血清組織蛋白酶D檢測(cè)在非酒精性脂肪性肝病中的臨床意義

王茜青， 洪 娟， 杜 超， 褚慶華

（1.上海市浦東新區(qū)浦興社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科，上海 200129；2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝臟硬變性疾病，其疾病進(jìn)展與肝炎、肝纖維化乃至肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生相關(guān)[1]。目前，肝臟穿刺活檢是診斷NAFLD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于其有創(chuàng)，操作要求高，無法實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)的檢測(cè)需求，并存在一定的取樣誤差，無法作為NAFLD分級(jí)診斷的常規(guī)方法[2]。因此，臨床亟需用于NAFLD早期診斷及進(jìn)展評(píng)估的新型、敏感且特異的血清學(xué)指標(biāo)。組織蛋白酶家族是人溶酶體內(nèi)重要的水解酶家族，共有15個(gè)成員[3]，其中組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）是被發(fā)現(xiàn)最早，且報(bào)道最多的一個(gè)成員，不僅在溶酶體內(nèi)降解蛋白質(zhì)，還能分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用[4]。有研究結(jié)果顯示，CTSD不僅參與了炎癥反應(yīng)過程，同時(shí)也是脂質(zhì)堆積和代謝通路的重要功能蛋白，其與動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等多種慢性疾病的發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。目前，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）等血清學(xué)指標(biāo)已作為NAFLD的常規(guī)輔助診斷項(xiàng)目，但對(duì)于NAFLD的分級(jí)缺乏特異性和敏感性。因此，本研究擬探討CTSD、ALT、AST等指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在NAFLD中的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年3月—2019年3月同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院確診的NAFLD患者356例，年齡（48.87±6.98）歲，參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2018年更新版）》[1]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。按疾病嚴(yán)重程度將NAFLD患者分為輕度組（146例，其中男84例、女62例）、中度組（113例，其中男66例、女47例）和重度組（97例，其中男55例、女42例）。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）就診資料、治療經(jīng)過等病史記錄完整；（2）無飲酒史或飲酒折合乙醇量＜140 g/周（女性＜70 g/周）；（3）排除病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病等可導(dǎo)致脂肪肝的特定肝臟疾??；（4）排除藥物、甲狀腺功能減退以及與胰島素抵抗相關(guān)的綜合征等特殊情況；（5）排除正在服用或近期內(nèi)曾服用可導(dǎo)致肝臟酶譜升高的藥物者。選取同期同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院體檢健康者300名（正常對(duì)照組），其中男171名、女129名，年齡（47.58±5.66）歲，腹部B超、生化檢查均正常。本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

采用真空采血管采集所有對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，待自然凝集后1 000×g離心10 min，分離血清，置于-70 ℃保存，統(tǒng)一檢測(cè)。

1.3 方法

采用紫外連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)ALT、AST、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT），采用終點(diǎn)法檢測(cè)總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C），試劑盒均購(gòu)自瑞士羅氏公司，檢測(cè)儀器為cobas c702全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)CTSD，試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生公司，標(biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.974 6，線性范圍為46.88～3 000.00 pg/mL，最低檢測(cè)限為20.32 pg/mL，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為10%、12%。檢測(cè)儀器為ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。嚴(yán)格按試劑和儀器說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 7.0軟件及SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogrrov-Smimov檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析和Spearman等級(jí)相關(guān)分析評(píng)估各項(xiàng)目之間及與NAFLD嚴(yán)重程度的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估各項(xiàng)指標(biāo)診斷NAFLD的價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD組與正常對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

NAFLD組血清ALT、TC、TG、LDL-C、CTSD水平高于正常對(duì)照組（P＜0.01），且NAFLD各組之間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。NAFLD組血清AST、GGT水平高于正常對(duì)照組（P＜0.01），且NAFLD重度組高于中度組（P＜0.01）。NAFLD輕度組與正常對(duì)照組之間血清AST、GGT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 正常對(duì)照組與NAFLD組各項(xiàng)指標(biāo)的比較 ±s

表1 正常對(duì)照組與NAFLD組各項(xiàng)指標(biāo)的比較 ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與輕度組比較，#P＜0.01；與中度組比較，△P＜0.01

組別 例數(shù) ALT/（U/L） AST/（U/L） GGT/（U/L）NAFLD組 356 40.60±16.32* 35.21±13.86* 46.31±24.26*輕度組 146 31.34±8.06* 27.69±7.36* 34.15±14.34*中度組 113 40.09±9.05*# 32.65±8.58*# 45.95±18.46*#重度組 97 55.9±20.26*#△ 50.16±14.59*#△ 65.76±29.37*#△正常對(duì)照組 300 24.70±9.61 27.65±7.27 35.00±13.39組別 TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） LDL-C/（mmol/L） CTSD/（pg/mL）NAFLD組 1.95±0.50* 5.52±0.97* 3.65±0.55* 18.45±7.18*輕度組 1.61±0.30* 4.91±0.49* 3.38±0.33* 14.25±3.53*中度組 2.00±0.33*# 5.41±0.36*# 3.59±0.3*# 18.31±5.72*#重度組 2.44±0.47*#△ 6.67±0.73*#△ 4.19±0.46*#△ 25.24±7.58*#△正常對(duì)照組 1.01±0.48 2.81±1.37 1.95±1.00 7.20±3.76

2.2 血清CTSD水平與NAFLD嚴(yán)重程度的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清CTSD水平與NAFLD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。見圖1。

圖1 血清CTSD與NAFLD嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

2.3 血清CTSD與ALT、TC和LDL-C的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CTSD與ALT、TC、LDL-C呈正相關(guān)（r值分別為0.541、0.662、0.571，P＜0.01）。見圖2。

2.4 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.940、0.822、0.627，最佳臨界值分別為12.67、38.00、53.00，敏感性分別為76.97%、51.69%、34.55%、特異性分別為91.33%、93.00%、92.33%。CTSD與ALT聯(lián)合檢測(cè)診斷NAFLD的AUC為0.960，敏感性和特異性分別為88.48%和90.00%。見表2、圖3。

圖2 CTSD與ALT、TC和LDL-C的相關(guān)性分析

表2 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的ROC曲線參數(shù)

圖3 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的ROC曲線

3 討論

NAFLD是常見的慢性肝病，威脅著全世界20%～30%成人的身體健康[8]。大多數(shù)NAFLD患者合并有代謝性疾病，如肥胖、糖尿病及脂類代謝紊亂等。肝臟的脂肪變性在早期階段通過運(yùn)動(dòng)、飲食、藥物等的調(diào)節(jié)是可以逆轉(zhuǎn)的，因此NAFLD的早期診斷對(duì)于治療尤為關(guān)鍵[9]。The Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)顯示肝細(xì)胞內(nèi)富含CTSD蛋白。一項(xiàng)由美國(guó)、芬蘭合作的多中心研究結(jié)果顯示，在西方人群中，血漿CTSD水平與NAFLD的進(jìn)展密切相關(guān)，且可用于預(yù)測(cè)NAFLD的療效[10]。目前尚無我國(guó)人群CTSD水平與NAFLD分級(jí)關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，血清CTSD水平與NAFLD分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.800 5，P＜0.000 1），且與血清ALT水平呈正相關(guān)（r值分別為0.541，P＜0.01）。本研究結(jié)果還顯示，NAFLD輕度組血清CTSD水平高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；而作為脂肪肝輔助診斷指標(biāo)的ALT、AST，在正常對(duì)照組與NAFLD輕度組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，CTSD或可作為新的NAFLD輔助診斷指標(biāo)。

肝臟是合成、儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解脂質(zhì)的重要器官及場(chǎng)所，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。肝臟一旦發(fā)生脂質(zhì)代謝異常，脂質(zhì)沉積會(huì)引起肝細(xì)胞脂肪變性，同時(shí)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞損傷及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致NAFLD發(fā)生，嚴(yán)重者可發(fā)展為不可逆的肝病，如肝硬化、肝癌等。有研究結(jié)果顯示，非酒精性肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性炎癥疾病會(huì)引起巨噬細(xì)胞溶酶體膽固醇蓄積，而組織蛋白酶在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的通路中是不可或缺的重要蛋白[11-12]。本研究結(jié)果顯示，CTSD與TG、TC呈正相關(guān)（r值分別為0.662、0.571，P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

CTSD是溶酶體中主要的水解酶，存在于哺乳動(dòng)物所有的細(xì)胞和組織中，在細(xì)胞中發(fā)揮剪切、降解多種蛋白質(zhì)和多肽的作用，并參與免疫調(diào)控進(jìn)程。正常情況下，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂蛋白中的膽固醇通過溶酶體水解成為游離膽固醇，被釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，降解為膽汁酸前體。與膽固醇結(jié)合的溶酶體大量增加會(huì)引起溶酶體酶轉(zhuǎn)運(yùn)通路的紊亂，從而使血液中的溶酶體酶水平升高。在高膽固醇環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)的CTSD水平升高并定位于細(xì)胞膜附近，極易被釋放入血。這就導(dǎo)致在肝臟脂肪變性的過程中，血清CTSD水平升高。有研究結(jié)果顯示，CTSD參與了炎癥反應(yīng)及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路的調(diào)節(jié)[13]。WALENBERGH等[14]的研究結(jié)果顯示，血漿CTSD水平與兒童NAFLD密切相關(guān)。MOALLEM等[15]的研究結(jié)果顯示，CTSD與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度有關(guān)，可作為動(dòng)脈粥樣硬化新的指標(biāo)，CTSD水平還與溶酶體貯積癥的發(fā)病有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD組血清CTSD水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），且與NAFLD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清CTSD診斷NAFLD的效能優(yōu)于ALT及GGT，且可用于鑒別診斷早期NAFLD，更適合于亞健康人群的篩查。

綜上所述，CTSD與NAFLD的進(jìn)展密切相關(guān)，或可作為NAFLD早期診斷及分級(jí)的標(biāo)志物，與ALT聯(lián)合檢測(cè)有助于NAFLD的早期診斷和干預(yù)。