PNPLA3、Sort1基因多態(tài)性與酒精性肝病易感性的關(guān)系

李曉飛，張麗萍，郭永勝

（1.焦作市第三人民醫(yī)院傳染三科、河南 焦作 454000；2.焦作市人民醫(yī)院手術(shù)室，河南 焦作 454000；3.焦作市山陽區(qū)疾控中心，河南 焦作 454000）

酒精性肝病屬于臨床常見的肝臟疾病,主要是長期大量飲酒引發(fā),近年來酒精性肝病的發(fā)病率呈現(xiàn)升高的趨勢,對患者的生理和心理產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,目前臨床按照患者病情與病程將酒精性肝病分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化與酒精性肝硬化,有學(xué)者認(rèn)為本病的發(fā)生同肝臟脂肪代謝存在關(guān)系,目前對疾病發(fā)生機制方面研究較多[1]。有學(xué)者報道乙醇在攝入人體內(nèi)90%以上通過肝臟進(jìn)行代謝,而酒精代謝過程在不同人群中會表現(xiàn)出個體化的差異性,基因多態(tài)性的研究在臨床越來越廣泛,有研究發(fā)現(xiàn)patatin 樣磷脂酶3(patatin likephospholipase domain containing 3，PNPLA3) 基因的非同義序列變異在人體肝臟脂肪變性中發(fā)揮了重要作用,該基因編碼的一種跨膜蛋白被證明在肝細(xì)胞膜中顯著表達(dá)；Sort1 則是脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)基因，由Sort1 編碼分揀蛋白是載脂蛋白B100 的受體,主要定位在高爾基體的細(xì)胞內(nèi)蛋白,同人體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)關(guān)系密切[2]。本研究通過觀察PNPLA3、Sort1基因多態(tài)性同酒精性肝病易感性之間的關(guān)系，為臨床尋找酒精性肝病發(fā)生的風(fēng)險因素,以期為臨床提供指導(dǎo)和依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2017 年 1 月至 2018 年 3 月于我院治療的已確診酒精性肝病患者110 例為病例組，同時選取長期大量飲酒但未被診斷酒精性肝病患者100 例為無肝病嗜酒組、健康自愿者200例為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴診斷符合《酒精性肝病診療指南》中的標(biāo)準(zhǔn)；⑵病例組和無肝病嗜酒組飲酒嗜酒≥5 年，乙醇量：男性≥40g/d，女性≥20g/d；⑶對照組受試者不飲酒；⑷所有受試者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并有HAV、HBV 等肝炎病毒感染、藥物性肝病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等；⑵已行肝移植手術(shù)者。各組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組一般資料比較

1.2 實驗方法 抽取患者血液提取DNA，取100μl血液加入離心管,加入PBSSolution100μl 混勻,加入ProteinaseK20μl, 加入 Buffer CL200μl56℃水浴 10 min,加入污水乙醇混勻，置入收集管中放置2min后10000rpm 離心1min,吸附置入收集管,加入CW 1Solution500μl,離心 30s，棄掉廢液后加入 CW2Solution500μl,離心 30s 棄掉廢液,將收集管于 12000 rpm 室溫離心 1min，離去 CW2 Solution，將吸附柱放入一個新的離心管加入CE Buffer 50μl，靜置3min，室溫離心2min 收集DNA 溶液。提取的DNA放于-20℃冰箱保存。全血基因組DNA 抽提試劑盒由生物工程(上海)股份有限公司提供。

PNPLA3 基因檢測：進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行鑒定, 向干凈燒瓶中加入50ml 5×TBE 溶液，隨后加入450ml 蒸餾水,充分混勾制成0.5×TBE 溶液，將1g 瓊脂糖加入燒瓶，將已經(jīng)加好試劑的燒瓶放入微波爐中，高溫加熱2min 至燒瓶中液體沸騰，取出后待凝膠冷卻到50℃左右加入Ultra Power 核酸染料搖晃混勻，靜置3~5min。進(jìn)行電泳反應(yīng), 加入制備好的0.5×TBE 溶液至電泳槽，加入5μl DNA Marker 及PCR產(chǎn)物和Loading Buffer 混合物，電壓設(shè)置為1OOV，30min 后取出，拿至紫外燈下鑒定。

Sort1 基因檢測：取規(guī)格為1.5mlEP 管中配置PCR master mix，PCR 引物由北京博淼生物科技有限公司提供，引物濃度為1μmol/L，保存于-20℃冰箱備用，在384 孔板的每個加樣孔中加入4μl PCR master mix,加入 1μl 模板 DNA 進(jìn)行混勻,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng), 在10μlPCR 產(chǎn)物中加入5U SAP 酶和2U Exonuclease I 酶, 恒溫水浴1h,75℃下滅活15 min, 連接反應(yīng)后將連接產(chǎn)物稀釋取0.5μl 同0.5μl Liz500 SIZE STANDARD 和 9μlHi-Di 混勻,變性后使用MALDI-TOF 質(zhì)譜儀分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析采用SPSS19.0 軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數(shù)資料比較使用χ2檢驗；遺傳平衡性檢驗采用Hardy-Weinberg 檢驗。檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PNPLA3、Sort1 基因多態(tài)性結(jié)果 PNPLA3 基因 rs738409 位點檢測出CC、CG、GG 三種基因型，Sort1 基因 rs646776 位點檢測出 CC、TC、TT 三種基因型，各組PNPLA3、Sort1 基因多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。

2.2 各組PNPLA3、Sort1 基因多態(tài)性分布比較 病例組PNPLA3 基因GG 型和等位基因G 的比例分布明顯高于無肝病嗜酒組和對照組 （χ2=28.445 和12.834,36.642 和 14.504，P＜0.05）,見表2;各組 Sort1基因多態(tài)性分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.3 病例組各PNPLA3、Sort1 基因型血脂水平比較病例組不同 PNPLA3 基因型患者 TG、TC、HDL-C和 LDL-C 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；病例組 Sort1 基因 TT 型患者 TG 高于 CC+CT 型患者，而 HDL-C 低于 CC+CT 型患者（P＜0.05）。見表4。

3 討論

酒精性肝病屬于臨床常見的肝損傷類型之一,主要是由于長期酗酒導(dǎo)致，會帶來社會不穩(wěn)定、家庭矛盾等多種風(fēng)險,酒精對于肝臟的損害在及時戒酒后一段時間內(nèi)仍會繼續(xù)進(jìn)展,目前對于本病的發(fā)病機制研究尚不清楚，因此有效的治療方法不多，主要以肝功能的保護(hù)為主[3,4]。目前認(rèn)為酒精性肝病主要是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用結(jié)果,長時間大量酒精攝入、高脂肪高熱量飲食均可能造成疾病發(fā)生, 近年來隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)PNPLA3 基因和Sort1 基因均可能和多種疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是傳統(tǒng)的研究多數(shù)集中在肝癌、病毒性肝炎中，在酒精性肝病的研究報道較少[5]。有報道指出脂肪變性是酒精性肝損傷的早期階段,通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及細(xì)胞因子激活會引發(fā)肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，最終進(jìn)展為纖維化[6,7]。近年來全基因組關(guān)聯(lián)分析一直是重要的觀察基因變化手段，通過測定特定物種不同個體間的基因來了解基因變化情況,對確定遺傳和表型以及基因和疾病的關(guān)聯(lián)性具有重要研究意義[8,9]。本研究擬在通過對PNPLA3基因和Sort1 基因多態(tài)性情況和酒精性肝病易感性之間關(guān)系，以期為臨床提供一定的依據(jù)。

表2 各組PNPLA3 基因多態(tài)性分布

表3 各組Sort1 基因多態(tài)性分布比較

表4 病例組各PNPLA3、Sort1 基因型血脂水平比較

PNPLA3 為patatin 磷脂酶家族,編碼基因在22號染色體長臂1 區(qū)3 帶3 亞帶1 次亞帶,可以編碼非分泌型蛋白, 這一蛋白由481 個氨基酸組成,具有非特異性酰基水解酶活性，具有高度水解序列，PNPLA3 活性中心絲氨酸就在此序列,和天冬氨酸進(jìn)行結(jié)合,這個結(jié)合的二元體就是發(fā)揮催化作用的關(guān)鍵部位[10]。PNPLA3 在人類各組織中均有廣泛表達(dá)，而肝臟和脂肪組織表達(dá)最多，尤其是發(fā)生變異后會造成肝細(xì)胞脂肪分解代謝變化,肝臟的脂肪堆積增多，促進(jìn)脂肪肝的形成，而且還會降低甘油三酯在細(xì)胞間的運輸動力,使得他們更容易受到脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對肝細(xì)胞造成損傷和炎癥[11]；此外還可通過造成肝臟脂肪變性及肝細(xì)胞的炎癥而對肝纖維化產(chǎn)生影響,肝細(xì)胞損傷和炎性介質(zhì)的釋放會導(dǎo)致庫普佛細(xì)胞二次活化，放大炎性反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡, 肝星狀細(xì)胞活化,肝臟纖維程序激活[12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PNPLA3 的基因多態(tài)性同肝臟脂肪含量增多以及肝臟纖維化程度密切相關(guān)。Stickel F 等人研究德國兩組人群rs738409 位點的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性可能通過介導(dǎo)肝臟脂質(zhì)沉積引起酒精性肝病患者炎癥反應(yīng)的發(fā)生與進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)PNPLA3 rs738409 基因多態(tài)性與酒精性肝病的發(fā)生以及進(jìn)展為肝硬化相關(guān)[13]。

分揀蛋白1（Sort1）屬于一個新的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)基因，與低密度脂蛋白代謝相關(guān)，主要定位在跨高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上,在溶酶體轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)的過程中起到了重要的作用，Sort1 基因主要包含在染色體1p13.3 上, 利用染色體基因圖譜繪制的表達(dá)數(shù)量性狀位點分析顯示，Sort1 次要等位基因C 純合子在肝臟中表達(dá)增高,但是次要等位基因純合子在內(nèi)臟脂肪中不表達(dá), 說明了1p13.3 區(qū)域具有肝臟特異性[14]。加拿大學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，青少年人群中攜帶次要等位基因C 的純合子能夠降低青少年人群中甘油三酯與極低密度脂蛋白水平[15]。

本研究顯示，PNPLA3 基因rs738409 位點檢測出CC、CG、GG 三種基因型，Sort1 基因 rs646776 位點檢測出CC、TC、TT 三種基因型，酒精性肝病患者PNPLA3 基因GG 型和等位基因G 的比例分布明顯高于無肝病嗜酒組和對照組，說明PNPLA3基因GG 型和等位基因G 人群容易發(fā)生酒精性肝病。但是酒精性肝病的發(fā)生同Sort1 基因分布無相關(guān)性。但是在對酒精性肝病患者血脂水平同兩種基因型分析發(fā)現(xiàn)，酒精性肝病患者不同PNPLA3基因型患者 TG、TC、HDL-C 和 LDL-C 無差異，但是 Sort1 基因 TT 型患者 TG 高于 CC+CT 型患者,而 HDL-C 低于 CC+CT 型患者，說明 TG、HDL-C表達(dá)水平或可用于提示酒精性肝病Sort1 基因TT型。本研究優(yōu)勢在于從基因?qū)W層面分析了PNPLA3基因、Sort1 基因同酒精性肝病的發(fā)生之間關(guān)系,開展了初步研究,提供了酒精性肝病遺傳學(xué)研究的相關(guān)證據(jù),有希望從該基因關(guān)鍵分子入手發(fā)現(xiàn)更為敏感的、可信的生物學(xué)指標(biāo)用于預(yù)測酒精性肝病的發(fā)病風(fēng)險，并從遺傳學(xué)角度闡明酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展的機制,為進(jìn)一步的針對該基因靶向治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，PNPLA3 基因多態(tài)性與酒精性肝病易感性有一定關(guān)系，Sort1 基因多態(tài)性與酒精性肝病易感性無明顯關(guān)系，但與患者血脂水平相關(guān)。