葛瑞林對膿毒癥致急性肺損傷小鼠炎癥反應(yīng)的效果及機制研究

周 虹，崔 娟，陸 尤，孫 晶，孫力超，李 彥★

（1.應(yīng)急總醫(yī)院 急診科，北京 100028；2.應(yīng)急總醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100028；3.中日友好醫(yī)院 急診科，北京 100029）

膿毒癥即全身炎癥反應(yīng)綜合征 （systemic in-flammatory response syndrome，SIRS），是一種潛在致命性的全身炎癥，由嚴重感染引起[1]。有研究顯示約40%的膿毒癥患者出現(xiàn)急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[2]。膿毒癥的發(fā)生歸因于宿主對感染的初始反應(yīng)被級聯(lián)放大并對宿主造成損傷。膿毒癥的炎癥反應(yīng)過程是由激活的各種炎癥細胞參與的復(fù)雜過程[3]。葛瑞林（Ghrelin）是一種28 個氨基酸的胃腸肽激素，具有廣泛的生物活性，可促進生長激素的釋放、影響脂肪和能量代謝、改善胰島素抵抗。另有研究也表明它可增強機體的免疫及抗炎能力[4]。此前有研究報道，葛瑞林可減輕實驗動物急性胰腺炎和結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)[5，6]，并可通過影響Akt 的活性減弱膿毒癥所致的腦損傷[7]。本研究旨在探討葛瑞林對膿毒癥所致ALI 是否具有保護作用及其發(fā)揮作用的可能機制。

1 材料與方法

健康SPF 級C57BL/6 小鼠80 只（雌性、雄性各40 只），購買自SLRC 實驗室（上海），鼠齡8～10 周， 體質(zhì)量18～22g。將小鼠飼育在SPF 屏障內(nèi)，在22°C～25°C 室溫下保持每隔12h 的光/暗循環(huán)并自由飲水進食。葛瑞林，Ghrelin，購自吉爾生化上海有限公司，批號：20180812， 規(guī)格：5mg。

1.1 實驗動物、分組

參照Rittirsch D 等使用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（the cecal ligation and puncture，CLP）的方法[8]制作膿毒癥小鼠動物模型。小鼠在實驗前12h 禁食，自由飲水。小鼠40mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，下腹部消毒、 備皮無菌操作， 在下腹部正中央切口，長約0.5～1.0cm，打開腹腔尋找盲腸，小心分離其遠端與大腸的系膜， 實驗組將盲腸結(jié)扎在回盲瓣下方，并用無菌21 號針頭在已結(jié)扎盲腸遠段中央處貫通穿孔，然后把盲腸推回腹腔，關(guān)閉腹腔，逐層縫合； 對照組僅做開腹分離盲腸遠端與大腸的系膜及關(guān)腹手術(shù)。術(shù)后按50ml/kg 體重皮下注射生理鹽水， 補充術(shù)中丟失的液體， 連續(xù)觀察24h，整個實驗在室溫（22°C～25°C）下進行。

C57BL/6 小鼠80 只， 按隨機數(shù)字法分為4組： 假手術(shù)動物 （對照組）、CLP 誘導(dǎo)膿毒癥組（CLP 組）、 以磷酸鹽緩沖鹽 （PBS） 為溶媒治療CLP 組 （CLP+PBS 組） 和葛瑞 林治療CLP 組（CLP+葛瑞林組），每組均為20 只。除對照組外其他組均建立膿毒癥模型并誘導(dǎo)ALI。術(shù)后2d 內(nèi)，葛瑞林治療組和PBS 治療組小鼠腹膜內(nèi)注射葛瑞林（80μg/kg/d，溶于PBS）和PBS 2ml（pH 7.2～7.4）。

1.2 取材和肺損傷的評定

術(shù)后d5，各組小鼠用CO2窒息法處死。取小鼠右肺一葉固定于4%多聚甲醛中，乙醇脫水，石蠟包埋切片。一部分經(jīng)HE 染色，光鏡觀察染色區(qū)域病理變化。單盲法評估肺組織的損傷程度。肺損傷的評分依據(jù)肺泡充血、出血、血管壁內(nèi)或壁間中性粒細胞浸潤或聚集以及肺泡壁/透明膜形成的厚度。得出的平均值作為肺損傷的半定量組織學(xué)指標[9]。

1.3 髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的測量

組織中MPO 活性參考Hillegass 等人[10]描述的程序來測定。肺組織制成勻漿，并將含有MPO的上清液與含有底物H2O2（1.5mmol）和鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸鹽（167mg/ml，Sigma Aldrich）的50mmol KPO4緩沖液孵育30min。最后，使用96 孔板讀數(shù)測量460nm 處吸光度的變化來測定酶活性。

1.4 支氣管肺泡灌洗液 （bronchialveolar lavage fluid，BALF）細胞計數(shù)

氣管暴露并用導(dǎo)管插管。左肺用無菌PBS 沖洗3 次， 每次0.5ml。灌洗后液體回收率平均＞90%。BALF 在4°C 下以2000rpm 離心10min，上清液在-80°C 下儲存用于細胞因子和蛋白質(zhì)分析， 細胞團塊則重新懸浮在PBS 中用于細胞計數(shù)。

1.5 ELISA 測定炎性細胞因子

使用ELISA 試劑盒（USCNLIFE，中國武漢）檢測BALF 中炎性細胞因子， 包括TNF-α、IL-6、IL-1β 和巨噬細胞炎性蛋白2 （macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）的產(chǎn)生。將樣品分3份分析，結(jié)果為3 次獨立實驗的x－±s。

1.6 Western blotting 分析

使用RIPA 裂解液低溫勻漿裂解各組小鼠的肺組織勻漿30min，4℃12000rpm 離心20min，收集上清即得總蛋白溶液， 用Bradford 法測定樣品蛋白濃度。取20μg 蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上， 然后按照一抗（包括Akt、p-Akt 和β-actin）孵育，與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗雜交后用ECL 化學(xué)發(fā)光成像檢測肺組織中Akt 和磷酸化的Akt。所有樣品分3 份檢測。

1.7 生存曲線

為了評價葛瑞林對膿毒癥致ALI 小鼠存活的影響， 將對照組、CLP 組、CLP+PBS 組和CLP+葛瑞林組各取10 只小鼠， 每24h 進行存活率的測定，直到120h 的終點。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的結(jié)果表示為均數(shù)±標準差（x－±s）。采用單因素方差分析、Fisher 最小顯著差異檢驗分析組間差異。采用Kaplane Meier 分析測定存活率。

2 結(jié)果

2.1 對膿毒癥ALI 的病理學(xué)損傷的影響

HE 染色后觀察組織病理學(xué)變化， 正常對照組的小鼠沒有明顯的組織形態(tài)學(xué)損傷（圖1A，見封二）， 與對照組相比，CLP 組的肺組織表現(xiàn)出顯著的病理學(xué)異常（圖1B，見封二），包括肺泡出血、肺泡壁增厚、 大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤于肺泡腔內(nèi)及壁間。與CLP 組和CLP+PBS 組 （圖1C，見封二）相比，葛瑞林治療組（圖1D，見封二）的肺組織病理學(xué)損傷顯著減輕。

表1 各組小鼠肺損傷指數(shù)、MPO 活性和BALF 炎性細胞總數(shù)

圖2 各組小鼠BALF 中促炎細胞因子表達的變化

圖3 葛瑞林對膿毒癥ALI 小鼠肺組織Akt 磷酸化的影響

圖4 葛瑞林治療改善膿毒癥致ALI 小鼠的生存率

各組小鼠肺損傷指數(shù)、MPO 活性和浸潤的炎性細胞計數(shù)見表1。與CLP 組和CLP+PBS 組相比， 葛瑞林治療組可顯著降低肺損傷指數(shù)、 肺的MPO 活性和BALF 中炎性細胞浸潤數(shù)量 （均P＜0.05）。

2.2 對BALF 中炎性細胞因子產(chǎn)生的影響

BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β 和MIP-2 的濃度， 如圖2 所示， 在經(jīng)過葛瑞林處理的小鼠肺BALF（治療組）中，炎性細胞因子的產(chǎn)生，包括TNF-α （圖2A）、IL-6 （圖2B）、IL-1β （圖2C）和MIP-2（圖2D），與CLP 組和CLP+PBS 組相比顯著降低（均P＜0.05）。

2.3 對激活A(yù)kt 信號傳導(dǎo)通路的影響

Western blot 結(jié)果見圖3，肺組織中Akt 的含量無明顯變化；然而與對照組相比，CLP 組p-Akt的含量明顯升高；與CLP+PBS 組相比，用葛瑞林治療的ALI 小鼠的肺組織中p-Akt 含量顯著降低（均P＜0.05）。

2.4 對膿毒癥致ALI 小鼠存活率的影響

圖4 示，與CLP 組和CLP+PBS 組相比，治療后72h、96h 和120h，葛瑞林干預(yù)顯著改善了膿毒癥致ALI 小鼠的存活率（均P＜0.05）。

3 討論

ALI 是由局部或全身炎癥反應(yīng)引起， 主要是膿毒癥[3]。CLP 是一種廣泛應(yīng)用于體內(nèi)模擬膿毒癥的方法。由于盲腸充滿細菌，對其進行穿刺結(jié)扎可致細菌性腹膜炎、細菌入血、膿毒癥性休克、多臟器功能不全，最終導(dǎo)致死亡。CLP 被公認為是實驗性誘導(dǎo)膿毒癥或膿毒癥致ALI 的金標準[11]。

膿毒癥時， 機體與細菌之間復(fù)雜的相互作用可觸發(fā)細胞因子網(wǎng)絡(luò)的級聯(lián)放大反應(yīng)等多種炎癥途徑[3]。因此在膿毒癥致ALI 中， 大量釋放的TNF-α、IL-6 和IL-1β 等激發(fā)異常的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織損傷。我們的實驗結(jié)果顯示，葛瑞林治療不僅改善了肺組織學(xué)，而且降低了肺損傷指數(shù)。同時， 葛瑞林治療也能抑制膿毒癥誘導(dǎo)的ALI 小鼠的炎癥反應(yīng)。與CLP 組和CLP+PBS 組相比，CLP+葛瑞林組的ALI 小鼠的MPO 活性、 炎性細胞計數(shù)、 炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和MIP-2 的分泌均降低。這些結(jié)果表明，葛瑞林通過抗炎機制對膿毒癥致ALI 具有潛在的治療作用。

已有研究顯示， 編碼上述炎性細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄可由Akt 調(diào)控[12，13]，Akt 信號通路在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用， 而且有研究顯示，Akt通路可在炎癥反應(yīng)過程中被激活，激活的PI3K 誘導(dǎo)PIP3 和PIP2 的生成， 從而導(dǎo)致Akt 的激活（Akt 第473 位絲氨酸的磷酸化）， 隨后，Akt 通過磷酸化下游分子，如GSK-3 和Bcl-2 家族，促進炎癥過程中多種促炎癥介質(zhì)，包括細胞因子、趨化因子和黏附分子的表達[14，15]。因此，為進一步了解葛瑞林對膿毒癥誘導(dǎo)的ALI 小鼠炎癥反應(yīng)抑制機制， 我們接下來檢測了不同實驗組肺組織中Akt的含量及其磷酸化水平。我們觀察到，用葛瑞林治療的ALI 小鼠的肺組織中的Akt 磷酸化受到明顯抑制。結(jié)果提示葛瑞林阻斷ALI 小鼠的炎癥反應(yīng)的作用機制可能與調(diào)節(jié)Akt 通路的活化有關(guān)。

存活率是評價藥物療效的關(guān)鍵指標。為了進一步評估葛瑞林對膿毒癥致ALI 小鼠的存活影響，我們對各組小鼠進行了存活率的比較，結(jié)果提示葛瑞林干預(yù)顯著改善了膿毒癥致ALI 小鼠的存活率。

總之，在膿毒癥誘導(dǎo)的ALI 小鼠中，葛瑞林可以改善肺組織學(xué)，延長存活時間，降低肺組織中促炎細胞因子的水平。這些潛在的治療作用可能是與抑制Akt 信號通路相關(guān)。因此，葛瑞林可作為膿毒癥致ALI 治療的候選藥物。