232例急性白血病流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析

吳瓊，王小中

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006）

急性白血病（Acute leukemia，AL）是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,是造血細(xì)胞某一克隆被阻滯在某一分化發(fā)育階段上并異常增殖的結(jié)果[1]。白血病的免疫分型為白血病的預(yù)后判斷和化療方案的選擇提供了科學(xué)的依據(jù),同時(shí)對(duì)微小殘留病的檢測(cè)也具有十分重要的意義。本文采用四色流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)232例江西地區(qū)急性白血病進(jìn)行了免疫分型檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集 2015 年 9 月至 2017 年 10 月來(lái)我院血液就診的白血病患者232 例。其中男127例，女 105 例，年齡 16~65 歲，中位年齡 38.4 歲。

1.2 主要儀器和試劑 采用美國(guó)BD 公司FACSCalibur 流式細(xì)胞儀。

1.3 主要試劑 FITC 標(biāo)記的 IgG、CD2、CD4、CD7、CD14、CD15、CD56、HLA-DR、IgM、MPO、TdT,PE 標(biāo)記 的 IgG、CD1a、CD5、CD8、CD10、CD13、CD22、CD23、CD64、CD117、HLA-DR，Percp 標(biāo)記的CD45,APC 標(biāo)記的 IgG、CD3、CD11b、CD19、CD20、CD33、CD34 單克隆熒光抗體，溶血素、破膜劑及鞘液，以上試劑均購(gòu)自BD 公司。

1.4 方法 采集EDTA 抗凝的的骨髓標(biāo)本1~2ml。胞膜表面抗原染色：先在上樣管中各加入EDTA抗凝的骨髓標(biāo)本50μl,按白血病免分型4 色方案添加熒光抗體 （其中 FITC、PE、Percp 標(biāo)記的抗體為20μl,APC 標(biāo)記的抗體為 5μl），用渦旋振蕩器輕微的振蕩5s，充分混勻，室溫下避光孵育15min；然后加入1ml 溶血素, 振蕩混勻后室溫避光溶血10 min；到時(shí)間后放入離心機(jī)離心5min，轉(zhuǎn)速設(shè)定為1500rpm；最后棄上清，沉淀用PBS 洗滌兩次即可上機(jī)檢測(cè)。胞內(nèi)抗原染色：先在上樣管中各加入EDTA 抗凝的骨髓標(biāo)本50μl, 再添加CD45-Percp熒光抗體，按上訴方法進(jìn)行膜表面抗體染色，然后根據(jù)破膜劑的使用說(shuō)明書,按步驟添加破膜劑和胞漿內(nèi)抗體，最后用PBS 洗滌一次即可上機(jī)檢測(cè)。

上機(jī)檢測(cè)時(shí)每份標(biāo)本收集50000 個(gè)細(xì)胞，最后借助CellQuest 軟件對(duì)儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析,為了能清晰的把骨髓中各正常細(xì)胞群和幼稚細(xì)胞群區(qū)分開(kāi)來(lái)，我們采用了經(jīng)典的CD45/SSC 雙參數(shù)設(shè)門法，把幼稚細(xì)胞群圈起來(lái)，單獨(dú)分析和計(jì)算該異常細(xì)胞群中各類抗原的表達(dá)情況[2]。判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：以正常的淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、有核紅細(xì)胞作為參考，確定陰陽(yáng)性界限，并把胞膜上抗原表達(dá)大于20%和胞漿內(nèi)抗原表達(dá)大于10%作為陽(yáng)性界限。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 232 例AL 患者免疫學(xué)檢測(cè) 急性淋巴細(xì)胞白血病（ALl）60 例，占 25.9%（60/232），其中 T-ALL 9例，B-ALL 51 例；急性髓系白血?。ˋML）172 例，占 74.1%（169/232）。

2.2 60 例ALL 患者免疫學(xué)檢查的結(jié)果 其中TALL 9 例，占 3.9%，髓質(zhì)-T-ALL 1 例，主要免疫分型特點(diǎn)為：sCD3 陽(yáng)性、CD34 陰性；皮質(zhì)-T-ALL 5例, 主要免疫分型特點(diǎn)為：CD1a 陽(yáng)性，膜 CD 3 和CD34 陰性；其余 3 例患者 sCD3、CD1a、CD4、CD8陰 性，1 例 CD2、CD5 陰 性, 為 Pro-T-ALL，2 例CD2、CD5 陽(yáng)性，為 Pre-T-ALL。各類抗原的表達(dá)率依次為 cCD3(100.0%)、CD7(100.0%)、CD2(88.9%)、CD5(88.9%)、CD34(66.7%)、CD1a(55.6%)、CD3(44.4%)。B-ALL 51 例，占 22.0%，Pro-B-ALL 5 例，主要免 疫 分型特點(diǎn)為：CD10、cIgM、sIgM 均 為 陰 性 ；Common-B-ALL 40 例, 主要免疫分析特點(diǎn)為：CD 10 陽(yáng)性、cIgM 和 sIgM 陰性；Pre-B-ALL 4 例，主要免疫分型特點(diǎn)為：CD10 和 cIgM 陽(yáng)性、sIgM 陰性；成熟B 細(xì)胞ALL 2 例。各類抗原的表達(dá)率依次為cCD22(100.0%)、CD19(100.0%)、HLA-DR(100.0%)、CD10(90.2%)、CD34(89.2%)、CD20(19.6%)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)7 例患者伴有髓系相關(guān)抗原的表達(dá)，常見(jiàn)為CD 13(13.7%)和 CD33(13.7%)。見(jiàn)表1。

2.3 172 例AML 患者免疫學(xué)檢查的結(jié)果 AML172例，占 74.1%，其中 M0、M1、M2、M3、M4 和 M5 占總的髓系白血病的比例分別為3.4%、10.5%、41.9%、15.7%、16.3%、12.2%。在所有的 AML 中各類抗原的表達(dá)率依次為 cMPO (93.6%)、CD13(93.6%)、CD33 (97.7%)、CD117 (74.4%)、HLA-DR(62.2%)、CD34 (64.0%)、CD15 (26.2%)、CD11b(12.8%)、CD14(9.9%)、CD64(26.2%)。其中 cMPO、CD13、CD33 在各亞型中的表達(dá)率最高；緊隨其后的是CD117，同樣高表達(dá)；CD14 在 M0、M1、M2、M3 中的表達(dá)率很低，在M4 和M5 中的表達(dá)率稍高，分別為 14.3%和23.8%；除了M0 之外，CD64 在所有的髓系白血病中均由不同程度的表達(dá)，其中在M4 和M5 中表達(dá)率最高，分別為88.3%和81.0%；CD34、HLA-DR 除M3 不表達(dá)外,在其他亞型中均有表達(dá),其中 CD34 和 HLA-DR 在 M0、M1 和 M2 中高表達(dá)，而在M4 和M5 中表達(dá)較低。另外，我們?cè)贛1、M2 和M4 中發(fā)現(xiàn)少數(shù)患者有CD7 的跨系表達(dá)，在M4 和M5 中也發(fā)現(xiàn)有CD4 的跨系表達(dá)。見(jiàn)表1。

3 討論

急性白血病是一組造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，是造血細(xì)胞在某一分化階段的大量積累，具有高度的異質(zhì)性，對(duì)白血病進(jìn)行精確分型，對(duì)指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后均有著十分重要的意義[4]。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)綜合分析是MIC 分型的優(yōu)勢(shì),是當(dāng)前白血病分型診斷的主要手段[5]，其中免疫分型是MIC 分型的重要組成部分。它是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作為分子探針,多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的胞膜和胞漿的抗原表達(dá),在短期內(nèi)對(duì)大量白血病細(xì)胞定量分析,檢測(cè)出白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度,提高了白血病診斷準(zhǔn)確性、客觀性和重復(fù)性[6,7]。

其中B-ALL 51 例，占22.0%，各類抗原的表達(dá)率依次為 cCD22(100.0%)、CD19(100.0%)、HLADR (100.0%)、CD10 (90.2%)、CD34 (89.2%)、CD20(19.6%)。在所有的患者幾乎都有表達(dá)了CD19 和cCD22, 其中 cCD22 是B-ALL 的特異性標(biāo)記，而CD19 在B 細(xì)胞的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都有表達(dá)，這兩個(gè)抗體標(biāo)記對(duì)B-ALL 的診斷具有很高的價(jià)值，另外CD10 和CD20 也是B-ALL 診斷的重要標(biāo)記，除了 5 例Pro-B-ALL 外其他 B-ALL 患者均有 CD10的表達(dá),同時(shí)CD10 對(duì)臨床預(yù)后判斷具有提示作用,通常 CD10 陽(yáng)性 B-ALL 患者預(yù)后較好[8]；CD20 的敏感性稍差，但特異性較好。HLA-DR 的表達(dá)率也為100%，但在髓系白血病中HLA-DR 也有高表達(dá)，特異性較差。同時(shí)我們?cè)? 例患者中發(fā)現(xiàn)有CD13 和CD33 等髓系標(biāo)記的跨系表達(dá)，一般認(rèn)為這種現(xiàn)象是由于白血病異質(zhì)性所致,可以作為其白血病微小殘留檢測(cè)的特定標(biāo)記。但也預(yù)示著患者的預(yù)后較差[9]。本研究中相關(guān)的案例太少，尚需補(bǔ)充更多的數(shù)據(jù)。

T-ALL 9 例，占3.9%，各類抗原的表達(dá)率依次為 cCD3(100.0%)、CD7(100.0%)、CD2(88.9%)、CD5(88.9%)、CD34(66.7%)、CD1a(55.6%)、CD3(44.4%)。在全部 9 例 T-ALL 患者中 cCD3 和 CD7 都是陽(yáng)性，對(duì)T-ALL 的診斷具有重要的意義。其中cCD3是T-ALL 的特異性標(biāo)志，而胞膜CD3 的表達(dá)率只有44.4%，要遠(yuǎn)低于胞漿CD3，因此胞膜上的CD3敏感性要差于胞漿CD3，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)資料顯示在急性髓系白血病中會(huì)有CD7 的表達(dá),本研究也在髓系白血病M1、M2 和M4中發(fā)現(xiàn)CD7 的跨系表達(dá),因此CD7 敏感但不特異。另外CD2 和CD5 在T-ALL 中也有較高的表達(dá)，對(duì)T-ALL 的診斷同樣具有很重要的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道T-ALL 和髓系患者中CD7 和HLA-DR 的表達(dá)剛好相反, 跨系表達(dá)的AML 中CD7 弱表達(dá)而HLA-DR 陽(yáng)性，因此 CD7 與 HLA-DR 聯(lián)用能增強(qiáng)其特異性[11]。CD1a 作為皮質(zhì)-T-ALL 的特意標(biāo)志，在5 例皮質(zhì)T 患者中都有表達(dá), 特異性強(qiáng)但不敏感。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在60 例急性淋巴細(xì)胞白血病患者中B-ALL 中CD34 的表達(dá)要高于T-ALL, 也許和T-ALL 的幼稚細(xì)胞CD45 的強(qiáng)度更接近正常淋巴細(xì)胞有關(guān)聯(lián)。

表1 232 例急性白血病及其各亞型的主要抗原表達(dá)情況(%)

AML 患者總共172 例，占總白血病的74.1%，其中 AML-M2 患者 72 例，占 AML 的 41.9%，高于文獻(xiàn)報(bào)道。AML-M0 的比例最低，AML-M1、AMLM3、AML-M4、AML-M5 的比例大致相當(dāng)。在所有的AML 中各類抗原的表達(dá)率依次為cMPO(93.6%)、CD13(93.6%)、CD33(97.7%)、CD117(74.4%)、HL A-DR(56.4%)、CD34(64.0%)、CD15(26.2%)、CD11b(12.8%)、CD14(9.9%)、CD64(26.2%)。其中 cMPO 是髓系白血病的特異性標(biāo)志，CD 117 是多能造血干細(xì)胞的重要標(biāo)志，主要表達(dá)于原始粒細(xì)胞、原始紅細(xì)胞以及早幼粒細(xì)胞和早幼紅細(xì)胞,172 例AML患者中CD117 的陽(yáng)性率僅為74.4%,但是除了極少數(shù)B-ALL 外, 急性淋巴細(xì)胞白血病中很少會(huì)有CD117 的表達(dá)，因此CD117 可作為髓系的特異性抗原對(duì)待[12]。就敏感性來(lái)說(shuō)，CD13 和 CD33 要稍強(qiáng)于cMPO 和CD117，但特異性較差。在B-ALL 中經(jīng)常見(jiàn)到CD13 和CD33 等髓系標(biāo)記的跨系表達(dá)，表達(dá)率大致相同，均為13.7%，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。CD14、CD64、CD11b 在 M4 和 M5 的鑒別診斷中具有重要的作用,特異性方面，CD14 要高于CD64，但在 M4 和 M5 中的表達(dá)率分別只有 14.3%和23.8%，敏感性較低；CD 64 不僅表達(dá)于單核細(xì)胞，也表達(dá)于中性粒細(xì)胞，特異性較低，但在AML 中均有不同程度的表達(dá)，在M4 和M5 中表達(dá)率最高，達(dá)到了88.3%和81.0%，具有較高的敏感性。非特異性的標(biāo)志 CD34，HLA-DR 雖然沒(méi)有特異性，但可用于判斷白血病的分化程度。在AML-M0、AML-M1 和 AML-M2 中均有高表達(dá)，AML-M4 和AML-M5 中表達(dá)率較低, 而在AML-M3 中幾乎不表達(dá)，因?yàn)槠浒籽〖?xì)胞來(lái)源于粒系祖細(xì)胞，分化程度較高。我們可以根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)來(lái)鑒別 M3。同時(shí)M3 白血病的細(xì)胞顆粒非常多，因此其SSC 要高于其他髓系白血病，本研究中我們發(fā)現(xiàn)M3 中會(huì)有CD9 的跨系表達(dá), 疑似病例中加做CD9 有助于鑒別診斷。另外，我們?cè)贛1、M2 和M4 中發(fā)現(xiàn)少數(shù)患者有CD7 的跨系表達(dá), 可以作為白血病微小殘留檢測(cè)的特定標(biāo)記。已有研究表明，AML 伴隨有CD7跨系表達(dá)的患者多發(fā)生髓外浸潤(rùn)和容易復(fù)發(fā)，可提示預(yù)后不良[14]。CD4 作為T 淋巴細(xì)胞抗原，同時(shí)也是單核細(xì)胞分化的特征性標(biāo)記，在M4 和M5 中也發(fā)現(xiàn)有CD4 的跨系表達(dá)[15]。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、多參數(shù)同時(shí)分析等特點(diǎn)。能多參數(shù)、客觀地檢測(cè)出細(xì)胞膜和胞漿中各種抗原的表達(dá),準(zhǔn)確地判斷白血病細(xì)胞的類別和所處的分化階段,結(jié)果重復(fù)性好,從而能夠更加精確的診斷出各類白血病所屬的亞型,為白血病的預(yù)后判斷和化療方案的選擇提供了科學(xué)的依據(jù)。