蘆筍對宮頸癌細胞的作用研究

范雅麗，王建東，周春曉，黃裕,3，張心

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院婦瘤科，北京 100006； 2.北卡羅萊納大學教堂山分校萊恩伯格醫(yī)學腫瘤中心，美國 北卡羅來納州 27519； 3.重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，重慶 400030)

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，世界范圍內每年因宮頸癌致死人數(shù)近30萬，我國約為3萬[1-2]。近年來隨著研究的進展，宮頸癌發(fā)病的高危因素逐漸明確，目前臨床已采取了預防性的宮頸癌篩查，但仍有30%的患者就診時已為晚期，此類患者的中位生存期僅為8～13周[3]。臨床上，尚無晚期宮頸癌的標準治療原則[3]，仍只能選擇同步放化療，化療方案以鉑類制劑為主，聯(lián)合其他藥物，患者的5年生存率未見提高[4-5]。因此，尋找其他可靠高效的化療藥物，提高晚期患者的生存率是臨床亟待解決的難題。

蘆筍是一種流行于世界各地的食品，早期研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍可用于治療糖尿病[6]；還可用于治療癲癇、胃潰瘍、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病[7]。另有文獻報道，蘆筍抑制炎癥因子白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α的分泌，促進一氧化氮的釋放，誘導應激，促進皮質醇的產生，起到抗炎作用[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍可抑制腫瘤細胞增殖，用于癌癥治療[7]。本研究旨在探討蘆筍對宮頸癌細胞的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌細胞系HeLa、SiHa細胞(美國菌種保藏中心細胞庫)、HeLa細胞培養(yǎng)液Dulbecco改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)(美國Gibco公司，批號：11960044)、SiHa細胞培養(yǎng)液為含有核苷抗生素的α-MEM(α-Minimal Essential Medium)(美國Gibco公司，批號：12571071)、胎牛血清(美國Corning公司，批號：35-015-CV)、噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美國密蘇里州圣路易斯公司，批號：298-93-1)、抗生素(包括抗鏈霉素、抗青霉素，美國Sigma公司，批號：A5955)、0.05%胰蛋白酶(美國Gibco公司、批號：SM-2002)、層粘連蛋白(美國Sigma公司)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-A Kit(美國Sigma公司，批號：V4512)以及70 Bix蘆筍(中國山東碩一生物技術有限公司)。

1.2實驗器皿和儀器 實驗器皿：移液管(美國Corning公司)、移液槍(美國Eppendorf公司)。20～200 μL、1 000 μL槍頭(美國VWR公司)、25 mL移液皿(美國Biotix公司)、(100×20) mm直徑培養(yǎng)皿(美國Corning公司)、(60×15) mm直徑培養(yǎng)皿(美國Falcon公司)、96孔板(美國Genesee Scientific公司)、10 mL、50 mL離心管(美國Corning公司)。實驗儀器離心機(美國Eppendorf公司)、37 ℃恒溫水浴箱(美國Precision公司)、電子秤(美國Denver Instrument公司)、Infinite?200 PRO酶標儀(美國Tecan公司)。識別軟件為i-control 1.9(for infinite reader)。

1.3細胞培養(yǎng) 本實驗選用HeLa、SiHa兩個宮頸癌細胞系，其中HeLa細胞生長需要10% DMEM培養(yǎng)液，SiHa細胞選用10%的α-MEM培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)，放置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。300 mmol/L的右旋谷氨酰胺、10 000 U/mL的青霉素和10 000 μg/mL的鏈霉素混合不同濃度的血清，配制所需要的培養(yǎng)液。

1.4細胞增殖實驗 在96孔板中按照每孔4 000個細胞的比例培養(yǎng)宮頸癌SiHa、HeLa細胞，24 h后加入0.01、1、5、10 mg/mL濃度的蘆筍，同時設計空白對照組。孵箱培養(yǎng)72 h，每孔加入5 mg/mL MTT染劑，孵育1 h后，每孔再加入100 μL二甲基亞砜，充分混勻使結晶物溶解，利用酶標儀測定575 nm波長下的光密度(optical density，OD)值。實驗重復3次，取每組OD值平均值，比較相對OD值，即各組OD值平均值/對照組OD值平均值。

1.5細胞黏附實驗 將1 μg/mL的層粘連蛋白按照每孔50 μL的比例鋪滿96孔板，置于4 ℃冰箱保存24 h。在96孔板中每孔加入100 μL緩沖液，封閉其他非特異性蛋白位點，放于37 ℃ 45 min，用平衡鹽溶液進行沖洗。按照每孔50 μL，1.5×105個細胞/mL的比例，將細胞接種于96孔板中，同時每孔加入50 μL的0.1、0.75、2.5 mg/mL濃度的蘆筍和空白對照。孵育45 min、60 min、90 min。加入細胞固定液30 min，用平衡鹽溶液清洗3遍，加入龍膽紫染液作用20 min，加入10%甲酸終止反應，測量550 nm波長下的黏附細胞數(shù)量。實驗重復3次，取每組黏附細胞數(shù)量的平均值，比較相對黏附細胞數(shù)量，即各組黏附細胞數(shù)量平均值/對照組黏附細胞數(shù)量平均值。

1.6細胞劃痕實驗 按照3.5×105個細胞/孔的比例接種到六孔板中。24 h后，使用200 μL移液槍的槍頭沿孔板垂直方向劃線，形成“十字形”的劃痕。用磷酸鹽緩沖液清洗，加入培養(yǎng)液同時設置0.1、0.75、2.5 mg/mL濃度的蘆筍實驗組和空白對照組，藥物作用48 h后拍照，實驗重復3次，取每組劃痕寬度平均值，比較各組相對劃痕寬度，即劃痕寬度平均值/對照組劃痕寬度平均值。

1.7酶聯(lián)免疫吸附測定實驗 按照每孔2.5×105的比例將SiHa、HeLa細胞接種于六孔板中。細胞密度達到70%～80%，按照空白對照、0.1、0.75、2.5 mg/mL蘆筍濃度分組處理細胞，將收集的藥物作用不同時間段(6、8、12、18 h)的細胞培養(yǎng)液置于-20 ℃。將0.50 μg/mL特異性VEGF捕獲抗體加入96孔板中，每孔100 μL，室溫下靜置24 h后，每孔加入300 μL的封閉緩沖液作用1 h，封閉其他非特異性抗體，用沖洗液沖洗4次。將對照組和不同蘆筍濃度實驗組樣品離心15 min，每組設置4孔，每孔加入樣品100 μL，樣品與特異性抗體作用2 h；沖洗4次，每孔加入0.125 μg/mL的檢測抗體100 μL，作用2 h；沖洗4次，每孔加入0.05 μg/mL生物素HRP 100 μL作用30 min，放大信號；沖洗4次，每孔加入100 μL的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液，室溫放置20 min，每孔加入1 mol/L鹽酸100 μL終止反應，測量450 nm以及620 nm波長下每孔培養(yǎng)液中VEGF-A的表達量，實驗重復3次，取每組VEGF-A表達量平均值，比較相對VEGF-A表達量，即各組VEGF-A表達量平均值/對照組VEGF-A表達量平均值。

2 結 果

2.1不同蘆筍濃度作用下HeLa細胞和SiHa細胞的72 h相對OD值比較 不同蘆筍濃度作用下HeLa細胞和SiHa細胞的72 h相對OD值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，0.01、1、5、10 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞的72 h相對OD值均降低(P<0.01)；與0.01 mg/mL組相比，1、5、10 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞的72 h相對OD值均降低(P<0.01)；與1 mg/mL組相比，5、10 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞的72 h相對OD值均降低(P<0.01)；與5 mg/mL組相比，10 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞的72 h相對OD值降低(P<0.01)。見表1。

組別HeLa細胞 SiHa細胞 對照組1 1 0.01 mg/mL組0.811±0.076a0.817±0.025a1 mg/mL組0.573±0.042ab 0.546±0.182ab5 mg/mL組 0.204±0.110abc 0.159±0.041abc10 mg/mL組 0.148±0.053abcd0.096±0.019abcdF值28.900 35.000 P值<0.001 <0.001

OD：光密度；a與對照組比較，P<0.01；b與0.01 mg/mL組比較，P<0.01；c與1 mg/mL組比較，P<0.01；d與5 mg/mL組比較，P<0.01

2.2不同濃度蘆筍作用下HeLa細胞和SiHa細胞的60 min相對黏附細胞數(shù)量比較 不同蘆筍濃度作用60 min后，HeLa細胞和SiHa細胞相對黏附細胞數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，0.1、0.75、2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞相對黏附細胞數(shù)量均降低(P<0.01)；與0.1 mg/mL組相比，0.75、2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞相對黏附細胞數(shù)量均降低(P<0.01)；與0.75 mg/mL組相比，2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞相對黏附細胞數(shù)量均降低(P<0.05)。見表2。

2.3不同蘆筍濃度作用下HeLa細胞和SiHa細胞的相對劃痕寬度比較 不同蘆筍濃度作用下HeLa細胞和SiHa細胞的相對劃痕寬度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，0.1、0.75、2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞的相對劃痕寬度均增加(P<0.01)；與0.1 mg/mL組相比，0.75、2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞相對劃痕寬度均增加(P<0.01)；與0.75 mg/mL組相比，2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞的相對劃痕寬度均增加(P<0.01)，見表3。0.75 mg/mL組HeLa細胞劃痕寬度是對照組的1.7倍，SiHa細胞劃痕寬度是對照組1.6倍；2.5 mg/mL組HeLa細胞的劃痕寬度是對照組的2.07 倍，SiHa細胞的劃痕寬度是對照組的3.3倍，見圖1。

組別HeLa細胞 SiHa細胞 對照組1 1 0.1 mg/mL組0.922±0.047a0.964±0.016a0.75 mg/mL組0.861±0.041ab0.897±0.024ab2.5 mg/mL組0.725±0.029abc0.845±0.022abcF值33.800 42.600 P值<0.001 <0.001

a與對照組比較，P<0.01；b與0.1 mg/mL組比較，P<0.01；c與 0.75 mg/mL組比較，P<0.05

組別HeLa細胞 SiHa細胞 對照組1 1 0.1 mg/mL組1.093±0.106a1.199±0.010a0.75 mg/mL組1.607±0.096ab1.705±0.007ab2.5 mg/mL組3.339±0.017abc2.072±0.220abcF值25.200 36.300 P值<0.001 0.012

a與對照組比較，P<0.01；b與0.1 mg/mL組比較，P<0.01；c與 0.75 mg/mL組比較，P<0.01

2.4不同蘆筍濃度作用下HeLa細胞和SiHa細胞24 h培養(yǎng)液VEGF-A相對表達量比較 不同蘆筍濃度作用下HeLa細胞和SiHa細胞24 h培養(yǎng)液中VEGF-A相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，0.1、0.75、2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞24 h培養(yǎng)液中VEGF-A相對表達量均降低(P<0.01)；與0.1 mg/mL組相比，0.75、2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa細胞24 h培養(yǎng)液中VEGF-A相對表達量均降低(P<0.01)；與0.75 mg/mL組相比，2.5 mg/mL組HeLa細胞和SiHa 細胞24 h培養(yǎng)液中VEGF-A相對表達量均降低(P<0.01)，見表4。

組別HeLa細胞SiHa細胞對照組1 1 0.1 mg/mL組0.877±0.065a0.821±0.083a0.75 mg/mL組0.642±0.038ab0.741±0.049ab2.5 mg/mL組0.466±0.128abc0.669±0.041abcF值30.800 14.700 P值<0.001 <0.001

VEGF-A：血管內皮生長因子A；a與對照組比較，P<0.01；b與0.1 mg/mL組比較，P<0.01；c與0.75 mg/mL組比較，P<0.01

3 討 論

2009—2011年，我國72個癌癥登記處的數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，宮頸癌的發(fā)病率占整個生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的46.1%，死亡率高達40.8%[9]。初診時約5%的宮頸癌患者已達到國際婦產科聯(lián)盟Ⅳ期[10]。臨床上，ⅠA、ⅠB期宮頸癌患者術后5年生存率高達80%；而局部晚期和晚期轉移宮頸癌患者由于腫瘤范圍較大、脈管浸潤、遠處轉移等無法進行手術治療，只能采用化療為主、同步放療的手段治療。但目前臨床上化療藥物單一，順鉑仍是公認的最有效的化療藥物，有效率為13%～23%，其他化療藥物如紫杉醇、拓撲替康并沒有表現(xiàn)出優(yōu)于順鉑的抗腫瘤活性，在相繼出現(xiàn)的新型單克隆靶向藥物(貝伐珠單抗、帕唑帕尼、吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗、尼妥珠單抗等)中，只有貝伐珠單抗被推薦用于宮頸癌的治療[11]。臨床上，順鉑聯(lián)合其他藥物(聯(lián)合紫杉醇、長春瑞濱、拓撲替康等)，可減少化療毒副作用，提高療效，但患者的中位總生存時間和中位無疾病進展生存時間并未提高[12]。

圖1 細胞劃痕實驗

尋找新型高效的化療藥物成為臨床晚期宮頸癌治療的急切需求。近年研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍可用于惡性腫瘤的治療。蘆筍的根部、蘆筍葉及果實提取物中已鑒定和分離出許多具有生物活性的植物化學物質，皂苷和黃酮類物質是蘆筍發(fā)揮作用的主要成分[13]。蘆筍提取物通過抑制致癌基因PRCCTFE3轉錄抑制腎癌、乳腺癌細胞的增殖，進而誘導腎癌細胞的凋亡[14-15]。蘆筍作用于肺癌和膀胱癌細胞48、72 h，MTT結果顯示腫瘤細胞的增殖受到抑制[16]。此外，蘆筍也可用于結腸癌的治療[17]。

有文獻報道，0.5～2 mg/mL蘆筍能夠抑制腫瘤增殖[15]。本研究結果顯示，不同濃度蘆筍均可抑制宮頸癌細胞的增殖。有文獻顯示，蘆筍作用于不同腫瘤細胞(乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌細胞)的增殖，對上述4種不同腫瘤細胞的半數(shù)致死量為6～79 mg/mL[18]。本研究中，蘆筍作用于宮頸癌HeLa、SiHa細胞的半數(shù)致死量均<2 mg/mL，由此可見，蘆筍對宮頸癌的毒性作用較大，低濃度蘆筍即可有效抑制宮頸癌細胞的增殖。

浸潤轉移是惡性腫瘤的標志，也是惡性腫瘤細胞的復雜綜合作用過程[19]。腫瘤細胞浸潤是發(fā)生轉移的基礎[19]，同時腫瘤微環(huán)境在腫瘤轉移過程中起到至關重要的作用，如腫瘤相關纖維細胞、腫瘤相關巨噬細胞均在腫瘤細胞轉移過程中分泌多種細胞因子[20]。VEGF作為重要的細胞因子，可促進血管形成和傷口愈合。正常組織內的促血管內皮細胞生長因子和抗血管內皮細胞生長因子同時存在，并處于平衡狀態(tài)，能夠維持人體脈管的正常生成和分化。在致癌因素作用下，腫瘤細胞中促血管內皮細胞生長因子的數(shù)量激增，遠遠超過抗血管內皮細胞生長因子的作用，出現(xiàn)促血管內皮細胞生長因子和抗血管內皮細胞生長因子的失衡，導致以血管為主的脈管大量生長，這為腫瘤的生長提供了優(yōu)越的環(huán)境，促進了腫瘤的進展和轉移。同時，VEGF通過抑制樹突細胞、T細胞的抗原呈遞，導致腫瘤細胞出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象，使殘存腫瘤細胞不能被完全清除。大量研究證實了VEGF在腫瘤進展中的作用，其主要作用成分是VEGF-A[21-25]，用于腫瘤治療的VEGF單克隆靶向藥物也受到關注[26]。

目前，有關蘆筍對腫瘤細胞轉移的文獻報道較少。將蘆筍用于原位大細胞肝腫瘤細胞治療的研究顯示，蘆筍能夠顯著抑制腫瘤細胞的轉移，減少VEGF-A的分泌[27]。本研究通過體外宮頸癌HeLa、SiHa細胞進行細胞劃痕實驗，當腫瘤細胞能夠達到融合成單層的狀態(tài)時，人為制造一個“劃痕”，形成空白區(qū)域。腫瘤細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的連接以及細胞的生長、遷移，使“劃痕”迅速愈合，在一定程度上模擬了人體內腫瘤細胞的遷移狀態(tài)。蘆筍作用腫瘤細胞48 h后，“劃痕”寬度變寬，表明蘆筍能夠抑制腫瘤細胞轉移，且“劃痕”寬度與蘆筍濃度相關。此外，本研究VEGF-A酶聯(lián)免疫吸附測定實驗也證實不同蘆筍濃度作用下VEGF-A的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，VEGF-A的相對表達量隨蘆筍濃度的升高而降低，表明蘆筍可降低腫瘤細胞VEGF-A的分泌，且蘆筍可能通過作用于血管形成主要的細胞因子VEGF-A，減弱腫瘤細胞轉移的能力。

本研究仍存在一些不足，如缺乏動物實驗數(shù)據(jù)，所以后續(xù)會繼續(xù)進行體內動物實驗，得到有力的數(shù)據(jù)支持。蘆筍抑制宮頸癌細胞增殖的具體作用機制(如蘆筍在宮頸癌細胞凋亡、周期變化中的機制)仍不明確，需要進一步探索。

綜上所述，蘆筍能夠抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，可能成為治療宮頸癌的有效藥物。