培養(yǎng)皿中貼壁生長，與Cy-5 染料標(biāo)記的Ag2S@BSATJ12P1 共 孵 育 12 h；4',6- 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚(DAPI)對細(xì)胞核進(jìn)行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察樣本熒光，Imaris 圖像分析軟件計算平均光密度(OD,平均OD=積分OD/區(qū)域全面積)，取平均值。

另取上述細(xì)胞樣品加入放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液，進(jìn)行重懸，于冰上裂解30 min 行蛋白提取，依照電泳上樣量需要用水和5 倍體積上樣緩沖液(loading buffer)調(diào)整蛋白濃度，100℃煮沸變性,12%分離膠和5%濃縮膠行凝膠電泳，每孔上樣40 μg，控制濃縮膠恒壓 80 V，20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部；300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂奶粉封閉1 h，依次與一抗(1∶1 000)與二抗(1∶5 000)孵育，洗膜后暗室曝光、顯影并定影；以肌動蛋白(actin)為內(nèi)參，Quantity One v4.6.2 軟件讀取并記錄GPC-3 相對表達(dá)水平。

1.3 活體NIR-Ⅱ成像與病理學(xué)驗(yàn)證

收集對數(shù)生長期HCC-LM3 細(xì)胞，胰酶消化后用 PBS 重懸，調(diào)整濃度為 5×106個/mL，選取 6 周齡雄性Balb/c 小鼠并尾靜脈注射細(xì)胞懸液制備轉(zhuǎn)移模型，觀察小鼠體重及精神狀態(tài)變化。2 周后通過尾靜脈注射200 μg/mL Ag2S@BSA-TJ12P1 納米探針，分別在注射后 1、2、6、12、24、48 h 于 NIR-Ⅱ成像系統(tǒng)中成像。

2 結(jié)果

TEM 顯示Ag2S@BSA-TJ12P1 納米探針表征為量子點(diǎn)，粒徑約為10 nm(圖1①)；經(jīng)多肽修飾后，吸收光譜可見400 nm 左右處有一特征性吸收峰，證明多肽與 Ag2S 成功偶聯(lián)(圖 1②)；NIR-Ⅱ熒光光譜可見最大發(fā)射峰位于波長1 080 nm 處，處于NIR-Ⅱ譜段(圖 1③)；IRDye-800CW 作為 NIR-Ⅰ對照，采用不同厚度凍雞胸肉遮蓋樣品并測試熒光穿透深度顯示，NIR-Ⅱ熒光較NIR-Ⅰ熒光具有更強(qiáng)的穿透深度(6 mm 對 9 mm)(圖 1④)。

圖1 Ag2S@BSA-TJ12P1 納米探針表征

圖2 Ag2S@BSA-TJ12P1 可特異性靶向肝癌細(xì)胞

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細(xì)胞GPC-3 表達(dá)均顯著高于LO2 細(xì)胞(圖 2①)。 Cy-5 染料標(biāo)記納米探針 Ag2S@BSATJ12P1 并與4 種細(xì)胞共孵育后，激光共聚焦成像可見納米探針被 HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細(xì)胞特異性攝取，而LO2 細(xì)胞幾乎不攝取(圖2②)。

裸鼠注射納米探針后 1、2、6、12、24、48 h 成像顯示，探針首先富集于肝臟區(qū)域，12 h 后探針信號對轉(zhuǎn)移灶具有最佳信噪比，48 h 后信號基本消失(圖3①)；離體肝臟可見數(shù)枚直徑約1 mm 微小轉(zhuǎn)移灶，散在分布于肝表面(圖3②)；蘇木精-伊紅(HE)染色組織病理切片可見病灶內(nèi)大量異形細(xì)胞(圖3③)。

3 討論

肝癌早期以手術(shù)治療為主，中晚期治療包括介入為主的綜合治療［1,7］。 然而肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，診斷時多為中晚期。 肝癌外科手術(shù)過程中，術(shù)者判斷肝癌邊界通常依賴術(shù)中觸診和肉眼觀察，缺乏實(shí)時、客觀、有效的輔助方法。 活體熒光成像技術(shù)通過熒光靶向探針在腫瘤區(qū)域特異性富集，借助高靈敏度成像儀器，可在術(shù)中實(shí)時定位腫瘤，為術(shù)者徹底切除腫瘤提供實(shí)時反饋。 NIR-Ⅱ熒光成像(900～1 700 nm)與 NIR-Ⅰ熒光成像(750～900 nm)相比穿透強(qiáng)度更深，生物自發(fā)熒光更少，大大提高了腫瘤區(qū)域信噪比，有望突破現(xiàn)有光學(xué)手術(shù)導(dǎo)航的瓶頸［8-9］。 此外，熒光探針需與高特異性腫瘤抗體相耦合，以實(shí)現(xiàn)對腫瘤長效、穩(wěn)定標(biāo)記，滿足外科醫(yī)師對術(shù)中導(dǎo)航的時間要求。 近年研究表明，GPC-3 作為肝癌特異性標(biāo)志物在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，高達(dá)90%患者肝癌表面存在GPC-3 高表達(dá)，為肝癌精準(zhǔn)靶向與診療提供了重要證據(jù)［10］。

本研究所設(shè)計的Ag2S@BSA 納米探針在NIR-Ⅱ區(qū)具有優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)，將熒光探針與GPC-3 特異性靶向多肽TJ12P1 通過EDC-NHS 交聯(lián)法相耦合獲得靶向探針Ag2S@BSA-TJ12P1，大大增強(qiáng)了熒光探針靶向性，并實(shí)現(xiàn)了肝癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶長效、穩(wěn)定標(biāo)記。 裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本研究設(shè)計的Ag2S@BSA-TJ12P1 熒光探針與傳統(tǒng)NIR-Ⅰ熒光探針(IRdye800-CW)相比，NIR-Ⅱ成像具有更強(qiáng)的穿透深度，更少受到生物自發(fā)熒光干擾；在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ag2S@BSA-TJ12P1 熒光探針NIR-Ⅱ成像可成功觀測到最小為1 mm 肝癌轉(zhuǎn)移灶，并經(jīng)病理證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果在肝癌轉(zhuǎn)移灶精準(zhǔn)診斷及熒光手術(shù)導(dǎo)航方面具有一定的轉(zhuǎn)化前景。 但本研究也有局限性，所應(yīng)用的裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型模擬肝癌血行轉(zhuǎn)移病理情況，可能較人類肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移位置及特性存有一定差異，需要結(jié)合更多疾病動物模型加以驗(yàn)證，以及進(jìn)一步優(yōu)化靶器官成像時間窗等加以探討。