雷公藤甲素介導線粒體凋亡途徑抗腫瘤研究進展

李建民，劉江，吳發(fā)印

(遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 珠海 519100)

雷公藤甲素(triptolide，TP)又稱雷公藤內酯醇，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤中提取鑒定出來的一種化合物，分子式為C20H24O6，水溶性較差。雷公藤廣泛生長于我國南部和東南部山區(qū)，在傳統(tǒng)中醫(yī)用藥中具有悠久歷史。雷公藤組成成分復雜，而環(huán)氧化二萜類化合物TP是目前眾多單體中研究最多的一種，相關分子機制也較為成熟[1]。TP在自身免疫系統(tǒng)疾病(如類風濕關節(jié)炎[2]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3])中療效確切，臨床上常用的雷公藤片、雷公藤多苷片均含有TP活性成分。近年來，TP在抗腫瘤方面的作用逐漸成為研究熱點。

線粒體是真核細胞ATP代謝的主要場所，除為細胞生長、增殖、分化等生物學行為供能外，還廣泛參與了細胞凋亡、腫瘤耐藥的發(fā)生發(fā)展[4]，一旦線粒體功能出現(xiàn)紊亂可快速導致細胞凋亡。在TP缺乏明確的抗腫瘤機制及效應靶點的背景下，現(xiàn)就近年來TP通過線粒體途徑調控腫瘤細胞凋亡的機制予以綜述。

1 線粒體凋亡通路

細胞凋亡是細胞程序性死亡的主動過程，細胞凋亡分為內源性凋亡和外源性凋亡，而線粒體凋亡通路是細胞內源性凋亡的主要調節(jié)通路[5]。線粒體凋亡通路以外膜通透性增加、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)釋放為主要調節(jié)步驟。當細胞接收到凋亡刺激信號時，線粒體外膜通透性升高，線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放，位于線粒體內膜上的Cyt C釋放入胞質，與凋亡蛋白酶刺激因子相互作用，引發(fā)胱天蛋白酶(caspase)9活化，從而開啟級聯(lián)反應，激活下游caspase-3、6等凋亡執(zhí)行蛋白[6]，引起細胞不可逆性凋亡。除Cyt C外，線粒體外膜還可釋放其他促凋亡相關因子[7]。

2 TP介導線粒體凋亡通路

2.1促進線粒體凋亡相關因子表達

2.1.1p53 p53是常見的抑癌基因之一，其表達失衡常導致腫瘤的發(fā)生、轉移。p53在調節(jié)細胞凋亡、細胞周期及細胞衰老中起核心作用。當細胞處于DNA斷裂、癌基因激活或缺氧等不利條件下時，p53蛋白反應性表達，促進細胞凋亡。p53的低水平或基礎水平有利于維持線粒體功能的穩(wěn)定。細胞內氧自由基的清除需要超氧化物歧化酶的作用，后者能有效維持線粒體內的氧化平衡。p53突變型細胞中錳超氧化物歧化酶的表達增加，其加強了線粒體膜電子鏈復合物的電子傳遞，導致線粒體呼吸作用增強，阻斷因活性氧類(reactive oxygen species，ROS)蓄積引起的細胞凋亡[8]。p53可直接影響線粒體外膜的通透性，釋放促凋亡因子，介導細胞凋亡[9]。研究證實，TP具有激活肝癌細胞p53的能力[10]，并促進p53從細胞核轉位至線粒體，從而反式激活B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族基因，導致線粒體外膜通透性增加。相反，使用p53拮抗劑可抵消TP誘導的p53過表達和Bcl-2家族基因轉錄，從而維持線粒體膜通透性，阻止細胞凋亡[11]。因為p53主要為核蛋白，依賴于一系列的化學修飾才可從細胞核轉位至胞質發(fā)揮作用，而p53的核轉位過程常依賴于鼠雙微體2(murine double minute 2,MDM2)對p53的泛素化能力，高水平的MDM2抑制p53從細胞核向細胞質易位，促進相關p53復合物在細胞核內降解[12]。近年來有學者開始研究針對MDM2的靶向治療藥物，試圖阻斷MDM2與p53的相互作用[13]。免疫組織化學研究顯示，胃癌組織中的MDM2相較于正常組織、慢性胃炎組織及腸上皮化生組織處于高表達水平[14]；體外研究發(fā)現(xiàn)，TP能顯著抑制MDM2蛋白的表達，增加p53、caspase-3、caspase-9的表達，促進AGS胃癌細胞凋亡，且不依賴p53途徑，該結果與TP介導的MDM2/蛋白激酶B途徑相關[15]。

2.1.2Bcl-2家族 Bcl-2家族在調節(jié)線粒體功能和外膜通透性上發(fā)揮核心作用，控制著促凋亡因子的釋放[16]。p53對線粒體膜通透性的改變依賴于與Bcl-2家族的交互作用。Bcl-2家族蛋白按功能可劃分為抑凋亡蛋白亞家族和促凋亡蛋白亞家族，Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等屬于抑凋亡蛋白亞家族，而Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer,Bak)和Bok屬于促凋亡蛋白亞家族，其中Bax/Bak是細胞凋亡內在途徑的核心調節(jié)因子。凋亡刺激產生后，Bax/Bak被激活并從胞質轉移到線粒體外膜處，線粒體外膜通透性改變，這一過程被視為Bcl-2家族調控線粒體凋亡的關鍵步驟[17]。目前發(fā)現(xiàn)Bax通過兩種方式改變線粒體外膜通透性。Bax介導與組成mPTP的腺苷轉位因子、電壓依賴性陰離子通道結合，開放mPTP，釋放促凋亡因子。由于Bcl-2、Bcl-xL與Bax/Bak互為拮抗，故抑凋亡蛋白亞家族Bcl-2、Bcl-xL可競爭性結合腺苷轉位因子以阻止Bax的凋亡效應。Bax和Bak耦合的寡聚結構在介導線粒體外膜的激活中起至關重要的作用?；钚訠ax或Bak經過一系列構象變化后，形成的二聚體或更高級的低聚物可部分組成或完全組成線粒體外膜上的異質孔，這些膜孔的大小、壽命取決于Bax/Bak的密度[18]。此外，異質孔也能增加線粒體外膜的通透性[18]。TP具備上調Bcl-2家族促凋亡蛋白亞家族、下調抑凋亡蛋白亞家族的能力。Ni等[19]發(fā)現(xiàn)，TP可通過下調Bcl-2抑制人子宮內膜癌HEC-1B裸鼠移植瘤的生長。針對紫杉醇耐藥型肺癌A459細胞的研究顯示，TP介導糖原合成酶激酶-3β、Bax、caspases-3、 caspases-9的上調增加腫瘤敏感性，誘導細胞凋亡[20]。Ma等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，TP可有效上調Bax，下調Bcl-2的表達，誘導胰腺癌細胞凋亡。體外研究發(fā)現(xiàn)，TP通過上調Bax，下調Bcl-2的表達介導線粒體途徑，促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡[22]。

2.1.3Cyt C與casepase家族 正常狀態(tài)下，Cyt C位于細胞線粒體的外膜內，主要參與呼吸作用、能量代謝，其可通過外膜進入胞質。當各種信號分子引起外膜通透性增加時，成熟的Cyt C受多層調控機制作用后進入胞質，引起caspase級聯(lián)放大反應，參與細胞凋亡[23]。線粒體外膜通透性介導的凋亡依賴于caspase蛋白的活化[24]。caspase家族是一組特異性的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，廣泛參與了真核細胞凋亡，負責線粒體凋亡途徑的最后一環(huán)。當處于上游的啟動者caspase-9接收信號激活后，通過異源活化可將凋亡信號放大，使處于下游的凋亡執(zhí)行者caspase-3/7顯著活化?；罨腸aspase可靶向切割細胞內諸多生物酶結構中的天冬氨酸殘基肽鍵，使酶失活，引起細胞不可逆凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，TP可使Cyt C的釋放增加、活化caspase水平升高[25-26]。TP對低分化癌細胞有更強的殺傷力，用TP處理低分化胃腺癌細胞24 h后，caspase-3/7的表達量較中分化腺癌高約3倍[27]。

2.2抑制線粒體相關抗凋亡蛋白表達

2.2.1Sp1與熱激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70) Sp1是一種核轉錄基因，參與部分生存必備基因的轉錄，其轉錄產物之一為HSP70。HSP70參與蛋白質的合成、修復，抑制細胞凋亡[28]。HSP70大量存在于腫瘤細胞的線粒體中，在大部分正常組織的線粒體中表達水平非常低[29]。一旦HSP70的表達出現(xiàn)抑制，將導致電子傳輸鏈組件中幾種線粒體編碼RNA的水平降低，腫瘤細胞內線粒體電子傳遞鏈配合物蛋白出現(xiàn)變性，膜電位喪失，耗氧率降低、ATP生成減少，引起細胞凋亡[30]。有研究表明，TP與光霉素(一種Sp1化學抑制劑)的作用效果類似，具備抑制Sp1，下調HSP70表達的能力[27]。當應用pCMV-Sp1(Sp1激動劑)后，胃癌細胞系Sp1的表達增加，抵消了TP的抗癌效應[27]，說明TP具有靶向抑制Sp1和HSP70的作用。HSP70在惡性腫瘤細胞中常呈高表達狀態(tài)，尤其是在低分化細胞株中，且與腫瘤的耐藥性呈正相關[31]。有學者認為，TP可作為HSP70的抑制劑，通過抑制HSP70增強胃癌耐藥細胞系MKN5/AR對阿帕替尼(新型胃癌靶向藥物)的敏感性[32]。單獨應用阿帕替尼時，與MKN5(敏感系)相比，MKN5/AR(耐藥系)細胞內的HSP70表達水平升高，對MKN5/AR細胞的半數(shù)抑制濃度為70.527 μmol/L；聯(lián)用小劑量TP后，阿帕替尼對MKN5/AR細胞的半數(shù)抑制濃度為11.679 μmol/L，且低濃度的TP對細胞活性無影響[32]。以上研究證實，TP具備抑制HSP70、逆轉癌細胞耐藥、高效低毒的抗腫瘤活性。

2.2.2沉默信息調節(jié)因子3(silent information regulator 3,SIRT3) SIRT3是sirtuin家族成員之一，是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福饕ㄎ挥诰€粒體，通過去乙酰化修飾反應底物(組蛋白、轉錄因子、代謝酶)，調控細胞的代謝、癌變、衰老、干細胞分化、上皮間-充質轉化等細胞生理活動[33]，具備延長細胞壽命的功能。在線粒體中，SIRT3調節(jié)代謝、能量穩(wěn)態(tài)和線粒體生物合成，通過去乙?；饔迷鰪娭舅幡?氧化，導致乙酰輔酶A生成增多，促進三羧酸循環(huán)，增加ATP的生成[34]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3可激活檸檬酸合酶，促進乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)[35]。除增強能量代謝外，SIRT3還調控mPTP的關閉，維持線粒體外膜通透性，減少Cyt C、凋亡誘導因子釋放到細胞質[36]。同時，SIRT3還可通過清除ROS、調控抗氧化酶的激活抑制腫瘤細胞凋亡，維護細胞免受氧化應激損傷[37]，抑制動力相關蛋白-1(dynamic-related protein 1,Drp1)向線粒體移位[38]，保護線粒體完整性，改善相關因子對線粒體損害作用。Yang等[39]的研究顯示，SIRT3通過關閉mPTP，抑制TP依賴線粒體凋亡途徑，挽救細胞。用TP處理p53缺陷的非小細胞肺癌細胞發(fā)現(xiàn)，TP能減弱線粒體SIRT3的表達，導致電子傳遞鏈配合物Ⅰ和Ⅱ(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶復合物和琥珀酸脫氫酶)高乙?；淖兙€粒體膜電位；過表達SIRT3能恢復線粒體功能，拮抗TP對細胞的凋亡作用[40]。但Kong等[41]的研究顯示，TP介導非霍奇金淋巴瘤細胞的凋亡與TP上調SIRT3的表達有關。該研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶-3β被SIRT3介導的去乙酰化激活后，引起線粒體易位和Bax積累，并降低線粒體膜電位，從而誘導細胞凋亡。Kong等[41]認為，TP可能通過增加SIRT3的表達，激活SIRT3/糖原合成酶激酶-3β/Bax途徑，觸發(fā)非霍奇金淋巴瘤細胞中的線粒體凋亡途徑。SIRT3可能在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起雙重作用[42]。也有學者認為，SIRT3在癌癥中所起的作用取決于細胞環(huán)境[43]，如含高水平ROS的癌細胞具備更強的侵襲力和耐藥性，此時SIRT3起降低ROS水平的作用，發(fā)揮抗癌效應；當ROS過量蓄積，產生氧化應激誘導細胞凋亡的環(huán)境下，SIRT3起維持ROS平衡，保護癌細胞的作用[44]。可見，TP可能具備在不同細胞環(huán)境中依賴線粒體途徑發(fā)揮抗腫瘤的個性化能力。

2.3介導氧化應激及能量代謝失衡 氧化應激是細胞氧化還原的失衡狀態(tài)，呈過氧化表現(xiàn)。當線粒體膜的完整性、跨膜電位、呼吸鏈等受干擾可引發(fā)ROS大量生成，引起氧化應激，損害細胞器，加速細胞凋亡[45]。ROS是氧化應激過程的核心，其能否被有效清除決定氧化應激是否發(fā)生。在部分腫瘤細胞中，線粒體呼吸作用相關基因的表達受到抑制，需要依賴糖酵解途徑產生更多的ATP[46]。相較于正常細胞，癌細胞的糖酵解、氧化磷酸化反應增強，ROS減少，癌細胞的抗凋亡能力增強[47]。抑制糖酵解[48]和底物氧化磷酸化[49]過程可減少癌細胞能量的產生，這也是一種誘導腫瘤細胞凋亡的重要方法。氧化應激與能量代謝失衡密切相關，TP可降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶復合物和琥珀酸脫氫酶的活性，抑制氧化磷酸化過程，細胞內ROS的消耗減少，ROS蓄積，能量生成減少，從而誘導細胞凋亡[40]。Liu等[50]研究發(fā)現(xiàn)，TP可上調神經膠質瘤細胞內ROS的表達，阻斷蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路。蛋白激酶B通過磷酸化糖原合成酶激酶-3β而抑制后者的活性，增強糖代謝反應。TP可通過抑制蛋白激酶B相關途徑，抑制糖代謝，同時促進ROS產生，引起癌細胞氧化應激、能量失衡。Xi等[51]認為，TP可有效抑制細胞對葡萄糖的消耗，減少ATP生成。ATP的釋能反應依賴于ATP酶的水解作用，研究證實，TP可阻止ATP酶與ATP結合，抑制ATP酶活性[52]。

2.4介導線粒體融合與分裂 線粒體結構的完整與穩(wěn)定是保障其功能的根本。在正常細胞內，線粒體處于分裂與融合共存的動態(tài)平衡中，這一狀態(tài)是線粒體實現(xiàn)功能的基礎[53]。在哺乳動物中，線粒體的分裂與融合依靠線粒體融合蛋白(線粒體融合蛋白1和2)和線粒體分裂蛋白(Drp1)的作用。線粒體融合蛋白能融合線粒體內呈嵴形狀的內膜，擴大膜面積，從而立體地增強線粒體氧化磷酸化功能；而線粒體分裂蛋白Drp1可聚集在線粒體外膜上，使線粒體外膜局部裂解，增加線粒體外膜通透性，使Ca2+外流，ROS蓄積，促進凋亡因子釋放，導致細胞凋亡。研究表明，TP是依賴線粒體途徑介導細胞凋亡的，給予TP后可以觀察到線粒體變性、斷裂、線粒體去極化、ROS過度生成、ATP生成減少[54-55]。這個過程與TP可靶向調節(jié)線粒體融合蛋白與分裂蛋白有關[56]。Hasnat等[54-55]研究發(fā)現(xiàn)，TP以Drp 1蛋白為靶點，促使Drp1從胞質轉移至線粒體外膜上，引起Cyt C釋放。Zhang等[57]發(fā)現(xiàn)，TP可調控小鼠睪丸細胞內線粒體融合蛋白2呈低表達狀態(tài)。綜上可知，TP可促進線粒體外膜分裂，抑制線粒體膜融合。

3 小 結

TP因具有明確、廣泛的抗腫瘤活性而得到學者們的普遍認可。TP的抗腫瘤作用依賴于線粒體凋亡途徑，其以線粒體為核心，升高線粒體外膜通透性為基點，相關因子為效應靶點，引起線粒體生物功能及結構紊亂，促進腫瘤細胞凋亡。TP介導的線粒體凋亡途徑與凋亡相關因子變化、ROS蓄積、能量代謝紊亂、線粒體膜結構分裂等線粒體生物過程密不可分，最終引起線粒體膜通透性增加，Cyt C等促凋亡因子釋放入細胞質，引起細胞不可逆性凋亡。未來需要進一步深入研究TP在線粒體凋亡途徑上的作用靶點、基因轉錄以及修飾等，以期更加詳盡地了解TP的抗腫瘤機制。