基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建人CLCN7基因編輯載體

孫國(guó)平 ，馬馳宇 ，朱鵬 ，薛雯 ，龔蔚蔚 ，歐明林 ，4

（1.深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518118；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林541004；3.中國(guó)人民解放軍第九二四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林541002；4.深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 518020）

石骨癥是一種骨代謝異常疾病，也是一種典型的人類遺傳病。近年來(lái)，DNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了人類遺傳病致病突變點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[1]。目前，人類已發(fā)現(xiàn)數(shù)十個(gè)與常染色體顯性遺傳石骨癥密切相關(guān)的CLCN7 突變位點(diǎn)，其中CLCN7(R286W)突變是最常見(jiàn)的致病突變位點(diǎn)之一,可見(jiàn)于40%以上的石骨癥患者[2]。該病尚缺乏有效的治療方法，參考遺傳病研究領(lǐng)域最新研究進(jìn)展,探索石骨癥致病基因點(diǎn)突變修復(fù)方法具有重要的科學(xué)價(jià)值,但尚缺乏相關(guān)報(bào)道。因此，辦研究針對(duì)較常見(jiàn)的致病突變點(diǎn)構(gòu)建基因編輯載體,可能為石骨癥致病基因CLCN7修復(fù)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 CRISPR/Cas9 質(zhì)粒購(gòu)自北京賽貝生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 試劑 BspQ I 高保真限制性內(nèi)切酶和T4 連接酶購(gòu)自NEB 公司；DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒及TOP10 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；高保真PCR 酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物科技（北京）有限公司。

1.1.3 引物合成與測(cè)序寡鏈核苷酸(oligo) DNA 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司提供，DNA 序列測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

圖1 CRISPR /Cas9 質(zhì)粒圖譜

1.2 方法

1.2.1 sgRNA oligo 序列的設(shè)計(jì) 根據(jù) https：//www.nlm.nih.gov/網(wǎng)站確認(rèn) CLCN7 基因序列（S1）；根據(jù)http：//crispr.mit.edu/網(wǎng)站設(shè) 計(jì) 在 CLCN7 基 因 序 列設(shè)計(jì)sgRNA 序列。其中sgRNA 的設(shè)計(jì)原則為：起始為堿基為G,靶位點(diǎn)后序列的PAM 序列為NGG；Forward 鏈 5` 端添加 CACC，Reverse 鏈的 5` 端添加AAAC,并經(jīng)過(guò)BspQ I 酶切后形成的粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)形成閉環(huán)質(zhì)粒。

表1 CLCN7-sgRNA 序列和基因組檢測(cè)引物序列

1.2.2 重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9 和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9 的構(gòu)建 利用 Bsp QI 對(duì) CRISPR/Cas9 質(zhì)粒進(jìn)行酶切，通過(guò) Agarose 凝膠電泳分離目的條帶后,由膠回收方法獲得線性化載體;對(duì)sg1RNA 和sg2RNA 進(jìn)行退火實(shí)驗(yàn)后，分別使用T4 DNA 連接酶將退火后的產(chǎn)物連接至線性CRISPR/Cas9 載體，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件：16℃，過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中, 涂布在含有氨芐青霉素抗性的LB 平板上,進(jìn)行克隆篩選，并使用PCR 的方法（表1）鑒定目片段是否已插入，最后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行Sanger 測(cè)序,確認(rèn)插入片段的序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 sg1RNA 和sg2RNA 的退火 將合成的sg1RN A-F / sg1RNA-R 和 sg2RNA-F / sg2RNA-R 序列，稀釋至10 μm 后，兩對(duì)引物以1：1 比例進(jìn)行混合，在95 ℃下孵育 10 min, 移至室溫下自然冷卻2 h以上,瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)雙鏈寡核苷酸片段sg1RNA 和sg2RNA 電泳條帶與目的片段大小一致（圖2）。

圖2 雙鏈的寡核苷酸片段sg1RNA 和 sg2RNA 的檢測(cè)

2.2 CRISPR/Cas9 質(zhì)粒酶切 質(zhì)粒 CRISPR/Cas9 序列上具有BspQ I 酶切位點(diǎn),見(jiàn)圖1；采用BspQ I 酶切斷質(zhì)粒并且去磷酸化后,瓊脂糖電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)酶切獲得的DNA 片段為9.5 kbp,與預(yù)期大小一致,見(jiàn)圖3。

圖3 CRISPR/Cas9 質(zhì)粒的BspQ I 限制性內(nèi)切酶的酶切鑒定

2.3 重組質(zhì)粒 CLCN7-sg1RNA- CRISPR/Cas9 和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9 構(gòu)建 在重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9 和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9 的構(gòu)建過(guò)程中, 分別將線性化載體與寡核苷酸使用T4 連接酶連接, 并轉(zhuǎn)化至TOP10細(xì)胞中，并分別挑取8 個(gè)克隆，擴(kuò)培后提取質(zhì)粒，使用 DNA 引物 CC-CX-F 和 CC-CX-R 進(jìn)行 PCR分析,見(jiàn)表1 與圖4,結(jié)果表明除了重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA- CRISPR/Cas9 的 6 號(hào)克隆和 CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9 的16 號(hào)克隆外均為陽(yáng)性克??；最后，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行Sanger 測(cè)序，結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆成果插入了目的序列sg1RNA 和sg2R NA，堿基序列與預(yù)期一致,見(jiàn)圖5 和圖6，證實(shí)重組質(zhì)粒 CLCN7-sg1RNA- CRISPR/Cas9 和 CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9 已構(gòu)建成功。

圖4 PCR 鑒定重組質(zhì)粒

圖5 重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA- CRISPR/Cas9 的測(cè)序結(jié)果

3 結(jié)論與討論

CRISPR/Cas 系統(tǒng)存在于大部分細(xì)菌和古細(xì)菌中，最早由日本大阪大學(xué)院研究員發(fā)現(xiàn)[3]。近年來(lái)，不少研究證實(shí)CRISPR/Cas 是細(xì)菌利用無(wú)義RNAs標(biāo)記外源核酸序列引導(dǎo)Cas 蛋白實(shí)現(xiàn)特異性切割的防御系統(tǒng)[4]。Cas9 是Cas 蛋白的一種,是Ⅱ型CR ISPR 系統(tǒng)的核心蛋白，CRISPR 基因座轉(zhuǎn)錄形成的crRNA，經(jīng) tracrRNA (transactivating chimeric RNA)促進(jìn)成熟后，可與tracrRNA 結(jié)合共同介導(dǎo)Cas9 特異性切割目標(biāo)DNA[5]。目前，研究證實(shí) crRNA 和tracrRNA 可以進(jìn)行融合，作為sgRNA，可引導(dǎo)Cas9蛋白定點(diǎn)敲除或編輯目的基因，CRISPR/Cas9 已成為了一種新型的基因編輯工具[6,7]。

本文基于CRISPR/Cas9 技術(shù)嘗試構(gòu)建了CLCN7 基因編輯表達(dá)載體。研究表明，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的編輯,首先要根據(jù)靶基因的識(shí)別序列設(shè)計(jì)特異性sgRNA，但是值得注意的是sgRNA 在識(shí)別靶位點(diǎn)時(shí)容易出現(xiàn)堿基錯(cuò)配或者形成DNA/RNA凸起,導(dǎo)致CRISPR/Cas9 系統(tǒng)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)[8]。Cas9介導(dǎo)的DNA 雙鏈斷裂產(chǎn)生在PAM 區(qū)上游的3bp處,靠近PAM 的7～12bp 序列為決定其特異性的關(guān)鍵[9]。因此，在設(shè)計(jì)sgRNA 時(shí)要預(yù)測(cè)其潛在脫靶位點(diǎn)，減少sgRNA 與脫靶位點(diǎn)的堿基配對(duì)數(shù)，且在靠近PAM 區(qū)至少有2 個(gè)堿基不配對(duì)，避免有連續(xù)或間隔的4 個(gè)堿基配對(duì)[10,11]，該策略可以提高sgRNA特異性。遵循上述原則，我們?cè)贑LCN7 外顯子區(qū)設(shè)計(jì)了兩條長(zhǎng)20bp 的sgRNA，其靶點(diǎn)序列的間隔為3bp，并在其后端緊鄰PAM（前間區(qū)序列鄰近基序，NGG）[12,13]。其與靶位點(diǎn)的結(jié)合有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究選用含U6 啟動(dòng)子和Cas9n 蛋白酶的CRISPR-Cas9 質(zhì)粒，經(jīng)BspQI 酶切得到線性載體，使用T4 連接酶將線性載體與兩對(duì)sgRNA 退火后得到的寡核苷酸鏈分別連接，經(jīng)鑒定，成功構(gòu)建了CLCN-7 基因編輯表達(dá)載體 （CLCN7-sg1RNACRISPR-Cas9 和 CLCN7-sg2RNA-CRISPR-Cas9），本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建載體的成功率較高,為下一步修復(fù)CLC N7 致病點(diǎn)突變提供了可能。

據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,石骨癥的有效治療手段較為有限,其中同種異體造血干細(xì)胞移植是治療嚴(yán)重石骨癥的有效方法之一, 但該方法受到多種因素限制，未能在良性石骨癥治療中得到應(yīng)用[14]。最近，一些研究表明通過(guò)患者自身體細(xì)胞建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并進(jìn)行致病突變修復(fù)和定向分化，可能應(yīng)用于石骨癥治療[15]。因此，基于CRISPR/Cas9 技術(shù)探索構(gòu)建人CLCN7 基因編輯載體具有積極的意義，可能為下一步石骨癥特異誘導(dǎo)多能干細(xì)胞CLCN7突變修復(fù)提供新的信息和基礎(chǔ)。