番茄莖基腐病病原菌分離及其防治藥劑篩選

尉菊萍　王洪梅　劉磊　呂令華

摘要：為篩選防治番茄莖基腐病的有效藥劑，本研究從番茄病株中分離病原菌，測定其致病性，同時評價9種市售藥劑對該病病原菌的室內(nèi)毒力，并從中選擇室內(nèi)毒力大的藥劑進行番茄莖基腐病的田間防效試驗。結(jié)果表明：番茄莖基腐病的病原菌歸屬于細菌;9種供試藥劑中，50%琥銅·霜脲氰WP的毒力最大，EC50為432.76 mg/L，高濃度下的抑制率可達100%;田間試驗結(jié)果表明該藥劑防治莖基腐病的效果最好，能顯著降低病株率，防效達85.71%。因此，50%琥銅·霜脲氰WP對番茄莖基腐病病原菌具有較好的抑制作用，可作為田間防治該病的候選藥劑。

關(guān)鍵詞：番茄莖基腐病;致病性測定;毒力測定;防治效果

中圖分類號：S482.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2020）05-0105-05

Abstract In order to screen out effective bactericides for tomato stem-based rot， the pathogenic strains were isolated from infected plants， and their pathogenicity was determined. The effect of 9 common bactericides in the market on tomato stem-based rot was determined in laboratory in order to screen the effective one for field tests. The results showed that the pathogen of tomato stem-based rot belonged to bacteria. Among the 9 tested bactericides， 50% cuprous succinate·hydrocyanide had the most virulence with the EC50 as 432.76 mg/L， and its inhibition rate was 100% under high concentration. The results of field experiment also showed that 50% cuprous succinate·hydrocyanide WP had the best control effect on stem-based rot， which could significantly decrease the diseased plant rate with the control efficiency as 85.71%. Therefore， 50% cuprous succinate·hydrocyanide WP had better inhibitory effect on the pathogen of tomato stem-based rot， so it could be used as a candidate agent for controlling tomato stem-based rot in field.

Keywords Tomato stem-based rot; Pathogenicity test; Toxicity determination; Control effect

近年來，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及市場需求的增加促進了設(shè)施番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。但由于全球氣候變暖，同時缺乏合理的輪作倒茬制度，番茄莖基腐病發(fā)生程度逐年加重，果實品質(zhì)和產(chǎn)量受到嚴重影響。這已成為限制設(shè)施生產(chǎn)的重要問題。番茄莖基腐病主要危害植株莖基部，一般在第1～3穗果時發(fā)生，發(fā)病初期莖基部土表以上3～5 cm處出現(xiàn)深褐色病斑[1]，莖稈發(fā)病部位向內(nèi)凹陷、皮層腐爛，地上部葉片變黃，出現(xiàn)中午萎蔫、早晚恢復(fù)的現(xiàn)象[2]，但后期萎蔫不能恢復(fù)，直至整株枯死[3，4];病部常形成黑褐色、大小不一的菌核[5]，可蔓延至主側(cè)根，濕度大時上有白色霉層出現(xiàn)[6]。該病是土傳病害，病菌在土壤中越冬，腐生性強，可在土中生存2～3年[7，8]。

導(dǎo)致番茄植株發(fā)生莖基腐病的因素有很多，如高溫、田間管理粗放、根莖部有傷口等。另外，秧苗定植后澆水過多、土壤黏重、通風(fēng)排濕不暢等也會引起該病發(fā)生[2]。特別是大棚越夏番茄定植時，正處于高溫時期，土壤水分蒸發(fā)快，加之澆水過多，可形成高溫高濕的棚內(nèi)環(huán)境，極易引起植株發(fā)病。輕者病株率為5%～10%，一般為20%～30%，嚴重時達50%以上。目前，化學(xué)防治仍是防治番茄莖基腐病的主要方法。祁凱等[3]研究不同藥劑對番茄莖基腐病室內(nèi)活性的影響時發(fā)現(xiàn)，雙胍三辛烷基苯磺酸鹽抑菌活性最強，可應(yīng)用于生產(chǎn)。王廣印等[9]采用“可立克”藥肥對秋番茄秧苗進行噴灌根處理后莖基腐病發(fā)病率為零，“棉隆+生物菌”處理土壤可使發(fā)病率降低79.62%。本研究對番茄莖基腐病病原菌進行分離和致病性測定，評價9種市售藥劑對該病病原菌的室內(nèi)毒力，并選擇室內(nèi)毒力大的藥劑進行番茄莖基腐病的田間防效試驗，以期篩選出有效、可用于生產(chǎn)的番茄莖基腐病防治藥劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種菏粉2號，正常植株和病株均種植于菏澤市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜試驗田，病株具有典型莖基腐病表現(xiàn)。

供試YEB液體培養(yǎng)基：每升含牛肉浸膏5.0 g、酵母浸膏1.0 g、蛋白胨5.0 g、蔗糖5.0 g、MgSO4·H2O 0.5 g。YEB固體培養(yǎng)基：在上述配方基礎(chǔ)上加入15.0 g瓊脂。以上兩種培養(yǎng)基均經(jīng)121℃滅菌20 min后用于病原菌的分離、純化及培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

供試藥劑：25%嘧菌酯懸浮劑，江西歐美生物科技有限公司產(chǎn)品;32.5%苯甲·嘧菌酯懸浮劑，江西眾和化工有限公司產(chǎn)品;240 g/L噻呋酰胺懸浮劑，江西眾和化工有限公司產(chǎn)品;30%烯酰·甲霜靈水分散粒劑，廣東中迅農(nóng)科股份有限公司產(chǎn)品;50%琥銅·霜脲氰可濕性粉劑，河北省萬泉農(nóng)藥廠產(chǎn)品;50%氯溴異氰尿酸可溶粉劑，南京南農(nóng)農(nóng)藥科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;30%惡霉靈水劑，中農(nóng)立華（天津）農(nóng)用化學(xué)品有限公司產(chǎn)品;30%甲霜·噁霉靈水劑，中農(nóng)立華（天津）農(nóng)用化學(xué)品有限公司產(chǎn)品;12%中生菌素可濕性粉劑，福建凱立生物制品有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌的分離與純化 將病株在自來水下沖洗干凈，75%酒精浸泡30 s;再置于無菌操作臺中，用滅菌刀片切取莖基部病健交界處1 cm左右莖段，放入YEB液體培養(yǎng)基，于37℃、200 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)12 h。使用滅菌接種環(huán)蘸取上述培養(yǎng)溶液，采用平板劃線法，涂布于YEB固體培養(yǎng)基上，28℃、黑暗、倒置培養(yǎng)12 h。挑選具有代表性的單菌落進行純化培養(yǎng)，對純化后的目標菌株編號，并采用斜面保存法，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病原菌致病性測定根據(jù)柯赫氏法則進行接種試驗[10]，測定純化菌株的致病性。具體步驟如下：將純化菌株培養(yǎng)12 h后配制成菌懸液，接種前澆足水，用玻璃棒在距莖基部2 cm處扎1個深約3 cm的孔，用移液槍將10 mL菌懸液注入孔內(nèi)[11]，以無菌水為對照，重復(fù)3次，每重復(fù)包含10株幼苗。接種后置于溫室中培養(yǎng)，白天24～27℃、夜間20～22℃，常規(guī)水分管理，7 d后調(diào)查發(fā)病情況，觀察是否出現(xiàn)褐色病斑、萎蔫和腐爛等癥狀，并計算發(fā)病率。將發(fā)病部位按照1.2.1的方法再進行分離培養(yǎng)，觀察該部位分離得到的病菌與接種菌是否一致。

1.3.3 供試藥劑的室內(nèi)毒力測定采用生長速率法進行室內(nèi)毒力測定[12]。將各藥劑用無菌水分別配制成10倍于試驗所需濃度（表1）的母液，以1∶9的體積比分別加至不同的YEB培養(yǎng)基（滅菌后冷卻至45℃）中，充分搖勻后制成含藥平板，以加入等量無菌水的為對照，重復(fù)3次。

取涂布培養(yǎng)病原菌的YEB固體培養(yǎng)基，用直徑0.5 cm的打孔器打取菌餅，再用接種針挑取菌餅至含藥平板中央。28℃黑暗培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率。計算公式：

對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑-菌餅直徑×100 。

根據(jù)藥劑濃度與菌落直徑的關(guān)系，將藥劑抑制率轉(zhuǎn)換成抑制幾率值（y），藥劑各濃度轉(zhuǎn)換成以10為底的對數(shù)值（x），計算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值。

1.3.4 田間防治試驗于菏澤市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜試驗田大拱棚進行。選擇室內(nèi)毒力試驗中毒力較大的50%琥銅·霜脲氰WP、30%甲霜·噁霉靈AS和30%惡霉靈AS，按照田間推薦使用濃度配制上述藥劑，即50%琥銅·霜脲氰WP 700倍液、30%甲霜·噁霉靈AS 1 000倍液、30%惡霉靈AS 1 000倍液，育苗前以1∶500的比例拌入基質(zhì)土壤，并在定植當天灌至幼苗根部[11]。每株灌入50 mL，以澆等量水為對照，每處理重復(fù)3次。小區(qū)面積20 m2，定植75株番茄幼苗，隨機區(qū)組排列。15 d后記錄發(fā)病株數(shù)，并計算病株率和防效[13]。計算公式：

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013和DPS 15.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌培養(yǎng)性狀觀察

在YEB固體培養(yǎng)基上28℃、黑暗、倒置培養(yǎng)12 h后，病原菌單菌落直徑為0.1～0.2 cm;菌落呈圓形、乳白色，表面光滑隆起，邊緣整齊;菌落聚集區(qū)域培養(yǎng)基不變色（圖1）。

2.2 病原菌致病性測定

由圖2可以看出，接種7 d后，番茄幼苗表現(xiàn)出明顯的感病特征。與對照相比，感病幼苗發(fā)生萎蔫，長勢較弱，葉片變黃，莖基部中空纖細，出現(xiàn)褐色病斑且有輕微腐爛現(xiàn)象。這與田間感染番茄莖基腐病植株表現(xiàn)癥狀一致。經(jīng)計算，3個重復(fù)的發(fā)病率分別為80%、90%、80%，平均發(fā)病率為83.33%（表2）。

挑取上述病株發(fā)病部位進行病菌分離、培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，該病菌與接種菌形態(tài)基本一致，根據(jù)柯赫氏法則，判定該菌為番茄莖基腐病病原菌。

2.3 供試藥劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果

由表3可以看出，培養(yǎng)7 d后，對照的菌落直徑為1.44 cm，各藥劑處理的則在0.50～1.40 cm之間，因此，不同藥劑對菌落生長均有一定抑制作用。

藥劑使用濃度越高，對番茄莖基腐病病原菌的抑制率越大，且部分藥劑在不同濃度下的抑制率差異達顯著水平。9種藥劑中，50%琥銅·霜脲氰WP對病原菌的抑制效果最好，高濃度（1 440 mg/L）下的抑制率達到100%，低濃度（480 mg/L）下的抑制效果較差;30%甲霜·噁霉靈AS的抑制效果次之，其在160、320、480 mg/L時的抑制率分別為38.21%、58.80%、78.23%;12%中生菌素WP抑制效果最差，其在160、320、480 mg/L時的抑制率僅為4.93%、7.05%、27.12%。

EC50可用來表示藥劑的毒力大小，其值越小，毒力越大。由表3可以看出，30%烯?！ぜ姿`WG的EC50值最高，為11 492.12 mg/L，毒力最小;50%琥銅·霜脲氰WP的EC50值為432.76 mg/L，毒力最大，是30%烯?！ぜ姿`WG的27倍;30%惡霉靈AS的EC50值為492.82 mg/L，毒力較大，是30%烯?！ぜ姿`WG的23倍;30%甲霜·噁霉靈AS的EC50值為569.39 mg/L，毒力也較大;其余藥劑的毒力一般。

2.4 田間防治試驗結(jié)果

由表4可以看出，對照的番茄幼苗發(fā)病率較高，病株率達28.00%，顯著高于施藥處理。施藥15 d后，3種藥劑對莖基腐病都有一定的防治效果，其中，50%琥銅·霜脲氰的病株率最低，僅為4.40%，防效達85.71%，顯著高于其它藥劑處理;30%甲霜·噁霉靈與30%惡霉靈之間的防效差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

本試驗通過對試驗田內(nèi)番茄莖基腐病病株進行病原菌的分離純化和柯赫氏法則驗證，確定分離菌株為番茄莖基腐病病原菌。經(jīng)觀察，該病原菌的菌落形態(tài)同細菌一致，且病株病斑處無白色霉層及菌核出現(xiàn)，進而推斷其歸屬于細菌界。吳麗敏[7]、張怡[14]等認為番茄莖基腐病病原菌分別為茄絲核菌（Rhizoctonia solani）和鐮孢屬茄鐮孢，均屬于真菌。這與本試驗結(jié)果明顯不同，分析其原因可能是莖基腐病的病原菌并非僅有一種，可能既包括細菌，也包括真菌。而本試驗得到的病原菌形態(tài)上更接近細菌，推測可能與植株移栽方式、土壤環(huán)境及取樣時期有關(guān)。后續(xù)研究將對該病原菌進行分子生物學(xué)鑒定加以驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)9種供試藥劑對番茄莖基腐病病原菌均有一定抑制作用，且抑制能力與藥劑使用濃度正相關(guān)。其中50%琥銅·霜脲氰WP表現(xiàn)出較強的抑制效果，高濃度下的EC50值最低，毒力最大，抑制率可達100%。田間試驗結(jié)果同樣表明50%琥銅·霜脲氰WP防治番茄莖基腐病的效果最好，可有效降低病株率，防效達85.71%，顯著高于其它藥劑。綜合來看，9種供試藥劑中50%琥銅·霜脲氰WP對番茄莖基腐病的防治效果最佳，30%惡霉靈AS和30%甲霜·噁霉靈AS較好。

50%琥銅·霜脲氰主治細菌性病害，生產(chǎn)上多用于防治黃瓜霜霉病和細菌性角斑病，尚未有關(guān)于防治番茄莖基腐病的研究報道。本研究中，番茄莖基腐病的病原菌屬于細菌，所以該藥劑的防治效果較好，具體作用機理仍有待于進一步研究。此外，霜脲氰在土壤中消解速度較快，屬于易降解農(nóng)藥，使用后對蔬菜較安全[15，16]。因此，50%琥銅·霜脲氰可濕性粉劑可作為田間防治番茄莖基腐病的候選藥劑，但在生產(chǎn)中還應(yīng)該結(jié)合調(diào)整倒茬制度、加強田間管理等方法進行綜合防治。

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