榛花消腎安膠囊對糖尿病大鼠足細胞相關(guān)分子WT1、α3β1整合素表達的影響及與氧化應(yīng)激的相關(guān)性

韓香蓮 南征 樸松蘭

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

糖尿病腎病是一種發(fā)病率較高的糖尿病(DM)并發(fā)癥，也是全世界造成終末期腎病的主要疾病之一〔1,2〕。近年來，我國糖尿病腎病患者數(shù)量呈遞增趨勢發(fā)展，現(xiàn)已成為影響國民健康的重大疾病之一〔3～5〕。在糖尿病腎病病變早期會出現(xiàn)腎小球足細胞數(shù)量下降，濾過膜逐漸被破壞，滲出大量蛋白尿，或因基底膜與壁上層之間發(fā)生粘連，進而形成腎小球階段硬化灶〔6～8〕。榛花消腎安膠囊(ZHXSA)是依據(jù)“毒損腎絡(luò)，邪伏膜原”的糖尿病腎病病機，采取“解毒通絡(luò)、益腎達原”原則研制的方劑，在消渴病的治療方面，能夠獲得良好的臨床效果。本研究分析ZHXSA不同給藥大鼠腎母細胞瘤抑制基因(WT1)、α3β1整合素表達與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的差異。

1 資料與方法

1.1實驗材料 選取8周齡的健康Wistar雄性大鼠70只，體重180～220 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物中心〔合格證號：scxk(遼)2013-0003〕；主要實驗試劑包括，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，強生穩(wěn)豪血糖試紙、大鼠尿微量蛋白(ALB)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海希諾生物)；主要儀器包括，上海精密科學(xué)儀器FA1204B電子天平，意歐儀器儀表DT電子天平，強生穩(wěn)豪血糖儀，美國伯樂imark酶標(biāo)儀等。丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗大鼠WT1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)

1.2方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，采用隨機原則，將大鼠分為正常對照組(10只)與造模組(60只)；造模組以1%STZ(50 mg/kg)進行DM造模；72 h后采集大鼠尾靜脈血，依照隨機血糖≥16.7 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)判斷DM大鼠模型制備成功；將造模成功大鼠依照隨機原則分成5組，其中3組分別予以ZHXSA 1.00 g/kg、0.50 g/kg、0.25 g/kg灌胃，分別為ZHXSA高、中、低劑量組，另1組每日予以厄貝沙坦片20 mg/kg灌胃(厄貝沙坦組)，剩余1組DM大鼠不做任何處理，作為DM模型組；大鼠均連續(xù)觀察12 w后，腹主動脈取血，并在3 000 r/min、10 min條件下，獲取血清，置于-20℃環(huán)境下保存；解剖大鼠，獲取腎臟，經(jīng)固定、石蠟包埋切片、蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化等步驟；剩余腎臟組織檢測mRNA。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組WT1比較 正常對照組在光鏡中可見WT1沿著腎小球毛細血管按照線狀均勻分布，而且在足細胞核中的表達比較明顯。DM模型組WT1染色程度減弱，部分區(qū)域出現(xiàn)節(jié)段性缺失。ZHXSA高、中、低劑量組與厄貝沙坦組WT1表達略缺少，但與DM模型組比較有明顯改善。見圖1。

圖1 大鼠腎臟WT1(免疫組化，×400)

DM模型組，ZHXSA高、中、低劑量組，厄貝沙坦組WT1灰度值均比正常對照組顯著降低(P<0.01)；ZHXSA高、中、低劑量，厄貝沙坦組WT1灰度值均顯著高于DM模型組(P<0.01)；ZHXSA高劑量組WT1灰度值顯著高于低、中劑量組(P<0.05)；ZHXSA低、中劑量組WT1灰度值比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ZHXSA高劑量組WT1灰度值顯著高于厄貝沙組(P<0.05)。見表1。

2.2各組α3整合素表達差異 ZHXSA低、中、高劑量組，厄貝沙坦組，DM模型組α3整合素mRNA表達水平均顯著低于正常對照組(P<0.01)；ZHXSA低劑量組α3整合素mRNA表達水平與中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ZHXSA高劑量組與厄貝沙坦組α3整合素mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ZHXSA低、中、高劑量組，厄貝沙坦組α3整合素mRNA表達水平均顯著高于DM模型組(P<0.05)；ZHXSA低、中劑量組α3整合素表達水平均顯著低于厄貝沙坦組及ZHXSA高劑量組(P<0.05)。見表1。

2.3各組β1整合素表達差異 ZHXSA低、中、高劑量組，厄貝沙坦組，DM模型組β1整合素mRNA表達水平顯著低于正常對照組(P<0.01)；與DM模型組比較，ZHXSA高、中、低劑量組，厄貝沙坦組β1整合素mRNA表達水平均顯著提高(P<0.01)；ZHXSA低劑量組β1整合素mRNA表達水平顯著低于中劑量組(P<0.05)；ZHXSA低、中劑量β1整合素mRNA表達水平均顯著低于高劑量組及厄貝沙坦組(P<0.01)。見表1。

2.4各組MDA含量差異 ZHXSA低、中、高劑量組，厄貝沙坦組，DM模型組MDA含量均顯著高于正常對照組(P<0.01)；ZHXSA中、高劑量組，厄貝沙坦組MDA含量均顯著低于DM模型組(P<0.01)；ZHXSA低劑量組MDA含量水平顯著高于中、高劑量組及厄貝沙坦組(P<0.05)。見表1。

2.5各組SOD水平差異 ZHXSA低、中、高劑量組、厄貝沙坦組，DM模型組SOD水平均顯著低于正常對照組(P<0.01)；ZHXSA低、中、高劑量組，厄貝沙坦組SOD水平均顯著高于DM模型組(P<0.01)；低、中劑量組SOD水平均顯著低于厄貝沙坦組及高劑量組(P<0.01)。見表1。

2.6各組GSH-Px水平差異 ZHXSA低、中、高劑量組，厄貝沙坦組，DM模型組GSH-Px水平均低于正常對照組(P<0.01)；中藥高劑量組及厄貝沙坦組GSH-Px水平顯著高于DM模型組(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 各組WT1、α3整合素、β1整合素表達及MDA、SOD、GSH-Px含量比較

與正常對照組比較：1)P<0.01；與DM模型組比較：2)P<0.01,3)P<0.05；與ZHXSA中劑量組比較：4)P<0.05；與ZHXSA低劑量組比較：5)P<0.05；與厄貝沙坦組比較：6)P<0.05

3 討 論

糖尿病腎病早期病變?yōu)槟I小球高濾過及微量尿蛋白，尤其是蛋白尿是比較典型的臨床特征。目前，普遍認(rèn)同糖尿病腎病與機體糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)等因素有關(guān)，在此過程中涉及多個信號傳導(dǎo)通路及相應(yīng)的細胞因子，在不同作用下引起糖尿病腎病〔9，10〕。雖然目前尚未完全確定糖尿病腎病發(fā)病機制，但發(fā)現(xiàn)足細胞損傷在病情發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，這為糖尿病腎病的防控提供了新思路。

足細胞依附于腎小球基底膜外側(cè)，屬于腎小球濾過膜的一部分，是腎小球濾過功能中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔11〕。其中，WT1能夠體現(xiàn)成纖維細胞成長因子(FGF)-2引導(dǎo)的足細胞分化信號通路調(diào)解作用。α3β1整合素則屬于跨膜異聚體的一種，有α、β亞單位共同組成，在足細胞依附于腎小球基底膜上過程中起到重要作用，若α3β1整合素表達異常，則黏附作用隨之下降，造成足細胞脫落，進而可能造成腎小球濾過功能削弱，產(chǎn)生蛋白尿〔12〕。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠?qū)δI小球的足細胞增殖作用產(chǎn)生一定的影響，進而使其黏附作用受損〔13〕。而體內(nèi)處于高血糖狀態(tài)，則可通過多種途徑在腎小球足細胞內(nèi)形成活性氧簇，線粒體功能發(fā)出現(xiàn)障礙，介導(dǎo)足細胞進入凋亡進程，而足細胞也因此發(fā)生收縮、足突融合情況〔14〕。GSH-Px、SOD、MDA均在氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用〔15〕。而采取積極有效措施，能夠減少組細胞損傷程度，改善DM患者腎臟功能。

糖尿病腎病在祖國醫(yī)學(xué)中可歸屬于“腎消”及“水腫”等疾病范疇內(nèi)，因體內(nèi)脂膏堆積，另有痰、瘀、濕、熱等邪氣襲體日久，相互作用，形成毒邪，伏于膜原，腎絡(luò)受損，久則體用損傷，隨之腎間動氣傷甚，形成消渴腎病。但因膜原非藥石所及，故病情纏綿難愈。

本研究結(jié)果表明，ZHXSA組在降低MDA含量、提升SOD、GSH-Px水平，強化WT1、α3β1整合素mRNA的表達方面效用明顯。不僅如此，ZHXSA在提升WT1灰度值方面，表現(xiàn)出量效關(guān)系，在提高α3β1整合素 mRNA含量上看，表現(xiàn)出對濃度的一定程度依賴性。同時，從氧化應(yīng)激指標(biāo)上看，ZHXSA能夠降低MDA水平，提高SOD、GSH-Px含量，說明本藥具有抗氧化應(yīng)激的作用。

總之，ZHXSA能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激反應(yīng)，提高足細胞WT1及α3β1整合素水平，發(fā)揮腎臟保護作用。