江西地區(qū)24例罕見β-地中海貧血患者基因型分析

羅海艷，劉艷秋，謝康，鄒永毅，陸清

（江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，江西 南昌 330000）

珠蛋白生成障礙性貧血（也稱地中海貧血）,是廣泛分布于全球且危害性極大的血液系統(tǒng)常染色體隱性遺傳性疾病,在中國主要高發(fā)于南部省份如廣東、廣西、海南等[1]。根據(jù)合成受到抑制的相應(yīng)珠蛋白肽鏈類型，地中海貧血可分為α-地中海貧血、β-地中海貧血、δ-地中海貧血、γ-地中海貧血、δβ-地中海貧血、εγδβ-地中海貧血[2]。其中最常見的是α-地中海貧血和β-地中海貧血兩類，致病機制主要由于α-珠蛋白或β-珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋白肽鏈合成不足，使形成血紅蛋白的α-鏈/β-鏈比例失衡，從而導(dǎo)致溶血性貧血[3]。編碼α-珠蛋白的基因位于16 號染色體16p13.3 區(qū)域，主要的基因突變類型為大片段缺失突變，約占α-地貧的95%，部分α-地貧由點突變導(dǎo)致，約占α-地貧的5%[4]；編碼 β-珠蛋白的基因位于 11 號染色體11p15.3 區(qū)域，主要突變類型為點突變。目前我國已經(jīng)報道了48 種β-地中海貧血基因點突變，其中常見的17 種β-地貧基因點突變，CD41-42（HBB：c.124_127delTTCT）、CD43（HBB：c.130G＞T）、IVSII-654（HBB：c.316-197C＞T）、-28（HBB：c.-78A＞G）、-29（HBB：c.-79A＞G）、-30（HBB：c.-80T＞C）、-32（HBB：c.-82C＞A）、CD71-72（HBB：c.216_217insA）、βE （HBB：c.79G＞A）、CD17 （HBB：c.52A＞T）、CD31 （HBB：c.94delC）、CD14-15 （HBB：c.45_46insG）地貧致病基因缺陷已納入常規(guī)地貧基因檢測范圍[5-7]。但β-珠蛋白基因上其它的罕見位點突變或未知突變等，需通過Sanger 測序進行檢測。少數(shù)β-地貧可由基因大片段缺失所引起,目前我國已報道了5 種大片段缺失導(dǎo)致的β-地中海貧血，包括Gantonese 缺失、Yunnanese 缺失、Chinese 缺失、S.E.Asian 缺失和 Taiwanese 缺失。其中 Chinese 缺失即 β-中國型缺失地貧 Gγ+（Aγδβ）0,S.E.Asian 缺失即β-東南亞缺失地貧SEA-HPFH,Taiwanese 缺失即β-臺灣型缺失地貧在人群中更為常見。β-中國型缺失地貧 Gγ+（Aγδβ）0缺失約 79Kb，缺失位置包括 Aγ、δ、和 β 基因，β-東南亞缺失地貧 SEAHPFH 缺失約27 Kb，缺失位置包含整個β 基因，而β-臺灣型缺失在β 基因上缺失約1357bp[8,9]。目前針對β-珠蛋白基因大片段缺失主要采用跨越斷裂點多聚酶鏈反應(yīng)（Gap-PCR）技術(shù)或多重連接酶依賴探針擴增技術(shù)（MLPA）方法進行檢測[10,11]。

臨床上, 血液學(xué)表型可作為β-地中海貧血患者的篩查指標, 根據(jù)RBC 指標和血紅蛋白分析結(jié)果可初步診斷不同類型的β-地中海貧血基因攜帶者。β-地貧基因攜帶者一般具有小細胞低色素性貧血（MCV＜80fl、MCH＜27pg）表型，伴隨血紅蛋白電泳 HbA2 值升高（HbA2＞3.5%）。因此，滿足上述血液學(xué)表型的患者可視為β-地貧高風(fēng)險個體。在臨床檢測中, 常規(guī)β-地貧基因檢測可檢出絕大部分β-地貧，但仍有少部分β-地貧高?；颊呖赡艽嬖诤币娀蛭粗蛔兌荒芡ㄟ^常規(guī)基因檢測方法檢出，容易導(dǎo)致漏診、誤診。因此，對常規(guī)基因型檢測結(jié)果與表型不符的β-地貧高?；颊咝羞M一步β-珠蛋白基因分析相當(dāng)重要,尤其對于夫妻已有一方攜帶β-地貧基因突變的夫婦, 如另一方也攜帶罕見或未知β-地貧基因突變，會導(dǎo)致生育重型β-地貧患兒的風(fēng)險大大增加。在這種情況下，我們對β-地貧基因診斷的基本流程為：反向點雜交技術(shù)分析常見的β-地中海貧血點突變→Gap-PCR 技術(shù)檢測 β-中國型缺失地貧 Gγ+（Aγδβ）0和 β-東南亞缺失地貧SEA-HPFH 及Taiwanese 缺失→β-珠蛋白基因Sanger 測序分析罕見點突變。本研究通過Gap-PCR 技術(shù)和Sanger 測序?qū)Ζ?珠蛋白基因罕見突變類型進行診斷，試圖找到β-地貧高危人群的罕見地貧基因突變位點。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 分析 2017 年 5 月至 2019 年 5 月期間于江西省婦幼保健院行β-地貧基因檢測的患者,對符合小細胞低色素性貧血特征,即MCV＜80fL,MCH＜27pg，血紅蛋白電泳 HbA2＞3.5%，而常規(guī) β-地貧基因檢測為陰性的24 例DNA 樣本進行后續(xù)β-地貧基因分析。該研究符合人體試驗倫理學(xué)標準，并得到了倫理委員會的批準。

1.2 研究方法 對β-基因上可能存在的大片段缺失，參照徐湘民《地中海貧血預(yù)防控制操作指南》一書，進行多重Gap-PCR 擴增，對東南亞型HPFH（簡稱 SEA-HPFH）、中國型 Gγ+（Aγδβ）0與 Taiwanese 缺失型進行檢測,設(shè)置陽性對照和正常內(nèi)對照,樣本不同缺失基因型經(jīng)瓊脂糖電泳后產(chǎn)物片段大小不同。對β-基因上可能存在的罕見點突變與未知突變, 設(shè)計2 對引物, 分別擴增HBB 基因上游-100 至 IVS-Ⅱ-81 與 IVS-Ⅱ-70 至下游終止密碼子后Poly-A 兩段，并行Sanger 測序。測序產(chǎn)物與HBB 基因參考序列比較，找出樣本存在的罕見點突變與未知突變。具體操作步驟如下：

1.2.1 DNA 提取 在獲取病人知情同意的前提下，采用天隆核酸提取試劑盒提取200μl 全血DNA，得到 90μl DNA 樣品,調(diào) DNA 濃度為 50～100ng/μl之間備用。

1.2.2 PCR 擴增 以提取好的DNA 樣品為模板，加入 10×PCR Buffer、Taq 聚合酶、2.5mmol/L dNTPs、MgCl2、ddH2O 及 β-珠蛋白基因引物 （由上海生工公司合成），配制好缺失型突變及點突變檢測反應(yīng)體系, 在ABI 7300 PCR 擴增儀上擴增，β-珠蛋白基因缺失檢測引物序列及擴增程序參照 《地中海貧血預(yù)防控制操作指南》一書。β-珠蛋白基因點突變檢測引物序列見表1, 擴增程序為95℃預(yù)變性5min；95℃ 45s →62℃ 60s →72℃ 60s，35 個 循 環(huán)數(shù)；72℃延伸 5min。

1.2.3 產(chǎn)物分析 對進行β-珠蛋白基因大片段缺失型檢測的PCR 產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳, 分析是否存在相關(guān)缺失型突變；對進行點突變檢測的PCR 產(chǎn)物行 Sanger 測序,與 β-珠蛋白基因 HBB 參考序列比對, 分析是否存在β-珠蛋白基因罕見突變與未知點突變。

表1 β- 珠蛋白基因點突變檢測引物序列

1.2.4 結(jié)果分析 電泳結(jié)束后，將樣本條帶與陰陽性對照進行比較，判斷其缺失基因型類型。測序完成后，將測序圖譜與HBB 標準參考序列進行比對，找出基因突變位點, 進入http：//globin.bx.psu.edu/cgi-bin/hbvar 數(shù)據(jù)庫進行查詢，確定基因突變是否為報道過的已知致病突變或未知突變。

2 研究結(jié)果

通過對24 例疑似罕見β-地貧基因患者行Gap-PCR 及Sanger 測序分析，發(fā)現(xiàn)24 例患者均存在罕見突變，共計9 種突變類型，突變類型及突變?nèi)舜稳绫? 所示。其中缺失型4 例, 點突變型20例, 典型β-珠蛋白基因缺失型突變電泳圖如圖1所示, 典型β-珠蛋白基因點突變測序圖如圖2 所示。

表2 9 種罕見β- 地貧突變類型

3 討論

圖1 典型缺失型罕見β- 地貧瓊脂糖凝膠電泳示意圖

圖2 典型點突變型罕見β- 地貧Sanger 測序圖

β-珠蛋白基因突變導(dǎo)致的重型β-地貧危害極大，患兒出生時不會表現(xiàn)出疾病類型，通常在出生后幾個月或一周歲內(nèi)開始出現(xiàn)慢性進行性貧血癥狀[12]。患者除嚴重貧血外，易伴有輕度黃疸，肝脾腫大，發(fā)育不良，并具有典型的地中海貧血面容，如頭大、眉距增寬、鼻梁低平、顴骨突出等。常并發(fā)支氣管炎或肺炎，當(dāng)并發(fā)有含鐵血黃素沉著時，因過多的鐵沉著引起心臟、肝、胰腺、腦垂體等臟器的損害，嚴重時可導(dǎo)致死[13]。重型β-地貧患兒如不加以治療，多于5 歲之前死亡。目前，重型β-地貧尚無理想的治療手段，主要通過長期定期輸血并通過鐵螯合劑進行祛鐵治療，治療繁瑣且費用昂貴，一般情況下患兒和家長都難以接受。造血干細胞移植（HSCT）是目前能根治重型β-地貧的方法，根據(jù)干細胞來源可分為骨髓移植、外周血干細胞移植和臍血移植?；純罕M早接受HSCT，移植效果越好，但該方法存在HLA 配型相符的造血干細胞供體來源受限的缺點[14-16]。因此，通過人群篩查發(fā)現(xiàn)常見及罕見的β-地貧攜帶者, 并對于攜帶同型地貧基因的育齡夫婦提供產(chǎn)前診斷與遺傳咨詢，有助于合理指導(dǎo)妊娠，降低出生缺陷。

分析結(jié)果表明，24 例存在罕見β-地貧突變的樣本中, 包括3 種內(nèi)含子區(qū)突變，4 種外顯子區(qū)突變,2 種缺失型突變,所有突變基因型均與其臨床表型相符?？梢钥闯鰧?dǎo)致β-地貧的基因突變分布區(qū)域較廣，在編碼區(qū)和非編碼區(qū)均有出現(xiàn)。在本次研究中有一些突變位點出現(xiàn)頻率較高，例如：CD54-58(-TATGGGCACCCT) β0雜合突變共計 8 例，-31(A＞G) β+雜合突變共計 3 例。所分析樣本中，檢出 2例β-地貧復(fù)合雜合突變,即IVS-II-81(C＞T)復(fù)合-28 (A＞C) β＋突變，查詢 HbVar 數(shù)據(jù)庫提示 IVS-II-81(C＞T)突變可能為中性多態(tài)性。對這兩例患者進行家系分析，發(fā)現(xiàn)第一名患者的IVS-II-81(C＞T)突變遺傳自母親，其母親血液學(xué)表型未見異常；第二名患者的IVS-II-81(C＞T)突變遺傳自父親，其父親血液學(xué)表型也未見異常，這更進一步提示IVS-II-81（C＞T）可能為人群中性多態(tài)性變異。同時我們發(fā)現(xiàn)IVS-I-6(T→G)突變在HbVar 數(shù)據(jù)庫未見報道，但有文獻報道表明當(dāng)該位點突變成C 堿基IVS-I-6(T→C)時可導(dǎo)致 β+地中海貧血[17]，因此我們推測IVS-I-6(T→G)也很有可能與該患者的地中海貧血表型相關(guān)。

在臨床實踐工作中,對于表型與基因型不符的患者，應(yīng)行罕見β-地貧基因檢測以明確其基因型，防止誤診或漏診。下列情況應(yīng)高度懷疑為罕見β-地貧患者：⑴呈小細胞低色素貧血 （MCV＜80fL，MCH＜27pg）且血紅蛋白電泳提示HbA2＞3.5%而常規(guī)基因檢測未見異常的患者；⑵呈中、重型β-地貧表型，但常規(guī)基因型檢測僅為攜帶者的患者。因此在常規(guī)17 種β-珠蛋白基因突變檢測的基礎(chǔ)上，結(jié)合多種分子方法對β-地貧高?；颊咝泻币姦?地貧突變分析，可使β-地貧基因檢測更加準確，發(fā)現(xiàn)罕見突變或新突變，對指導(dǎo)地貧基因產(chǎn)前診斷、降低出生缺陷具有重要作用。