超聲預(yù)處理對大豆蛋白聚集體結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響

李 楊 陳凡凡 王中江 滕 飛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)是一種全價蛋白[1]，常作為乳化劑應(yīng)用于乳制品、肉制品和面制品中，通過降低水和油的表面張力、水和空氣的表面張力，達(dá)到改善食品風(fēng)味、顏色、質(zhì)地和儲存穩(wěn)定性以及提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的[2-3]。在加熱、殺菌、干燥等加工過程中，蛋白質(zhì)極易受到溫度的影響，進(jìn)而發(fā)生構(gòu)象改變，造成蛋白功能活性的衰減，而熱聚集體的形成是導(dǎo)致蛋白喪失某些生物和功能特性(如蛋白的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性)的重要原因[4-6]。熱聚集體的形成主要包括兩個階段：分子解聚成亞基形式，隨后亞基逐漸去折疊，此時分子內(nèi)部疏水殘基逐漸暴露，表面巰基含量增高；當(dāng)這些分子累積的能力足夠彼此接近以實現(xiàn)聚合物形成時，去折疊的亞基通過疏水相互作用迅速聚集形成聚集體[7]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對熱誘導(dǎo)聚集領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究，考察了熱誘導(dǎo)聚集對蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響[8]，并嘗試通過各種物理方法來解聚熱聚集體，以達(dá)到提高蛋白質(zhì)功能特性的目的[9]，但對于調(diào)控?zé)嵴T導(dǎo)可溶性聚集體形成的研究較少。

超聲作為一種非熱物理加工技術(shù)，能產(chǎn)生局部的空化效應(yīng)，改變分子間氫鍵、范德華力、疏水性等維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力，促進(jìn)蛋白構(gòu)象改變，進(jìn)而引起蛋白乳化特性的改變，因此引起廣泛關(guān)注。超聲技術(shù)應(yīng)用范圍較廣[10]，蛋白經(jīng)過超聲處理后，其溶解度發(fā)生變化[11]，且超聲對蛋白的作用分為兩種：一種是蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)修飾，以增強功能性，然后應(yīng)用于生產(chǎn)；另一種是將超聲直接作用于生產(chǎn)體系，增強蛋白與其他物質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性。目前，關(guān)于超聲改性提高蛋白特性的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理可提高米糠蛋白溶解性和乳化性[12]、破壞黑豆蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部疏水作用、解聚和重組黑豆蛋白結(jié)構(gòu)[13]，而適當(dāng)?shù)某暪β屎统晻r間會使黑豆蛋白的粒徑最小化、電位絕對值最大化、蛋白表面疏水性提高[14]。研究表明超聲可用于改性蛋白增加蛋白功能特性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但經(jīng)超聲處理的蛋白進(jìn)行熱處理后，其結(jié)構(gòu)和功能特性變化的相關(guān)研究卻未見報道。蛋白自身特性可直接影響加工生產(chǎn)中的構(gòu)象改變和功能特性發(fā)揮，本文將超聲技術(shù)作用于大豆蛋白，然后將處理后的蛋白進(jìn)行常規(guī)加工的熱誘導(dǎo)處理，利用超聲穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的特性，抑制蛋白因過熱處理而發(fā)生的聚集，進(jìn)而提高蛋白的功能特性，以解決熱誘導(dǎo)引起蛋白功能衰減的難題。

本文以超聲處理為預(yù)處理技術(shù)，并對超聲后的蛋白進(jìn)行熱誘導(dǎo)，探究超聲處理對蛋白結(jié)構(gòu)特性(微觀結(jié)構(gòu)、粒徑分布、官能團、二三級結(jié)構(gòu)、電位、疏水性)和乳化特性(乳化性和乳化穩(wěn)定性)的影響，分析蛋白結(jié)構(gòu)的改變與蛋白乳化特性的關(guān)系。研究超聲功率和超聲時間對蛋白熱聚集的抑制效果，并探究其原因，為解決熱效應(yīng)造成蛋白熱聚集而使蛋白功能衰退的難題提供方法和理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(純度91.12%)，山東禹王集團；2,4-二硝基苯肼，天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；疊氮化鈉，山東浩中化工有限公司；乙酸乙酯，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；β-巰基乙醇、過硫酸銨，Geniview公司；2-硝基苯甲酸(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)，天津市博迪化工有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，廣州奈姆塔貿(mào)易有限公司；8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)，上海將來實業(yè)股份有限公司；尿素(Urea)試劑，武漢博士康生物工程有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，索萊寶生物科技有限公司。其他試劑均為分析純等級。

1.2 儀器與設(shè)備

Biosafer 650-92型超聲波細(xì)胞破碎儀，江蘇賽飛信息技術(shù)有限公司；HH-6型數(shù)顯水浴鍋，山東愛博科技貿(mào)易有限公司；LW-1600FC型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；Zetasizer Nano ZSP型馬爾文納米粒度電位儀，馬爾文儀器公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜，美國尼高力公司；Ultra-Turrax T25型高速分散器，德國IKA公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機，德國Christ公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；GL10M型立式高速冷凍離心機主機，北京新諾立華儀器有限公司；FJ200-S型數(shù)顯高速均質(zhì)機，邢臺浩誠科技開發(fā)有限公司。

1.3 蛋白超聲預(yù)處理和加熱誘導(dǎo)處理

利用0.01 mol/L、pH值7.4的磷酸鹽緩沖溶液將大豆分離蛋白(SPI)溶液(含0.5 mg/mL NaN3)質(zhì)量濃度調(diào)配為10 mg/mL，超聲(對照；6 min， 200 W；6 min，400 W；6 min，600 W； 12 min，600 W；24 min，600 W)處理之后轉(zhuǎn)移至100℃恒溫箱中20 min，誘導(dǎo)大豆蛋白發(fā)生熱聚集。將熱聚集液體于低溫離心機中9 000 r/min離心20 min，棄去沉淀物后留存上清液經(jīng)過24 h冷凍干燥后即可得到6種可溶性蛋白樣品，再加上可溶性大豆分離蛋白(SSPI)(蛋白溶液經(jīng)離心凍干所制)，即7個樣品，分別記為SSPI、STSPI、6 min 200 W-STSPI、6 min 400 W-STSPI、6 min 600 W-STSPI、12 min 600 W-STSPI和24 min 600 W-STSPI。

1.4 蛋白的微觀結(jié)構(gòu)

通過掃描電鏡對樣品的表面形貌進(jìn)行觀察。將樣品均勻平攤在貼有導(dǎo)電膠的樣品臺上，噴金處理，觀察成像時加速電壓為20 kV，觀測倍數(shù)為10 000。

1.5 粒徑分布測定

將可溶性蛋白溶于水中配成質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的溶液，攪拌均勻后，緩慢加入測量池中，用儀器測量其粒徑電位和蛋白質(zhì)分散度指數(shù)(PDI)。

1.6 濁度的測定

參照文獻(xiàn)[15]的方法，并稍作修改。將樣品溶于去離子水中配制成所需的濃度，在室溫(20℃)下磁力攪拌60 min。分光光度計在600 nm下測定其吸光度。以去離子水作空白，測定其吸光度A，濁度計算公式為

(1)

式中V——稀釋倍數(shù)

I——光程距離，取0.01 m

1.7 游離氨基含量的測定

參照文獻(xiàn)[16]的方法，并稍作修改。400 mg OPA試劑充分溶解于1 mL甲醇溶液中，而后依次向溶液中加入預(yù)先配置的質(zhì)量濃度為200 g/L的SDS溶液2.5 mL及質(zhì)量濃度為0.1 mol/L的硼酸溶液25 mL，繼而轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥內(nèi)加入100 μL的β-巰基乙醇，最后將溶液用蒸餾水定容至50 mL，制備成OPA溶液用于后續(xù)檢測分析，量取OPA試劑4 mL與200 μL蛋白樣品充分混勻后進(jìn)行35℃水浴處理2 min，以蒸餾水空白組為對照在340 nm處測定吸光度。

1.8 游離巰基和二硫鍵含量的測定

參照文獻(xiàn)[17]的方法，并稍作修改。稱取400 mg的DTNB，加入Tris-Gly(氨丁三醇-甘氨酸)緩沖液定容至100 mL，配成Ellman試劑。分別稱取2 mg樣品溶解于2 mL的Tris-Gly緩沖液(pH值8.0)和0.02 mL的Ellman試劑。測定時溶液振蕩快速混合后在25℃下保溫反應(yīng)15 min，用分光光度計測定其在412 nm處的吸光度，以不加Ellman試劑為空白。將樣品用磷酸鹽緩沖液配制成0.5 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，置于10 mL塑料離心管中，加入2.5 mL含8 mol/L尿素的Tris-Gly(10.4 g Tris，6.9 g Gly，每1 L加1.2 g EDTA，pH值8.0)，每隔1.5 min加入20 μL DTNB(0.004 g DTNB用Tris-Gly溶解定容至1 mL，避光)，反應(yīng)25 min，立即在412 nm處測吸光度。對照組不加蛋白質(zhì)溶液，其他處理方法相同。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.050 2x-0.000 9，R2=0.999 4)計算出蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度ρ。摩爾消光系數(shù)取13 600 L/(mol·cm)，巰基質(zhì)量摩爾濃度計算公式為

(2)

式中S——巰基質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g

A412——加Ellman試劑時412 nm處樣品的吸光度

D——稀釋系數(shù)

C——樣品蛋白最終質(zhì)量濃度，mg/mL

1.9 羰基含量的測定

參照文獻(xiàn)[18]的方法，并稍作修改。將蛋白用去離子水配制為5 mg/mL的蛋白溶液，以雙縮脲指示劑法測定蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度(y=0.241 2x+0.013 5,R2=0.997)。在367 nm處用2, 4-二硝基苯肼比色法進(jìn)行比色，每毫克蛋白質(zhì)羰基衍生物的摩爾數(shù)通過摩爾消光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)進(jìn)行計算，公式為

(3)

式中G——蛋白羰基質(zhì)量摩爾濃度，nmol/mg

n——稀釋因子

A367——367 nm處吸光度

E——蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL

1.10紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[19]的方法，并稍作修改。將凍干樣品置于干燥器內(nèi)充分干燥，稱取1 mg樣品于100 mg溴化鉀中混勻，在瑪瑙研堝中研磨并用壓片器壓片，于紅外光譜儀中測定吸收光譜。測量條件：波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64次，環(huán)境溫度25℃。

1.11內(nèi)源性光譜分析

參照文獻(xiàn)[20]的方法，并稍作修改。稱取一定量樣品于5 mmol磷酸緩沖液(pH值 7.0)配成質(zhì)量濃度為0.001 g/mL的溶液，取適量樣品置于熒光分光光度計中測量。測量條件：激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長300～400 nm，狹縫寬均為5 nm，電壓為700 mV。

1.12Zeta電位的測定

參照文獻(xiàn)[21]的測定方法，并稍作修改。采用Zetasizer Nano ZSP型馬爾文納米粒度電位儀對蛋白溶液的Zeta電位進(jìn)行測定。將蛋白樣品分散到50 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的蛋白溶液，取樣量為3 mL，測定溫度為25℃。

1.13 表面疏水性指數(shù)H0測定

參照文獻(xiàn)[22]的ANS熒光探針法測定樣品表面疏水性的方法，并稍作修改。用0.1 mol/L的中性磷酸鹽緩沖溶液稀釋，10 000 r/min高速離心處理0.5 h除去沉淀物，以Lowery法分析測試上清液中蛋白濃度，通過磷酸鹽緩沖液的逐步稀釋，調(diào)控蛋白溶液質(zhì)量濃度至0.05～0.4 mg/mL，取40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液滴加至不同濃度的蛋白溶液4 mL，經(jīng)振蕩混勻后靜置3 min，在熒光分光光度計下進(jìn)行熒光強度測試，測試條件為：激發(fā)波長λex=390 nm，發(fā)射波長λem=468 nm，掃描夾縫寬度設(shè)置為5 nm，掃描速度設(shè)置為10 nm/s。將熒光強度與蛋白質(zhì)量濃度作線性圖，初始段的斜率計為樣品的表面疏水性指數(shù)。

1.14乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照文獻(xiàn)[23]的方法，并稍作修改。在測試管中分別加入15 mL質(zhì)量濃度0.001 g/mL蛋白質(zhì)溶液和5 mL玉米油，乳液經(jīng)高速均質(zhì)機(24 000 r/min)處理1 min后，從測試管底部取出50 μL乳液，用0.001 g/mL的SDS溶液稀釋100倍后，于500 nm比色。乳化性指數(shù)EAI和乳化穩(wěn)定性指數(shù)ESI的計算公式為

(4)

(5)

式中EAI——乳化性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

F——稀釋因子，取100

A0—— 0 min時的吸光度

A30——30 min時的吸光度

H——蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

φ——光程，取0.01 m

θ——油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取25%

1.15數(shù)據(jù)處理和分析

每個實驗均進(jìn)行3次重復(fù)平行實驗，利用SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，以P<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件、Peak Fit 4.12軟件等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白的微觀結(jié)構(gòu)變化

由圖1箭頭指出的孔洞結(jié)構(gòu)可知，SPI在經(jīng)過熱處理后由片狀結(jié)構(gòu)聚集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；隨著超聲功率的增大，USTSPI微觀圖中箭頭所指的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由松散雜亂逐漸變得致密且孔洞均勻；但當(dāng)超聲功率不變，隨著超聲時間的增大，超聲后熱可溶性蛋白的結(jié)構(gòu)逐漸由致密均勻逐漸變得松散。這表明超聲處理可以影響蛋白的聚集效果，進(jìn)而影響蛋白的微觀結(jié)構(gòu)[24]。

圖1 超聲預(yù)處理對蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of ultrasonic pretreatment on microstructure of protein

2.2 熱處理對預(yù)處理蛋白粒徑的影響

由圖2和表1可知，與SSPI相比，STSPI的平均粒徑、PDI和濁度均顯著增大，且粒徑分布圖由原來的單峰變成了三峰；與STSPI相比，經(jīng)過超聲預(yù)處理的蛋白在熱誘導(dǎo)時粒徑、PDI和濁度顯著降低，隨著超聲功率的增大，其粒徑分布圖逐漸左移，且STSPI最右側(cè)峰消失，表中平均粒徑、濁度和PDI逐漸減??；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時間的增大，粒徑分布圖逐漸右移，平均粒徑、PDI和濁度呈現(xiàn)增大的趨勢。

圖2 超聲預(yù)處理對蛋白粒徑分布的影響Fig.2 Effect of ultrasonic pretreatment on protein particle size distribution

加熱處理可使蛋白先解聚后聚集，導(dǎo)致粒徑、PDI和濁度增大。而超聲預(yù)處理使蛋白發(fā)生一定程度的疏水性基團暴露，增強顆粒間的靜電排斥力，從而提高蛋白質(zhì)分散體系的穩(wěn)定性[14]。超聲功率越大，蛋白疏水性基團暴露得越明顯，分子間斥力越大，抑制熱聚集體形成的效果越明顯[25]。而超聲時間過長會導(dǎo)致蛋白分子在疏水作用力的情況下發(fā)生聚合，溶液穩(wěn)定性變差，從而降低了抑制熱聚集體形成的效果，并促進(jìn)小分子聚集體向中等大小聚集體轉(zhuǎn)變。粒徑分布圖可在一定程度上反映蛋白粒度的分布狀況，而PDI 則反映粒徑分布范圍，而溶液濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度，可從側(cè)面衡量蛋白質(zhì)相互作用大小及聚集體的相對尺寸。圖2中超聲預(yù)處理后峰圖較STSPI左移，且大顆粒峰圖消失，顆粒分布較為集中。從表1可知，經(jīng)過超聲預(yù)處理的蛋白PDI處于0.25～0.35之間，較SSPI的0.52和STSPI的0.58小，經(jīng)過超聲預(yù)處理的蛋白濁度也顯著降低。粒徑、PDI和濁度的變化趨勢說明超聲預(yù)處理在一定程度抑制了蛋白熱聚集，且超聲功率和時間的不同對熱誘導(dǎo)聚集抑制程度不同。

表1 超聲預(yù)處理對蛋白結(jié)構(gòu)的影響Tab.1 Effect of ultrasonic pretreatment on protein structure

注：同列中相同字母表示數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)，不同則表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 可溶性蛋白游離氨基和羰基含量的測定

蛋白結(jié)構(gòu)在受熱展開的過程中，埋藏在分子內(nèi)部的氨基側(cè)鏈暴露并很快被氧化生成羰基結(jié)構(gòu)，氨基含量和羰基含量在一定程度上可用來表征蛋白結(jié)構(gòu)的展開程度和氧化程度[26]。巰基基團(—SH)是蛋白中重要的功能基團，其含量變化可反映蛋白質(zhì)的變性程度，對其功能性質(zhì)的發(fā)揮具有很重要的作用[27]。如表2所示，與可溶性SPI相比，可溶性TSPI的游離氨基、游離巰基和總巰基含量減少，而羰基和二硫鍵含量增多；與STSPI相比，隨著超聲功率的增大，其游離氨基和巰基呈現(xiàn)升高趨勢，而羰基含量和二硫鍵含量呈現(xiàn)減小趨勢；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時間的增大，游離氨基和巰基含量呈現(xiàn)降低趨勢，而羰基含量先增大后減小，二硫鍵含量呈現(xiàn)升高趨勢。

表2 游離氨基、巰基、二硫鍵和羰基含量Tab.2 Free amino, sulfhydryl, disulfide and carbonyl contents

蛋白溶液在進(jìn)行熱處理時，當(dāng)?shù)鞍拙奂潭雀哂诮饩蹠r，巰基基團部分轉(zhuǎn)換為二硫鍵，部分被重新掩藏，導(dǎo)致巰基含量降低，二硫鍵含量增加。蛋白結(jié)構(gòu)在展開過程中產(chǎn)生的部分氨基因氧化生成新的羰基基團[26,28]，羰基含量增多。已有研究證實，超聲波的空化效應(yīng)和剪切力可將大聚集體解聚轉(zhuǎn)化為小聚集體，提高蛋白表面疏水性，增大巰基的暴露量，破壞分子間二硫鍵形成游離巰基[25]，增加蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷，增強顆粒間靜電排斥，并提高蛋白質(zhì)分散體的穩(wěn)定性[14]，抑制蛋白聚集，進(jìn)而減少羰基量。當(dāng)超聲功率為600 W和超聲時間為6 min時疏水性基團的暴露量達(dá)到最大值，超聲功率和時間持續(xù)增大，存在過量的自由基，促進(jìn)羰基的形成[29]。蛋白之間非共價相互作用推動蛋白顆粒聚集，游離巰基和游離氨基減少，二硫鍵含量增多。

2.4 可溶性蛋白二級結(jié)構(gòu)組分含量測定

傅里葉變換紅外光譜是表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)方法之一。熱處理可斷開蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，使α-螺旋結(jié)構(gòu)減少[30]，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)(β1+β2)含量增多。而反向平行的折疊結(jié)構(gòu)(β1)通常在聚集的蛋白質(zhì)分子間形成[31]，在一定程度上可表征蛋白的聚集程度。如圖3和表3所示，與SSPI相比，STSPI的β1結(jié)構(gòu)增多，α-螺旋和γ-無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)均減少；隨著超聲功率的增大，β1呈現(xiàn)減小趨勢，α-螺旋和γ-無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增多；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時間的增大，β1增多，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和γ-無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)均減少。

圖3 蛋白的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of protein

表3 超聲預(yù)處理對蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Tab.3 Effect of ultrasonic pretreatment on secondary structure of protein

研究表明，超聲功率和超聲時間的增大可能增加了蛋白質(zhì)上的負(fù)表面電荷，而顆粒的有效表面電荷主要決定了它們的分散和聚集[32]，增強顆粒間靜電排斥，并提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[14]。與STSPI相比，超聲后再經(jīng)熱誘導(dǎo)的可溶性蛋白β-折疊(尤其是β1)結(jié)構(gòu)減少，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增多，可能與超聲使蛋白表面電荷增多抑制蛋白受熱聚集有關(guān)[25]。當(dāng)超聲條件為600 W、6 min時抑制蛋白聚集的能力達(dá)到最大，β1蛋白結(jié)構(gòu)達(dá)到最小值。當(dāng)超聲時間進(jìn)一步增大時，β-折疊結(jié)構(gòu)增加[14]，同時伴隨著聚集體中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，抑制聚集的能力減弱，這可能是局部氨基酸序列之間和部分分子之間相互作用被破壞所致[33]。這表明適當(dāng)?shù)某曨A(yù)處理可在一定程度上抑制蛋白發(fā)生熱聚集，這與之前的研究結(jié)果一致。

2.5 蛋白三級結(jié)構(gòu)測定

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化可以通過內(nèi)源性熒光的最大吸收波長的變化來確定[34]。由圖4可知，與SSPI相比，STSPI的最大吸收波長出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象；超聲預(yù)處理后再經(jīng)過熱處理得到的可溶性蛋白，與STSPI相比，隨著超聲功率的增大，蛋白最大吸收波長出現(xiàn)不同程度紅移；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時間的增大，蛋白最大吸收波長出現(xiàn)藍(lán)移。加熱誘導(dǎo)蛋白聚集時，隨著溫度的增大，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集，發(fā)色基團被掩藏，最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移[18]。隨著超聲功率增大，蛋白發(fā)生的紅移現(xiàn)象可能與超聲使蛋白結(jié)構(gòu)柔性打開和伸展，暴露出疏水性基團和帶電粒子，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)抑制蛋白進(jìn)一步發(fā)生聚集有關(guān)，使蛋白暴露的發(fā)色基團較STSPI多，進(jìn)而發(fā)生紅移[35]。當(dāng)超聲功率和超聲時間為600 W和6 min時，疏水性基團達(dá)到穩(wěn)定值，蛋白溶液狀態(tài)達(dá)到一個穩(wěn)定態(tài)臨界值。但隨著超聲時間的進(jìn)一步增加，較高的疏水相互作用促使蛋白聚集，最大吸收波長較6 min 600 W-STSPI出現(xiàn)藍(lán)移。

圖4 超聲預(yù)處理對蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of ultrasonic pretreatment on tertiary structure of protein

2.6 蛋白表面疏水性的測定

Zeta電位通常被用來表征溶液體系的穩(wěn)定性，絕對值越大溶液越穩(wěn)定，而表面疏水性變化側(cè)面反映了大豆蛋白的結(jié)構(gòu)變化[8]，且對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能至關(guān)重要。由表4可知，與SSPI相比，STSPI的表面疏水性指數(shù)和電位絕對值增大；與STSPI相比，超聲預(yù)處理蛋白電位絕對值整體減小，且隨著超聲功率的增大，蛋白的表面疏水性指數(shù)和電位絕對值呈現(xiàn)增大趨勢；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時間的增大，蛋白的電位絕對值呈現(xiàn)減小趨勢，表面疏水性指數(shù)先增大后減小，且在6 min 600 W-STSPI電位絕對值達(dá)到最大值，在12 min 600 W-STSPI表面疏水性指數(shù)達(dá)到最大值。

表4 超聲預(yù)處理對蛋白電位和表面疏水性的影響Tab.4 Effect of ultrasonic pretreatment on protein potential values and surface hydrophobicity

熱處理可以打開蛋白結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水殘基和帶電基團暴露，電位絕對值增大，而蛋白疏水相互作用的增大可促進(jìn)蛋白發(fā)生聚集，導(dǎo)致蛋白表面疏水性降低[36]，表中STSPI的表面疏水性高于SSPI可能與蛋白聚集方式發(fā)生變化導(dǎo)致部分疏水性基團仍處于暴露態(tài)有關(guān)。超聲預(yù)處理導(dǎo)致電位絕對值整體減小，側(cè)面反映了超聲抑制聚集的作用。隨著超聲功率增大，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)子去折疊，從而導(dǎo)致最初在分子內(nèi)部的疏水基團數(shù)量增加并暴露于極性周圍環(huán)境[14]，增大空氣和水的界面面積，干擾分子間氫鍵和疏水相互作用[24]，同時游離官能團和帶電粒子數(shù)量的增多，增大了溶液中的靜電作用力，進(jìn)而增加溶液穩(wěn)態(tài)，抑制了蛋白熱誘導(dǎo)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致表面疏水性和電位絕對值增大[14]。且當(dāng)處理功率和時間達(dá)到600 W、6 min時抑制能力達(dá)到最大，蛋白溶液狀態(tài)達(dá)到一個穩(wěn)定態(tài)臨界值。隨著超聲時間的進(jìn)一步增加，蛋白的抑制能力減弱，高功率超聲波處理可能會增加蛋白結(jié)合程度，進(jìn)而降低蛋白分散體穩(wěn)定性，導(dǎo)致電位絕對值和表面疏水性減小[37]。

2.7 蛋白乳化性的測定

蛋白質(zhì)分子因具有疏水和親水的基團，從而能夠分別作用于油相和水相，起到乳化劑的作用。蛋白質(zhì)的熱聚集會影響蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的乳化性。如圖5(圖中同一參數(shù)不同字母表示差異顯著)所示，與SSPI相比，STSPI的乳化性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)降低；超聲預(yù)處理后再經(jīng)過熱處理得到的可溶性蛋白，與STSPI相比，隨著超聲功率的增大，蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)增大趨勢；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時間的增大，蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)減小趨勢，且在6 min、600 W時乳化性和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值。

圖5 超聲預(yù)處理對蛋白乳化特性的影響Fig.5 Effect of ultrasonic pretreatment on protein emulsifying properties

熱誘導(dǎo)降低了蛋白質(zhì)分子疏水性指數(shù)/親水性指數(shù)比值，蛋白質(zhì)分子柔韌性降低，在油水界面不能迅速展開，進(jìn)而降低了大豆蛋白的乳化性。超聲功率和超聲時間的增大可減小蛋白的粒徑和增大蛋白的比表面積，增加分子間靜電斥力和疏水相互作用，提高蛋白溶液穩(wěn)定性，抑制蛋白聚集，提高乳液界面吸附蛋白能力，進(jìn)而增強乳化性和乳化穩(wěn)定性[38-39]。當(dāng)超聲時間和功率增大到6 min、600 W時，蛋白的疏水性基團的暴露量達(dá)到臨界值。隨著超聲時間的增大，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水相互作用的破壞增加和蛋白質(zhì)分子運動的加速使蛋白逐漸發(fā)生聚集，乳液界面上大分子顆粒蛋白極易被小分子蛋白置換，乳液界面張力增大，乳液發(fā)生絮凝，造成乳化性和乳液穩(wěn)定性下降。

3 結(jié)論

(1)與SSPI相比，STSPI的平均粒徑、PDI和濁度分別升高了373.47 nm、0.06和303.69；官能團中二硫鍵和羰基質(zhì)量摩爾濃度分別升高了0.16 μmol/g和0.34 nmol/mg，游離巰基和氨基質(zhì)量摩爾濃度分別降低0.34 μmol/mg和0.08 μmol/g；二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，β1結(jié)構(gòu)相對含量提高了3.37個百分點；乳化性和乳化穩(wěn)定性指數(shù)分別降低了16.77 m2/g和60.03 min，表面疏水性指數(shù)提高了113.21。這表明熱聚集體可改變蛋白結(jié)構(gòu)，并降低蛋白的乳化特性。

(2)與STSPI相比，經(jīng)過超聲預(yù)處理(6 min、 600 W)的蛋白在進(jìn)行熱處理后，其平均粒徑、PDI、電位絕對值和濁度顯著降低，而α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)、表面疏水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性提高，微觀結(jié)構(gòu)變得均勻致密。這表明適當(dāng)?shù)某曨A(yù)處理可抑制因蛋白聚集而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而防止蛋白因熱聚集導(dǎo)致蛋白乳化特性的降低，這為解決因加熱引起蛋白乳化特性衰減問題提供了方法和理論。