微RNA參與PCI后心肌缺血再灌注損傷防治的研究進(jìn)展

李童，李學(xué)文，米小龍

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030000； 2.山西白求恩醫(yī)院心內(nèi)科，太原 030000)

目前急性心肌梗死(acute myocardial infraction，AMI)仍是導(dǎo)致我國居民死亡和殘疾的主要病因之一。溶栓治療或直接經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)能及時對缺血心肌進(jìn)行再灌注，從而限制心肌梗死面積，保持左心收縮功能，降低患者死亡率，是急性ST段抬高型心肌梗死 (ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)最有效的治療方法。盡管如此，AMI的發(fā)病率和死亡率仍然較高，5%～10%的患者仍會在PCI后1～2年發(fā)生不良心血管事件，研究人員將此歸咎于心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。即使再成功的PCI也會導(dǎo)致MIRI發(fā)生，目前臨床尚無有效方法預(yù)防心肌梗死PCI后MIRI。因此關(guān)于術(shù)后MIRI的防治成為近些年來心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。過去再灌注損傷的心臟保護(hù)療法包括使用抗氧化劑、鈣通道抑制劑以及清除炎癥因子等，但其應(yīng)用于臨床的效果并不好。對MIRI潛在的病理生理機(jī)制的研究先后催生出缺血預(yù)處理、缺血后處理、遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理和相關(guān)藥物治療等策略，許多策略已在實(shí)驗(yàn)室證明有效，部分在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)良好。體內(nèi)微RNA(microRNA，miRNA)可能是上述治療策略中發(fā)揮作用的重要介質(zhì)和效應(yīng)分子?，F(xiàn)就miRNA參與缺血再灌注損傷后不同類型心肌保護(hù)的機(jī)制做一綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的高度保守的非編碼基因序列，其5′端有磷酸基團(tuán)，3′端有羥基結(jié)構(gòu)，長度為17～25個核苷酸，其典型特征是具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。1993年，Lee等[2]在線蟲體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)能階段性調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4，開啟了人類對miRNA認(rèn)識的大門。在真核細(xì)胞中，miRNA的形成過程首先是RNA聚合酶Ⅱ從 miRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄出原始miRNA，長度為300～1 000個堿基；經(jīng)核酸內(nèi)切酶ⅢDrosha的加工后，切割成長度為70～100個堿基、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA；前體miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后，由Dicer酶切成長度為17～25個核苷酸大小的成熟雙鏈miRNA；最后在解螺旋酶的作用下，雙鏈miRNA解開，其中一條鏈被降解，另一條鏈形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，通過作用于與其部分或完全互補(bǔ)的下游靶mRNA，使下游靶mRNA的表達(dá)下降或降解，從而調(diào)控體內(nèi)基因表達(dá)。miRNA在血漿中能穩(wěn)定存在且形式多樣，其既能與蛋白質(zhì)結(jié)合，包括脂蛋白如高密度脂蛋白，核糖核蛋白如Ago蛋白；又能包裹在囊泡中以胞外囊泡的形式存在。miRNA根據(jù)細(xì)胞來源可分為外泌體、微囊泡及凋亡小體[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在心臟的多種生理和病理過程中發(fā)揮作用，包括心肌梗死、心肌肥厚、心肌纖維化、心律失常、心力衰竭[4-5]。

2 miRNA與缺血預(yù)適應(yīng)

缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)是指在一次長時間致命性心肌缺血發(fā)作前，人為造成多次短時間的非致死性缺血再灌注，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性物質(zhì)保護(hù)心肌，這一現(xiàn)象由Murry等[6]首次發(fā)現(xiàn)。隨后在不同種屬動物以及不同組織器官中證實(shí)了IPC的心肌保護(hù)效應(yīng)，包括減小心肌梗死面積、降低再灌注心律失常發(fā)生率、改善缺血后內(nèi)皮功能失調(diào)。Staat等[7]研究表明，IPC能顯著減小心肌梗死面積。IPC本身即是一種有創(chuàng)的治療方法，且僅適用于缺血事件發(fā)生前，但AMI通常很難預(yù)料，因此IPC很難運(yùn)用到臨床。多種miRNA參與了IPC減輕MIRI的機(jī)制。Varga等[8]的研究首次揭示了行缺血預(yù)處理后MIRI早期機(jī)體內(nèi)miRNA的變化，該研究將大鼠分為三組，即非缺血組，缺血再灌注組(冠狀動脈缺血30 min，再灌注120 min)和缺血預(yù)處理組(缺血再灌注前先短暫缺血5 min，再灌注 5 min，往復(fù)3次)，通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理組中有3種miRNA(miR-139-5p、miR-192和miR-212)的表達(dá)水平與缺血再灌注組和非缺血組相比顯著上調(diào)，表明這些miRNA是由IPC特異性誘導(dǎo)的。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)miR-487b在缺血再灌注組顯著上調(diào)，而IPC抑制了上調(diào)，從而證明IPC在MIRI中不僅能促進(jìn)心臟保護(hù)性miRNA的表達(dá)，也能特異性抑制損傷性miRNA的表達(dá)。Cheng等[9]發(fā)現(xiàn)，MIRI前24 h注射antigomiR-21抑制miR-21的表達(dá)能抵消IPC的心肌保護(hù)作用。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏miR-451的小鼠對IPC作用不敏感，通過注射antigomiR-451能明顯改善這一現(xiàn)象。

3 miRNA與缺血后適應(yīng)

隨著對MIRI研究的深入和病理生理過程的了解，發(fā)現(xiàn)了一種新的減輕MIRI的方法——缺血后適應(yīng)。雖然相較于IPC，缺血后適應(yīng)仍是一種有創(chuàng)的治療手段，其是在心肌缺血發(fā)生后再灌注治療開始前，實(shí)施多次短暫的缺血再灌注處理。Staat等[7]將30例急性STEMI患者分為缺血后適應(yīng)組和對照組，患者均行PCI治療，缺血后適應(yīng)組患者行支架置入后行4個循環(huán)的短暫缺血再灌注(球囊擴(kuò)張1 min，恢復(fù)血液灌注1 min)治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)組患者心肌梗死面積縮小36%，且患者的心肌灌注分級也顯著高于對照組。

目前關(guān)于調(diào)控缺血后適應(yīng)的miRNA在心臟保護(hù)中的確切作用尚不清楚。miR-499是由肌球蛋白重鏈7B編碼的miRNA，僅在心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[11]。Zhu等[12]采用基因芯片微陣列分析發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)組與缺血再灌注組有23種miRNA上調(diào)，33種miRNA下調(diào)，其中miR-499上調(diào)最顯著，是缺血再灌注組的8倍多。為確定miR-499的心肌保護(hù)作用，向小鼠冠狀動脈內(nèi)注射antagomiR-499以拮抗內(nèi)源性miR-499的表達(dá)，然后與缺血后適應(yīng)組相比發(fā)現(xiàn)，心肌梗死面積顯著擴(kuò)大；熒光素酶報告基因檢測顯示miR-499會直接抑制程序性細(xì)胞死亡因子(programmed cell death factor，PDCD)4的翻譯，證明PDCD4是miR-499的直接靶點(diǎn)[12]。Wan等[13]發(fā)現(xiàn)，與缺血再灌注組相比，缺血后適應(yīng)組的心肌梗死面積占缺血面積的比例下降，表明缺血后適應(yīng)可改善心肌功能，減小心肌梗死面積，預(yù)防缺血再灌注損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)組miR-214的表達(dá)水平顯著上調(diào)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α抑制因子表達(dá)水平下調(diào)，認(rèn)為miR-214可能通過靶向調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1α抑制因子基因參與缺血后適應(yīng)的保護(hù)作用[13]。也有研究報道，心肌特異性較好的miR-1、miR-133參與了缺血后細(xì)胞凋亡進(jìn)程，兩者在調(diào)控細(xì)胞凋亡上相互拮抗，心肌缺血后過表達(dá)的miR-1可抑制熱激蛋白60和熱激蛋白70的表達(dá)，進(jìn)而促使心肌細(xì)胞凋亡，而轉(zhuǎn)染miR-133可部分阻止心肌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是miR-133可在多種層面抑制胱天蛋白酶-9的表達(dá)[14-15]。He等[16]的研究也表明，缺血后適應(yīng)通過上調(diào)miR-133a的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制可能是miR-133a通過靶向抑制胱天蛋白酶-9的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為miR-21能調(diào)控細(xì)胞凋亡，屬于抗凋亡基因，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因和PDCD4是其主要靶點(diǎn)[17]。Tu等[18]研究證實(shí)，miR-21能通過人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源/蛋白激酶B信號通路參與缺血后適應(yīng)介導(dǎo)的心肌保護(hù)，抵抗MIRI和功能障礙。

4 miRNA與遠(yuǎn)端IPC

遠(yuǎn)端IPC(remote ischemic preconditioning，RIPC)是通過在肢體遠(yuǎn)端誘導(dǎo)一個或多個短暫非致命的缺血和再灌注循環(huán)，從而遠(yuǎn)距離保護(hù)心臟免受急性心肌缺血再灌注的影響[19]，其通過干預(yù)非重要器官達(dá)到降低心肌損傷的目的，是一種可行、無創(chuàng)、有效的心肌保護(hù)方法，與IPC相比更具臨床應(yīng)用價值。一般通過使用綁在四肢的血壓袖帶完成充氣和放氣3個 5 min的缺血再灌注循環(huán)，即可實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用。RIPC可以預(yù)防缺血引起的心肌組織線粒體呼吸功能損傷，減少活性氧類的產(chǎn)生，維持腺苷三磷酸水平，從而減少心肌缺血缺氧損傷[20]。雖然目前大規(guī)模臨床研究并未證明RIPC對心肌的保護(hù)效應(yīng)[21]，但一些單中心研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RIPC可減少PCI后心臟壞死標(biāo)志物的釋放，減輕再灌注損傷[22-23]。B?tker等[24]發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)運(yùn)途中對STEMI患者實(shí)施RIPC可顯著改善心肌存活，且僅有一支冠狀動脈閉塞的患者從該治療性干預(yù)措施中獲益最大。為研究RIPC保護(hù)心肌的內(nèi)在機(jī)制，Slagsvold等[25]將60例冠狀動脈旁路移植術(shù)患者隨機(jī)分為RIPC組(30例)和對照組(30例)，RIPC組患者術(shù)前將上臂血壓袖帶充氣至200 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，持續(xù)5 min，后放氣5 min，如此往復(fù)3個循環(huán)后手術(shù)，術(shù)后右心耳處活檢測量最大線粒體呼吸商發(fā)現(xiàn)，RIPC組術(shù)前、術(shù)后最大線粒體呼吸商保持不變，而對照組下降28%，提示RIPC能顯著保護(hù)再灌注心肌組織；通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，RIPC組miR-1的表達(dá)下調(diào)，而對照組miR-1顯著上調(diào)，認(rèn)為RIPC可能是通過抑制右心房心肌miR-1的表達(dá)，改善線粒體呼吸功能，減少心肌缺血缺氧損傷。國內(nèi)有學(xué)者將165例冠心病患者隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，試驗(yàn)組患者于入院后第2、3、4天上午、下午各進(jìn)行1次RIPC治療，所有患者于入院第5天行擇期PCI，測定入院第2天和第5天miR-21的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，兩組患者入院后第2天血漿miR-21的水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而第5天血漿miR-21的水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中試驗(yàn)組第5天血漿miR-21的水平較第2天明顯上升，而對照組則無明顯變化，據(jù)此認(rèn)為RIPC能上調(diào)冠心病患者血漿miR-21的水平，減輕冠狀動脈再灌注損傷程度[26]。

5 miRNA參與藥物相關(guān)的心臟保護(hù)機(jī)制

MIRI在圍手術(shù)期發(fā)生頻繁，包括心臟和非心臟手術(shù)，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死，是圍手術(shù)期死亡的重要原因。阿片類藥物作為圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛方案的一個組成部分，無論是在全身麻醉期間還是局部使用阿片類藥物預(yù)處理和后處理對心臟均有強(qiáng)大的保護(hù)作用[27]。將分離的成年大鼠心肌細(xì)胞按不同處理方法分為空白對照組，缺氧再灌注組和嗎啡處理組，結(jié)果顯示，缺氧再灌注組細(xì)胞損傷嚴(yán)重，與對照組相比心肌細(xì)胞活力明顯降低，乳酸脫氫酶水平和細(xì)胞死亡數(shù)增加，而嗎啡能顯著保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧再灌注損傷，細(xì)胞活力提高，乳酸脫氫酶水平和細(xì)胞死亡數(shù)降低；微陣列分析顯示，嗎啡處理組miR-133b-5p的表達(dá)明顯上調(diào)，雙熒光素基因報告證實(shí)Fas是miR-133b-5p的下游靶基因；將miR-133b-5p模擬物或抑制劑分別轉(zhuǎn)染心肌H9C2細(xì)胞，證明miR-133b-5p通過抑制Fas基因的表達(dá)，在嗎啡介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用[28]。除阿片類藥物外，心臟保護(hù)藥還包括調(diào)節(jié)再灌注損傷細(xì)胞信號通路的藥物，如腺苷、心房鈉尿肽、阿托伐他汀、促紅細(xì)胞生成素、艾塞那肽、極化液等。PCI后3 h內(nèi)靜脈滴注腺苷可能對STEMI患者臨床預(yù)后有有益作用[29-30]。環(huán)孢霉素A可通過抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放而發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)[31]，后者是介導(dǎo)致死性缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素。一項(xiàng)臨床研究顯示，STEMI患者行PCI前予以靜脈注射環(huán)孢霉素A可明顯減小心肌梗死面積，減少心室重構(gòu)等不良反應(yīng)[32]。目前關(guān)于使用上述藥物后體內(nèi)miRNA表達(dá)情況的研究較少，未來可進(jìn)一步針對藥物對體內(nèi)miRNA表達(dá)的影響進(jìn)行研究。

6 展 望

盡管直接PCI和溶栓等方法能夠早日實(shí)現(xiàn)急性STEMI相關(guān)血管的再灌注，但MIRI仍是影響急性STEMI患者血運(yùn)重建獲益的重要因素。針對PCI后MIRI防治的研究已從機(jī)械治療策略如缺血預(yù)處理、缺血后處理、遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理和相關(guān)藥物治療策略發(fā)展至調(diào)控機(jī)體內(nèi)源性小分子物質(zhì)如腺苷、腫瘤壞死因子-α、細(xì)胞間黏附分子-1、熱激蛋白70、線粒體乙醛脫氫酶2等的表達(dá)[33]，隨著時間的推移，越來越多新的MIRI和心臟保護(hù)靶點(diǎn)正在被確定。近年來miRNA在MIRI和心臟保護(hù)方面的價值已引起人們的關(guān)注，許多已被證明是心臟病的生物標(biāo)志物或用于預(yù)防心肌梗死、心力衰竭的潛在治療靶點(diǎn)。通過上調(diào)或下調(diào)相應(yīng)miRNA的表達(dá)能起到心肌保護(hù)的效果。不同治療策略引起體內(nèi)miRNA的表達(dá)趨勢也不相同，同一種心肌保護(hù)方法也能引起不同種類miRNA表達(dá)水平的改變，且一種miRNA通常有多個下游靶點(diǎn)，正是miRNA的這些特點(diǎn)使得有望改善AMI患者的預(yù)后。

miRNA真正用于臨床實(shí)踐還存在一些困難，一方面是目前研究的與MIRI相關(guān)的miRNA心肌特異性不高；另一方面目前僅有極少部分的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與臨床試驗(yàn)結(jié)果一致，原因可能是不恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動物模型、不確定療法的臨床測試以及不恰當(dāng)?shù)呐R床試驗(yàn)設(shè)計(jì)?，F(xiàn)階段正在進(jìn)行以納米顆粒、病毒和外泌體作為載體的研究，以改善miRNA的組織特異性，并提高心肌對miRNA的生物利用度，以促進(jìn)臨床成果轉(zhuǎn)化。相信隨著對MIRI機(jī)制研究的深入及相關(guān)臨床試驗(yàn)的開展，有望找到可有效防治MIRI的miRNA，最大化再灌注治療的獲益，改善AMI患者的預(yù)后。