重視呼吸道病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

劉洋

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006）

急性呼吸道感染可引起多種臨床疾病,每年造成約425 萬(wàn)人死亡,已成為人類(lèi)第三大常見(jiàn)疾病[1]。其中病毒引起呼吸道感染約占急性呼吸道感染的70~80%[2]。盡管細(xì)菌以前被認(rèn)為是呼吸道感染的主要病原，但細(xì)菌感染常可通過(guò)培養(yǎng)、診斷標(biāo)志物檢測(cè)等診斷，而病毒則很難在臨床條件培養(yǎng)，且存在標(biāo)志物少、診斷窗口期短等缺點(diǎn)，導(dǎo)致病毒感染一直被臨床低估及忽視。近年來(lái)，隨著各種呼吸道病毒感染疾病在世界范圍內(nèi)流行,呼吸道病毒感染被廣受重視[3]。呼吸道病毒主要包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、腺病毒和鼻病毒等[4]。其中流感和呼吸道合胞病毒每年可造成近30 萬(wàn)五歲以下的兒童死亡,而腺病毒和鼻病毒等發(fā)病率高和死亡率高[5,6]。特別是，幾種具有潛在流行性特征的新發(fā)呼吸道病毒威脅全球,包括急性呼吸系統(tǒng)綜合征-冠狀病毒（SARS-CoV）、禽流感病毒 H5N1，H7 N9 和H10N8、甲型H3N2 流感病毒變種、豬源甲型HIN1 流感、人14 型腺病毒、新冠病毒(SARS-CoV-2)以及中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。目前對(duì) SARS-CoV-2、MERS-CoV 和 H7N9 的發(fā)病機(jī)制和傳播方式仍知之甚少,因此盡早作出病原學(xué)診斷直接影響對(duì)其治療、干預(yù)和預(yù)防措施的實(shí)施。

近年來(lái)新檢測(cè)技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)并應(yīng)用于臨床，如核酸分子擴(kuò)增、基因芯片、基因測(cè)序及質(zhì)譜技術(shù)等。這些方法具有高通量、高敏感性、可同時(shí)檢測(cè)多指標(biāo)的特點(diǎn),為病毒檢測(cè)帶來(lái)了技術(shù)上的革新，但也存在假陽(yáng)性、假陰性率，以及受操作和臨床多種因素影響等等。因此，在建立區(qū)分呼吸道病毒感染和呼吸道細(xì)菌感染方法同時(shí),應(yīng)規(guī)范標(biāo)本的采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、檢測(cè)過(guò)程，提高對(duì)呼吸道病毒感染標(biāo)本檢測(cè)效率和準(zhǔn)確率。

1 重視區(qū)分呼吸道病毒感染和呼吸道細(xì)菌感染[7]

以臨床癥狀、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查診斷呼吸道病毒感染和呼吸道細(xì)菌感染是CAP （社區(qū)獲得性肺炎）診斷的重要方式。流行病學(xué)研究顯示，呼吸道細(xì)菌性感染在發(fā)生人群和體征上與呼吸道病毒感染存在差異。研究發(fā)現(xiàn)病毒性肺炎患者常有心臟病等并發(fā)癥，且年齡較大[8]。Liu 等[9]報(bào)道病毒性肺炎導(dǎo)致更多的咳嗽和較少的胸膜疼痛，而Jennings 等[10]人發(fā)現(xiàn)肌痛通常與病毒性疾病有關(guān)的癥狀。影像學(xué)上，呼吸道細(xì)菌感染常與局灶性肺泡浸潤(rùn)相關(guān),而呼吸道病毒感染常為雙側(cè)間質(zhì)性肺部浸潤(rùn)。降鈣素原等標(biāo)志可作為病毒感染診斷的重要依據(jù)。降鈣素原產(chǎn)生依賴于循環(huán)重腫瘤壞死因子的存在，而在病毒感染中，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素可抑制腫瘤壞死因子, 進(jìn)而抑制降鈣素原的升高。盡管呼吸道病毒感染與細(xì)菌感染存在一定差異,但目前仍難以準(zhǔn)確區(qū)分。因此，準(zhǔn)確有效的診斷方法對(duì)呼吸道病毒疾病的控制至關(guān)重要。

2 呼吸道病毒感染標(biāo)本采集、運(yùn)送、儲(chǔ)存及預(yù)處理

2.1 呼吸道病毒感染標(biāo)本的采集 正確采集標(biāo)本是保證診斷準(zhǔn)確性的前提。標(biāo)本來(lái)源主要為呼吸道、血液及泌尿消化道，采集方法包括無(wú)創(chuàng)和有創(chuàng)方法，前者主要集中在部分呼吸道、泌尿及消化道標(biāo)本上,對(duì)患者創(chuàng)傷小，易于接受，但易受定植菌群干擾。后者通過(guò)有創(chuàng)性操作，從正常狀態(tài)下“相對(duì)無(wú)菌”的部位取材，對(duì)診斷的意義更大。針對(duì)不同種類(lèi)呼吸道病毒感染標(biāo)本采集如表1 所示。其中組織活檢標(biāo)本是呼吸道病毒感染確診的金標(biāo)準(zhǔn)。

表1 呼吸道病毒感染標(biāo)本種類(lèi)及采集要求[11-16]

2.2 呼吸道病毒感染標(biāo)本的運(yùn)送與儲(chǔ)存 呼吸道病毒感染標(biāo)本運(yùn)送和儲(chǔ)存原則：⑴標(biāo)本標(biāo)簽和申請(qǐng)單信息完整。標(biāo)簽應(yīng)貼在容器上，而非容器蓋上[17,18]。⑵采集盡量保持無(wú)菌操作，避免被污染。⑶所有標(biāo)本采集后應(yīng)在2h 內(nèi)送檢, 轉(zhuǎn)送時(shí)間超過(guò)規(guī)定時(shí)間時(shí)應(yīng)冷藏運(yùn)送。小樣本量標(biāo)本應(yīng)于采樣后30分鐘內(nèi)送檢，避免標(biāo)本干涸。⑷保證必要的運(yùn)送條件，對(duì)標(biāo)本運(yùn)送條件有不同要求。見(jiàn)表2。

3 呼吸道病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

3.1 病毒培養(yǎng)和鑒定 病毒分離培養(yǎng)一直是病毒鑒定的 “金標(biāo)準(zhǔn)”。常用培養(yǎng)細(xì)胞有人肺癌細(xì)胞A549、貂肺上皮細(xì)胞(MvlLu)、馬丁達(dá)比犬腎細(xì)胞(Madin-Darbv canine kidnev, MDCK)。不同的病毒培養(yǎng)時(shí)間不同, 一般數(shù)日到2 周不等。以細(xì)胞病毒效應(yīng)（CPE）作為確認(rèn)病毒生長(zhǎng)的觀測(cè)指標(biāo)，大多數(shù)病毒CPE 出現(xiàn)時(shí)間為5～10d。此法可以分離檢測(cè)多種病毒，實(shí)現(xiàn)呼吸道病毒混合感染的診斷。此次新冠肺炎疫情中,我們也發(fā)現(xiàn)部分病例存在新冠病毒與流感病毒、呼吸道合胞病毒等混合感染[19]。病毒分離培養(yǎng)可用作抗病毒藥物、疫苗研究、血清分型及流行病學(xué)研究等。但傳統(tǒng)病毒細(xì)胞培養(yǎng)繁瑣、費(fèi)時(shí)，診斷效率低，臨床應(yīng)用受限。

表2 呼吸道病毒感染標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)通用原則[18]

近年來(lái)，基于病毒培養(yǎng)金標(biāo)準(zhǔn)的特性，開(kāi)發(fā)了改良后的病毒培養(yǎng)方法,如病毒離心培養(yǎng)法,基于低速離心增加病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染性,目前已經(jīng)應(yīng)用在呼吸道病毒的培養(yǎng)中。也存在基于免疫學(xué)改良的病毒培養(yǎng)技術(shù)，如pre-CPE 技術(shù)，通過(guò)酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在CPE 出現(xiàn)之前完成檢測(cè)。也可采用混合細(xì)胞培養(yǎng)法，提升病毒檢出率的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)多種病毒同時(shí)檢測(cè)。此外，還有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)法，通過(guò)特定基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，使得特定病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生易于測(cè)定的酶,提高病毒檢出率及特異性。

3.2 呼吸道病毒直接抗原檢測(cè) 采用免疫學(xué)手段，如酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）、免疫層析、免疫熒光技術(shù)等，可檢測(cè)流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等多種病毒抗原[20,21]。常用標(biāo)本類(lèi)型為咽拭子、氣管鏡吸取物、BALF 和肺穿刺活檢標(biāo)本等。應(yīng)用方便快捷，但靈敏度較差[22]。以呼吸道合胞病毒為例，ELISA 及免疫熒光技術(shù)是傳統(tǒng)檢測(cè)呼吸道合胞病毒, 其中以呼吸道合胞病毒F 蛋白為靶標(biāo)的改良ELISA 技術(shù)可在25min 內(nèi)完成，成本低廉。此外，還可以使用直接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)呼吸道合胞病毒，靈敏度和特異度分別高達(dá)94%和96.8%[23]。

3.3 呼吸道病毒抗體檢測(cè) 采用免疫學(xué)手段，如酶聯(lián)免疫檢測(cè)、免疫層析檢測(cè)、磁微粒化學(xué)發(fā)光技術(shù)等，可檢測(cè)流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等多種病毒血清抗體。免疫學(xué)方法檢測(cè)呼吸道病毒抗體存在窗口期、假陽(yáng)性等缺點(diǎn)，診斷滯后。如新冠病毒抗體檢測(cè)時(shí)很容易因患者標(biāo)本中存在內(nèi)源性或外源性干擾物質(zhì)（類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體等）導(dǎo)致免疫測(cè)定假陽(yáng)性，而抗體檢測(cè)假陰性常又因發(fā)病早期抗體可能尚未出現(xiàn),包被抗原質(zhì)量對(duì)抗體檢測(cè)的敏感性等造成。因此，呼吸道病毒抗體檢測(cè)常常只作為呼吸道病毒感染診斷的補(bǔ)充手段。

3.4 呼吸道病毒核酸分子檢測(cè) 核酸分子檢測(cè)已成為呼吸道病毒感染診斷的重要手段。根據(jù)病毒基因序列可快速建立測(cè)定方法,快速應(yīng)對(duì)傳染病疫情對(duì)病原學(xué)診斷的需求,顯著提高了呼吸道病毒感染檢測(cè)的敏感性, 可在數(shù)小時(shí)內(nèi)快速獲得檢測(cè)結(jié)果，既解決了傳統(tǒng)病毒培養(yǎng)困難、培養(yǎng)周期較長(zhǎng)等問(wèn)題，也彌補(bǔ)傳統(tǒng)免疫學(xué)手段陽(yáng)性率低的缺點(diǎn)。

3.4.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù) PCR 檢測(cè)具有高敏感性、高特異性、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),已經(jīng)成為了呼吸道病毒感染最常選擇的檢測(cè)方法。隨著逆轉(zhuǎn)錄 PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）、多重 PCR （multiplex PCR，mPCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等技術(shù)的應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)多種呼吸道病毒實(shí)時(shí)定量同步檢測(cè)[24-26]。新冠肺炎疫情發(fā)生初期,也是最先建立RT-PCR完成核酸檢測(cè)。其中建立多重PCR 方式以提高對(duì)多種呼吸道病毒核酸檢測(cè)的高效性,多重呼吸道病原體基因檢測(cè)(Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel，NxTAG-RPP)可在一個(gè)閉管中同時(shí)檢測(cè)22 呼吸道病原體。在多重PCR 基礎(chǔ)上，聯(lián)合毛細(xì)電泳片段分析方法可完成對(duì)呼吸道病毒核酸的檢測(cè)。目前成熟的多重PCR 檢測(cè)呼吸道病毒感染的方法還包括mOTNRT-PCR、Panther Fusion respiratory assay、FTD21 kit、GeXP assay、Qiagen ResPlex II V2.0 kit、FilmArray multiplex PCR system[27-29]。

3.4.2 等溫(恒溫)擴(kuò)增技術(shù) 等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程僅在恒定溫度下完成擴(kuò)增，在加快擴(kuò)增速度的同時(shí),也降低了對(duì)儀器設(shè)備的依賴性。目前主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滾環(huán)核酸擴(kuò)增（rolling circleamolification,RCA）、核酸序列擴(kuò)增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、解鏈酶擴(kuò)增（Helicase-dependent amplification，HDA）、鏈置換擴(kuò)增（Strand displacement amplification，SDA）等[30]。其中 LAMP技術(shù)主要通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四條引物, 利用鏈置換型DNA 聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),可在15~60min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)109~1010 倍的擴(kuò)增,可以通過(guò)肉眼觀察白色沉淀的有無(wú)來(lái)判斷靶基因是否存在。目前此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在新冠病毒核酸檢測(cè)中廣泛開(kāi)展。由于不需要實(shí)施溫度梯度，可以實(shí)現(xiàn)隨到隨測(cè)的急診模式，顯著縮短傳染病疫情門(mén)急診疑似病人的病原學(xué)診斷的等待時(shí)間。

3.4.3 芯片檢測(cè) 近年來(lái)芯片技術(shù)發(fā)展迅速，基因芯片、蛋白質(zhì)組芯片等技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到臨床診斷的許多領(lǐng)域。病毒基因檢測(cè)芯片可根據(jù)病毒特征基因序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,固定在基質(zhì)上制成芯片, 從來(lái)源于患者的樣品中提取病原體核酸,經(jīng)擴(kuò)增和熒光標(biāo)記后和芯片雜交檢測(cè)。將微流控芯片技術(shù)與核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合,已經(jīng)形成了商業(yè)化的病毒核酸檢測(cè)芯片產(chǎn)品,可短時(shí)間內(nèi)完成多種病毒基因檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)快速、廣譜、高效的診斷需求[31]。

3.4.4 病毒基因測(cè)序 基因測(cè)序可通過(guò)對(duì)核酸序列的解碼完成病毒的識(shí)別和鑒定[32]。目前一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛在臨床開(kāi)展及應(yīng)用,通過(guò)Sanger 測(cè)序等方法獲得特定病毒的基因片段，進(jìn)而獲取其序列信息，完成病毒鑒定，但也存在核酸信息數(shù)據(jù)量少、鑒定能力不足且成本高昂等缺點(diǎn)。

二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）可同時(shí)檢測(cè)多種病毒的保守基因序列,提供呼吸道標(biāo)本中所有病毒的基因組信息及病毒組成,完成對(duì)呼吸道病毒高通量檢測(cè)[33]。而宏基因組測(cè)序直接對(duì)呼吸道標(biāo)本中的病毒核酸進(jìn)行高通量測(cè)序,得到的序列信息與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),可識(shí)別包括已知和未知呼吸道病毒,在罕見(jiàn)病毒及新發(fā)呼吸道傳染性病毒診斷方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[34]。但目前宏基因組測(cè)序花費(fèi)昂貴,且存在宿主基因的干擾是限制其應(yīng)用的主要問(wèn)題。而此次新冠病毒早期發(fā)現(xiàn)也是得益于基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,提升了臨床對(duì)新發(fā)傳染性呼吸道病毒的早期預(yù)警能力。

3.4.5 其他快速檢測(cè)技術(shù) 隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,色譜技術(shù)、光譜技術(shù)、生物傳感器及光電分析技術(shù)、計(jì)算機(jī)芯片技術(shù)在臨床上的應(yīng)用日益增加，聯(lián)合免疫和分子生物學(xué)技術(shù)的引進(jìn),病毒檢測(cè)呈現(xiàn)床旁化、自動(dòng)化及簡(jiǎn)單化趨勢(shì)。質(zhì)譜技術(shù)具備快速、靈敏、特異及高通量等特點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定之中, 而在病毒檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用相對(duì)較少。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)可用于檢測(cè)臨床樣本和分離培養(yǎng)樣本中的病毒蛋白質(zhì)組?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDITOF MS)技術(shù)也可用于檢測(cè)呼吸道病毒及型別。

表3 不同呼吸道病毒診斷技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)[35]

綜上所述，病毒培養(yǎng)、抗原抗體檢測(cè)等傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室病毒檢測(cè)技術(shù)所存在的短板難以實(shí)現(xiàn)快速有效、敏感診斷呼吸道病毒感染的需求。分子診斷技術(shù)已逐步成為病毒實(shí)驗(yàn)室診斷的核心,可縮短診斷的窗口期，提升了病毒感染診斷的能力。以核酸擴(kuò)增技術(shù)及基因測(cè)序技術(shù)為主導(dǎo)的新型分子診斷技術(shù)的應(yīng)用,徹底改變了呼吸道病毒感染診斷的進(jìn)程,在經(jīng)歷 2003 年 SARS、2009 年 H5N1，再到 2020年SARS-CoV-2 的洗禮,呼吸道病毒感染的分子診斷正逐步走向成熟。因此，在應(yīng)對(duì)呼吸道病毒感染中，建立更快速、更靈敏的、更特異的病毒檢測(cè)診斷體系，尤其是針對(duì)新發(fā)傳染性呼吸道病原體，簡(jiǎn)單、快速的高通量定性或定量病毒檢測(cè)，尤其是床旁或社區(qū)檢測(cè)，會(huì)具有廣闊的應(yīng)用前景。