長鏈非編碼RNA HOTAIR在卵巢上皮癌組織中的表達(dá)及與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義

牛荔，柳英蘭

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，哈爾濱 150001)

卵巢上皮癌是中老年女性常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居婦科腫瘤的首位。近年來其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。雖然診療技術(shù)不斷進(jìn)步，但卵巢上皮癌的5年生存率仍無明顯提高[2]。卵巢上皮癌的發(fā)病原因目前尚不明確，很多因素參與其中，其在發(fā)現(xiàn)時多為晚期。早期卵巢上皮癌的首選治療方法為手術(shù)治療，晚期卵巢上皮癌輔助靜脈化療、腹腔灌注化療、腹腔熱灌注治療和聯(lián)合治療等[3]。然而，積極的治療措施并沒有有效避免卵巢上皮癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，卵巢上皮癌患者的5年生存率仍未超過30%[4]，而靶基因治療方式有望成為卵巢上皮癌治療的新選擇[5]。因此，積極尋找卵巢上皮癌的腫瘤標(biāo)志物，對于早期發(fā)現(xiàn)卵巢上皮癌至關(guān)重要。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA，是一種功能性的RNA分子，通過一系列蛋白復(fù)合物調(diào)控其他基因的表達(dá)和功能，其過表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、凋亡、耐藥等某些特定的生物學(xué)行為密切相關(guān)[6]。研究表明，HOTAIR在多種人體腫瘤中存在過表達(dá)[7-8]。β聯(lián)蛋白(β-catenin)是一種胞內(nèi)核蛋白，多在細(xì)胞的胞膜上表達(dá)[9]。上皮鈣黏素(E-cadherin)是一種重要的黏附分子，其表達(dá)增加或E-cadherin自身功能變化均可使β-catenin自細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，活化靶基因促進(jìn)細(xì)胞增殖黏附，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。本研究旨在探討長鏈非編碼RNA HOTAIR在卵巢上皮癌組織中的表達(dá)與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義，并探討HOTAIR在卵巢上皮癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以尋找卵巢上皮癌新的腫瘤標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2015年1月至2018年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的45例卵巢上皮癌患者術(shù)中的新鮮組織標(biāo)本，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)漿液性卵巢上皮癌30例、黏液性卵巢上皮癌15例。年齡29～67歲，平均(43±7)歲。其中，卵巢上皮癌患者血清糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)>200 kU/L 18例(漿液性卵巢上皮癌10例、黏液性卵巢上皮癌8例)，血清CA125≤200 kU/L 27例(漿液性卵巢上皮癌20例、黏液性卵巢上皮癌7例)。按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟的分期標(biāo)準(zhǔn)[11]：Ⅰ～Ⅱ 期26例(漿液性卵巢上皮癌19例、黏液性卵巢上皮癌7例)，Ⅲ～Ⅳ期19例(漿液性卵巢上皮癌11例、黏液性卵巢上皮癌8例)。病理組織學(xué)分化程度：高分化11例(漿液性卵巢上皮癌5例、黏液性卵巢上皮癌6例)，中分化26例(漿液性卵巢上皮癌20例、黏液性卵巢上皮癌6例)，低分化8例(漿液性卵巢上皮癌5例、黏液性卵巢上皮癌3例)。另收集45例癌旁組織和手術(shù)治療后經(jīng)病理證實(shí)的45例良性卵巢上皮腫瘤組織及正常卵巢組織45例作為對照組。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2試劑和方法

1.2.1HOTAIR信使RNA(mRNA)表達(dá)的檢測 采用相對定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法將卵巢上皮癌組織、癌旁組織、良性卵巢上皮腫瘤組織及正常卵巢組織置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。取凍存的組織約100 mg，室溫下解凍，采用Trizol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明檢測各組織中HOTAIR基因的mRNA表達(dá)水平：聚合酶鏈反應(yīng)體系為25 μL，含互補(bǔ)DNA模板1 μL，2×耐熱DNA聚合酶(Taq酶)混合物11 μL、上下游引物各1 μL。RNA游離水11 μL。

根據(jù)基因庫(Gene Bank)中HOTAIR基因序列(編號：NR_047517.1)，設(shè)計HOTAIR基因引物，引物序列:上游引物5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；(引物大小258 bp)；內(nèi)參照β肌動蛋白基因序列上游引物 5′-GATGACCCAGATCATGTTTG-3′,下游引物5′-TGGAGTTGAAGGTAGTTTCC-3′(引物大小420 bp)；引物及其合成產(chǎn)物的正確性均在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST驗證(網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸30 s；共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。應(yīng)用Image-ProPlus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司開發(fā))分析目的基因HOTAIR mRNA條帶的灰度值，以β肌動蛋白為內(nèi)參，計算各組織轉(zhuǎn)染前后HOTAIR mRNA相對表達(dá)水平的變化。實(shí)驗重復(fù)3次，取平均值。有表達(dá)者為陽性，無表達(dá)者記為陰性，HOTAIR mRNA在不同組織中的陽性表達(dá)率(%)=陽性表達(dá)例數(shù)/全部例數(shù)×100%[12]。

1.2.2E-cadherin蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法檢測組織標(biāo)本中的E-cadherin蛋白表達(dá)。一抗采用兔抗人E-cadherin多克隆抗體(美國Abcam公司生產(chǎn))，抗體稀釋比例為1∶200。按照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。陰性對照組的一抗采用磷酸鹽緩沖液。

觀察各個標(biāo)本，如在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃染或棕褐色顆粒記為陽性細(xì)胞。每個標(biāo)本均篩選10個含有陽性細(xì)胞的高倍視野(200×)，根據(jù)每份標(biāo)本中陽性的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，深黃色或棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞所占百分比評分：無陽性細(xì)胞計0分，≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為中度陽性，9～12分為強(qiáng)陽性，將陰性與弱陽性歸為一組，視為陰性表達(dá)，其余為陽性表達(dá)[13]。計算各組織中E-cadherin的陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1HOTAIR mRNA在不同組織中的表達(dá) 在陽性表達(dá)的組織中，HOTAIR基因在258 bp水平有擴(kuò)增條帶，陰性表達(dá)者無擴(kuò)增條帶顯示(圖1)。在卵巢上皮癌組織中，HOTAIR mRNA的相對表達(dá)量為4.3±1.7，在癌旁組織中相對表達(dá)量為0.9±2.2，在良性卵巢上皮腫瘤組織及正常卵巢組織中相對表達(dá)量均為0，不同組織間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.838，P<0.001)。

M：標(biāo)準(zhǔn)帶；1：漿液性卵巢上皮癌；2：黏液性卵巢上皮癌；3：癌旁組織；4：良性卵巢上皮腫瘤組織；5：正常卵巢組織；HOTAIR：HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA；mRNA：信使RNA

圖 1 不同組織中HOTAIR mRNA的表達(dá)

HOTAIR mRNA在不同組織中的陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=112.380，P<0.001)。其中，卵巢上皮癌組織HOTAIR mRNA的陽性率高于癌旁組織、良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織(χ2=40.020，P<0.001；χ2=62.830，P<0.001；χ2=62.830，P<0.001)，癌旁組織的陽性率高于良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織(χ2=7.590，P=0.012；χ2=7.590，P=0.012)，良性卵巢腫瘤組織與正常卵巢組織的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2E-cadherin蛋白在不同組織中的表達(dá) E-cadherin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，其在卵巢上皮癌組織中呈深黃色或棕黃色；在癌旁組織中部分表達(dá)呈淺黃色，部分無著色；在卵巢良性腫瘤組織中略有淡黃色表達(dá)，在正常卵巢組織中無著色，見圖2。E-cadherin蛋白在不同組織中的陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=107.955，P<0.001)。其中，卵巢上皮癌組織E-cadherin蛋白的陽性率高于癌旁組織、良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織(χ2=37.452，P<0.001；χ2=61.946，P<0.001；χ2=65.769，P<0.001)，癌旁組織的陽性率高于良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織(χ2=7.200，P=0.015；χ2=10.000，P=0.003)，良性卵巢腫瘤組織與正常卵巢組織的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 HOTAIR mRNA和E-cadherin蛋白在不同組織中的表達(dá)率 [n=45，例(%)]

HOTAIR：HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA；E-cadherin：上皮鈣黏素

2.3HOTAIR mRNA的表達(dá)與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系 見表2。不同年齡、腫瘤大小、病理類型、有無腹水形成、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HOTAIR mRNA陽性率和相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；低分化組織的HOTAIR mRNA陽性率和相對表達(dá)量高于中分化和高分化組織，Ⅲ～Ⅳ期患者的陽性率和相對表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期，血清CA125>200 kU/L患者的陽性率和相對表達(dá)量高于血清CA125≤200 kU/L患者(P<0.05)。

2a：漿液性卵巢上皮癌組織；2b：黏液性卵巢上皮癌組織；2c：癌旁組織；2d：良性卵巢上皮腫瘤組織；2e：正常卵巢組織；E-cadherin：上皮鈣黏素

表2 HOTAIR mRNA的表達(dá)與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系

HOTAIR：HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA；CA125：糖類抗原125；a為F值，余為t值

2.4卵巢上皮癌組織中HOTAIR與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，HOTAIR mRNA與E-cadherin蛋白在卵巢上皮癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.615，P<0.001)。

3 討 論

卵巢上皮癌發(fā)生隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為晚期。因此，尋找更多有效的腫瘤標(biāo)志物，有利于從多方面對卵巢上皮癌的診斷進(jìn)行評價。卵巢上皮癌的發(fā)生與發(fā)展是多種基因和多因素的復(fù)雜調(diào)節(jié)過程，如DNA的損傷修復(fù)、多個信號通路激活與抑制、細(xì)胞凋亡的削弱[14]。HOTAIR是一種常見的人類長鏈非編碼RNA，其長度超過200個核普酸序列，位于細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)，通過一系列蛋白復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)其生理功能[15]。HOTAIR過表達(dá)與多種生物學(xué)行為密切相關(guān)，并可通過激活多種信號通路廣泛參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展[16]。有文獻(xiàn)報道，HOTAIR可作為一種腫瘤標(biāo)志物參與肝癌的早期診斷[17]。本研究結(jié)果顯示，HOTAIR mRNA在卵巢上皮癌組織中高表達(dá)，在正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤中幾乎不表達(dá)，而在癌旁組織中有少量表達(dá)，提示其可以區(qū)分良惡性，具有卵巢上皮癌腫瘤標(biāo)志物的候選基因潛能，可作為分子治療的靶基因。但其在癌旁組織中少量表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究中，HOTAIR mRNA在漿液性和黏液性卵巢上皮癌組織中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與臨床分期和組織學(xué)分類密切相關(guān)，隨著臨床分期的增加，HOTAIR mRNA在Ⅲ～Ⅳ期中的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期；在不同的組織學(xué)分類中，HOTAIR mRNA在低分化組織中的表達(dá)多于中分化及高分化組織，說明HOTAIR與卵巢上皮癌的惡性程度密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報道，通過腺載體增加HOTAIR的表達(dá)，可以明顯促進(jìn)膀胱上皮癌細(xì)胞的增殖；而通過小分子RNA抑制HOTAIR基因的表達(dá)，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和生長能力[18]。本研究提示，HOTAIR mRNA在上皮來源的卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)，這為進(jìn)一步研究其是否可以促進(jìn)卵巢上皮癌細(xì)胞的增殖提供了依據(jù)。

E-cadherin蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞間相互聚集的黏附分子家族成員之一，對同種細(xì)胞黏附起調(diào)節(jié)作用，維持上皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整[19]。有研究顯示，E-cadherin 蛋白表達(dá)增加與β-catenin結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號通路，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[20]。同時該研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、腎癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等上皮來源的腫瘤組織中均存在E-cadherin蛋白的異常表達(dá)，從而導(dǎo)致相關(guān)信號通路的激活。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白在卵巢上皮癌組織中表達(dá)陽性率高，在癌旁組織中少量陽性表達(dá)，在卵巢良性腫瘤組織中極少量陽性表達(dá)，在正常卵巢組織中無表達(dá)，提示E-cadherin蛋白表達(dá)增多可促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路參與卵巢上皮癌的發(fā)生發(fā)展。也有文獻(xiàn)報道，抑制或增強(qiáng)E-cadherin基因的表達(dá)可以調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和黏附[21]。因此，可以通過RNA干擾技術(shù)研究相應(yīng)的E-cadherin分子治療藥物，有效抑制卵巢上皮癌的增殖和黏附。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響腫瘤進(jìn)展的重要步驟，也是腫瘤病情發(fā)展的關(guān)鍵，其機(jī)制涉及各種基因參與，并與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，卵巢上皮癌組織中HOTAIR與臨床分期密切相關(guān)，提示卵巢上皮癌組織中HTOAIR表達(dá)增加的同時，也參與了調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；HOTAIR mRNA在卵巢上皮癌中的表達(dá)與E-cadherin蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示HOTAIR可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，從而起到影響卵巢上皮癌發(fā)展的作用，兩者對卵巢上皮癌的黏附和侵襲發(fā)揮密切協(xié)同作用。此外，HOTAIR mRNA在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有無腹水方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示HOTAIR可能參與卵巢上皮癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程的初級階段。

綜上可知，HOTAIR在卵巢上皮癌中表達(dá)顯著增加，其與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者協(xié)同參與了卵巢上皮癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為臨床較為理想的卵巢上皮癌的生物學(xué)標(biāo)志物。