基于油提取的土壤與沉積物中微塑料的分離方法

董明潭，羅澤嬌，邢新麗，張俏俏，孫 越

1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430078 2.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)李四光學(xué)院，湖北 武漢 430074

微塑料一詞首先由Thompson等[1]提出，是指環(huán)境中粒徑小于5 mm的塑料類污染物，有碎片狀、纖維狀、顆粒狀、發(fā)泡狀、薄膜狀等不同形貌形態(tài). 按照微塑料來源可以分為初級微塑料(商品中使用的塑料磨料、微珠等，如牙膏、洗面奶)與次級微塑料(由較大碎片進(jìn)一步風(fēng)化而來). 相較于較大的塑料而言，微塑料具有較小的粒徑、較大的比表面積等特點(diǎn)，被證實可隨大氣[2]、洋流[3-4]等方式進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳輸，通過攝食作用進(jìn)入生物體內(nèi)并經(jīng)食物鏈富集[5-7]，對重金屬與持久性有機(jī)污染物具有一定的吸附能力[8-11]. 這使得微塑料成為一種全球性新興污染物，并受到了廣泛關(guān)注.

目前關(guān)于微塑料的研究主要集中在濱海-海洋環(huán)境中，陸地生態(tài)系統(tǒng)作為微塑料的“源”在研究中往往被忽視，關(guān)于土壤與湖泊沉積物中微塑料的相關(guān)報道很少[12]，對于其中微塑料的污染特征、環(huán)境行為、生物效應(yīng)等也不是很清楚[13-14]. 因此，土壤與沉積物基質(zhì)中微塑料的分離提取作為該領(lǐng)域的關(guān)鍵與基礎(chǔ)工作，應(yīng)該予以高度重視[15]. 但受土壤與沉積物基質(zhì)復(fù)雜性的影響，尚缺乏一種經(jīng)濟(jì)、可靠、快速的手段將其從土壤與沉積物中分離出來，以便開展進(jìn)一步系統(tǒng)研究[16]. 現(xiàn)有研究中多使用不同密度的鹽溶液進(jìn)行浮選，最常見的為飽和NaCl溶液(1.19 g/cm3)[17-20]，但該溶液對聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚氯乙烯(PVC)等高密度聚合物的提取效果較差. LIU等[18]使用該方法在上海市開展的農(nóng)田微塑料研究中沒有觀察到PVC與PET；也有研究使用更高密度的ZnCl2[21]或者飽和NaI[22]溶液進(jìn)行浮選，但這些鹽溶液較為昂貴且對環(huán)境有害.

Crichton等[23]于2017年提出油提取方案(oil extraction protocol，OEP)，利用塑料的親油(脂)性，使用植物油代替密度液分離微塑料，針對濱海砂質(zhì)沉積物獲得了高回收率(96.1%±7.4%)與較快的樣品處理速度(90～168 min/樣)，且經(jīng)過醇處理后兼容傅里葉紅外光譜(FT-IR)檢測. 該方法提出兩年來共被引24次(Web of Science，截至2019年9月25日)，但并未有學(xué)者對其開展試驗驗證. 鑒于此，該研究對油提取法在不同質(zhì)地土壤與黏粒湖泊沉積物中的適用性進(jìn)行系統(tǒng)研究，對提取步驟進(jìn)行優(yōu)化與調(diào)整，以盡可能減少樣品或溶液轉(zhuǎn)移過程中的微塑料丟失問題，并使用所采集的不同質(zhì)地土壤與湖泊沉積物對其開展了實地驗證，以期為未來土壤與沉積物中微塑料的檢測與監(jiān)測工作提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

土壤樣品使用鐵鍬鏟取至玻璃罐中保存，采集表層(0～5 cm)樣品混合均勻. 砂土樣品采集于湖北省黃岡市羅田縣二長花崗巖風(fēng)化層殘坡積物(30°46′11.80″N、115°22′21.65″E)；壤土采集于湖北省武漢市江夏區(qū)菜地黃棕壤(30°23′28.95″N、114°27′17.81″E)；黏土采集于湖北省武漢市江夏區(qū)水稻田水稻土(30°12′26.99″N、114°01′34.22″E). 湖泊沉積物使用活塞式柱狀沉積物采樣器采集，采樣點(diǎn)位于湖北省武漢市東湖(30°32′57.58″N、114°21′51.27″E)，采樣深度為0～5 cm，采樣時保證對表層沉積物無擾動.

土壤樣品采集后于105 ℃下烘干至恒質(zhì)量，烘干后過18目(1 mm)篩以去除較大的石塊，在室溫下保存?zhèn)溆? 對于湖泊沉積物樣品，為避免烘干后固結(jié)、研磨對微塑料的破壞，采用混合均勻后的濕沉積物進(jìn)行微塑料提取與檢測，同時測定沉積物的含水量，定量分析時換算為干質(zhì)量. 湖泊沉積物采集后不做處理，于4 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2 標(biāo)準(zhǔn)微塑料制備

購買聚氯乙烯(PVC)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)這4種使用廣泛的塑料商品，分別代表密度較高(PVC，1.38 g/cm3；PET，1.37 g/cm3)與密度較低(PP，0.83～0.84 g/cm3；PS，1.05 g/cm3)的塑料. 使用粉碎機(jī)將其粉碎，過篩得35～60目(0.25～0.5 mm)大小的不規(guī)則塑料顆粒，制成標(biāo)準(zhǔn)品(見圖1). 所制備的微塑料具有獨(dú)特的大小與形狀，可與實際樣品中可能存在的微塑料相區(qū)別. 每種塑料具有不同的顏色以方便計數(shù)并計算回收率.

1.3 油提取方法

稱取10 g(干質(zhì)量)土壤或15～20 g(濕質(zhì)量)沉積物置于250 mL錐形瓶中，向其中加入每類微塑料標(biāo)準(zhǔn)品各10個，共計40個. 向錐形瓶中加入約5 mL油(玉米胚芽油，長壽花)與100 mL過濾水(經(jīng)過1 μm孔徑微孔濾膜預(yù)先過濾的自來水)，手動振蕩約30 s使油與微塑料充分接觸. 振蕩結(jié)束的標(biāo)志是土壤與沉積物完全分散，無成團(tuán)塊體，必要時可使用攪拌棒或磁力攪拌器. 靜置沉降15～30 min后將倒入配備有微孔濾膜(尼龍，孔徑20 μm，直徑47 mm，海鹽塑化科技有限公司)的過濾裝置上抽濾0.5～1 min. 上述步驟重復(fù)3次. 使用無水乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)沖洗過濾器與微孔濾膜，每次加入5 mL，浸泡約1 min后抽濾，重復(fù)2次. 在試驗過程中，使用過濾水沖洗錐形瓶瓶壁與過濾杯杯壁，以盡可能避免微塑料黏附在瓶壁上. 最后將濾膜取下轉(zhuǎn)移至保存盒中保存，在連續(xù)變倍體視顯微鏡(XTL165-MT, 鳳凰光學(xué)股份有限公司)下觀察、計數(shù)并計算回收率. 處理過程見圖2.

為了探究不同溶液浮選對微塑料回收率的影響，分別使用5 mL油和100 mL水(簡稱“油提取”)、5 mL油和100 mL飽和NaCl溶液(簡稱“NaCl-Oil聯(lián)合提取”)、100 mL飽和NaCl溶液(簡稱“NaCl浮選”)的組合進(jìn)行試驗. 每組進(jìn)行3次，共進(jìn)行12組合計36次回收率試驗. 計算每組3次試驗所得回收率的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差.

為驗證該方法在環(huán)境樣品中的可靠性，另稱取所采集的不同質(zhì)地自然土樣10 g(干質(zhì)量)與沉積物樣15～20 g(濕質(zhì)量)各1份，不加入塑料標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行油提取. 在體式顯微鏡下以50倍觀察大于100 μm的微塑料，計數(shù)并記錄其大小與顏色.

1.4 拉曼光譜分析

使用配備有532與633 nm激光的顯微共聚焦拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution, HORIBA，日本)逐個對微塑料進(jìn)行鑒定. 光譜采集范圍為300～3 300 cm-1，采集時間10 s，累計2次. 使用0.1%～5%(通常為1%)功率衰減片以避免燒穿樣品. 對于每個樣品，選擇不同部位并通過快速切換器切換532與633 nm激光以避免熒光干擾，重復(fù)測量3次以獲得質(zhì)量足夠好的光譜.

由于所用顯微共聚焦拉曼光譜儀沒有配備光譜數(shù)據(jù)庫，故預(yù)先收集各種常見類型的塑料并使用顯微共聚焦拉曼光譜儀在相同條件下收集光譜以建立標(biāo)準(zhǔn)光譜庫，共獲得8種聚合物類型合計19張光譜. 將實際樣品中微塑料的光譜與標(biāo)準(zhǔn)光譜進(jìn)行比對以確定聚合物類型. 拉曼光譜分析在中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)地質(zhì)過程與礦產(chǎn)資源國家重點(diǎn)實驗室完成.

1.5 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

取樣與試驗過程中，除湖泊沉積物取樣器為PMMA塑料材質(zhì)外，其余均使用玻璃制品. 試驗人員穿著棉質(zhì)而非化纖衣服. 錐形瓶等使用鋁箔紙覆蓋以避免空氣中可能的微塑料進(jìn)入容器中. 試驗使用的油與水均預(yù)先通過1 μm微孔濾膜(尼龍，孔徑1 μm，直徑47 mm，海鹽塑化科技有限公司)過濾以去除可能存在的微塑料. 微塑料目視計數(shù)由兩名經(jīng)驗豐富的試驗人員共同完成，以最大可能提高目視鑒定精度. 在利用該方法開展實地研究時，設(shè)置了3組空白對照，除不加入土樣外，其余操作均保持一致，以監(jiān)控實驗室大氣中可能存在的微塑料污染，但均未觀察到.

2 結(jié)果與分析

2.1 微塑料回收率

分析結(jié)果顯示，單獨(dú)使用油提取時，砂土、壤土、黏土、湖泊沉積物中微塑料的回收率(見表1)分別為88.3%±6.29%、88.3%±3.82%、90.0%±2.50%、90.8%±1.44%；而使用NaCl-Oil聯(lián)合提取時的回收率分別為89.2%±10.4%、94.2%±1.44%、95.0%±2.50%、97.5%±4.33%，相比單獨(dú)使用油提取時回收率明顯上升；單獨(dú)使用NaCl浮選時，微塑料的回收率分別僅為41.7%±14.7%、25.8%±7.64%、37.5%±4.33%、16.7%±16.1%，遠(yuǎn)低于使用油進(jìn)行提取時的回收率.

無論是單獨(dú)使用油提取還是NaCl-Oil聯(lián)合提取，微塑料回收率均表現(xiàn)為湖泊沉積物>黏土>壤土>砂土. 在單獨(dú)使用NaCl浮選時，針對PVC與PET兩種密度較高的聚合物回收率很低；針對PP、PS兩種密度較低的塑料回收率也僅為50%左右. 在壤土中，單獨(dú)使用油提取時，針對密度較高的PVC與PET，分別取得了93.3%±11.6%與96.7%±5.77%的高回收率.

表1 不同介質(zhì)中微塑料回收率

圖3 未處理微塑料與經(jīng)油提取后微塑料的拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectra of untreated microplastics and extracted microplastics

2.2 與拉曼光譜的兼容性

Crichton等[23]研究發(fā)現(xiàn)，油的加入會在FT-IR光譜圖上出現(xiàn)新的峰. 但該研究得到的拉曼光譜表征結(jié)果(見圖3)顯示，油的加入并沒有帶來新的峰，卻掩蓋了PS塑料峰值信號的強(qiáng)度，降低了信噪比，具有較強(qiáng)的背景干擾. 即使通過Origin非對稱最小二乘平滑算法去除基線后，仍只能觀察到PS在 1 000、1 030、2 903、3 051 cm-1處的4個信號最強(qiáng)的峰，其余位置(621、796、1 602 cm-1)的峰很難確認(rèn). 在經(jīng)過乙醇沖洗后，Raman光譜圖與未經(jīng)油提取前基本一致，表明使用無水乙醇沖洗可以較好地去油，從而避免對微塑料拉曼光譜表征的影響.

2.3 提取效果對比

油提取過程中，振蕩結(jié)束靜置10 min后，對比單獨(dú)油提取與NaCl-Oil聯(lián)合提取的靜置沉降效果(見圖4). 結(jié)果顯示，使用NaCl-Oil聯(lián)合提取的沉降效果優(yōu)于單獨(dú)使用油提取，縮短了靜置時間并獲得了更快的樣品處理速度. 但是，使用NaCl-Oil聯(lián)合提取時濾膜上的其他物質(zhì)明顯增多(見圖5)，加大了過濾的難度，也對微塑料的顯微鏡檢造成了干擾，需要在提取后通過使用30%的H2O2消解處理等進(jìn)一步的凈化手段予以去除.

注：對于每種供試土樣，左為油提取，右為NaCl-Oil聯(lián)合提取.圖4 油提取法與NaCl-Oil聯(lián)合提取法靜置沉降效果對比Fig.4 Comparison of static settling effect between oil extraction protocol and NaCl-Oil combined extraction protocol

注：對于每種供試土樣，左為油提取，右為NaCl-Oil聯(lián)合提取.圖5 油提取法與NaCl-Oil聯(lián)合提取法提取結(jié)果對比Fig.5 Comparison of extraction results between oil extraction protocol and NaCl-Oil combined extraction protocol

2.4 微塑料污染特征

由圖6可見，供試殘坡積物(砂土)、菜地(壤土)、水稻田(黏土)和湖泊沉積物中微塑料豐度分別為19個/(11.194 4 g)、17個/(10.544 7 g)、20個/(11.326 9 g)和31個/(4.063 3 g)(均以干質(zhì)量計，其中湖泊沉積物樣品通過測量含水量換算). 殘坡積物(砂土)中微塑料豐度為 1 697 個/kg，以藍(lán)色為主，占77.8%，其余則為無色(11.1%)與紅色(11.1%)；形態(tài)以纖維狀(66.7%)與碎片狀(33.3%)為主，平均長度為1 497 μm，長度為100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分別為0、44.4%、44.4%、11.1%；聚合物成分主要為聚乙烯(PE)、人造絲(Rayon)、PVC，三者占比均為22.2%.

圖6 土壤與沉積物中微塑料豐度、顏色、長度與聚合物種類Fig.6 The abundance, color, length, and polymer type of microplastics in soils and sediments

菜地(壤土)中微塑料豐度為 1 612個/kg，以無色(50.0%)與藍(lán)色(35.7%)為主，纖維狀占78.6%，碎片狀占21.4%；平均長度為1 351 μm，長度為100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分別為14.3%、28.6%、50.0%、7.14%；聚合物成分主要為PE、PVC、Rayon，占比分別為30.7%、23.1%、15.4%.

水稻田(黏土)微塑料豐度為1 766個/kg，以無色(75.0%)與藍(lán)色(20.0%)為主，纖維狀占55.5%，碎片狀占25.0%；平均長度為 1 119 μm，長度為100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分別為25.0%、35.0%、40.0%、0；聚合物成分主要為PE、PET、PVC、Rayon，占比分別為26.3%、21.1%、21.1%、15.8%.

湖泊沉積物中微塑料豐度為 7 624個/kg，微塑料的形態(tài)以纖維狀與長條狀碎片為主，顏色為藍(lán)色(60.7%)、無色(32.1%)與紅色(7.14%). 平均長度為 1 317 μm，長度為100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分別為14.3%、32.1%、46.4%、7.14%；聚合物成分主要為PET、PVC、Rayon，占比分別為26.7%、20.0%、16.7%，其他聚合物成分主要為聚酰胺PA(13.3%)、PE(10.0%)、PP(10.0%).

綜上，該研究中湖泊沉積物中微塑料豐度顯著高于土壤中微塑料豐度，不同質(zhì)地土壤中微塑料豐度之間均無顯著差別；微塑料形態(tài)均以纖維狀或長條狀碎片為主，缺少球狀與顆粒狀，平均長度主要集中在500～3 000 μm之間；Rayon、PET、PVC、PE是最主要的聚合物成分.

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)移過程與H2O2凈化對回收率的影響

Crichton等[23]在油提取步驟中，首先將錐形瓶中的油層與水層倒入分液漏斗中，在分液漏斗中再次靜置后再傾倒至過濾裝置中進(jìn)行過濾，實現(xiàn)梯次靜置以盡可能減少進(jìn)入濾膜上其他物質(zhì)(懸浮顆粒物、細(xì)小的植物體等)的豐度. 但在上述過程中溶液轉(zhuǎn)移2次，增加了微塑料丟失的可能. 為盡可能減少溶液轉(zhuǎn)移次數(shù)以減少微塑料丟失的可能性，可直接將錐形瓶中上清液倒入過濾裝置中.

油提取法利用塑料的親油性將塑料聚集在溶液表層的油層中，同時溶液中仍含有懸浮顆粒物、細(xì)小的植物體等雜質(zhì)，直接傾倒相比梯次靜置可能會導(dǎo)致更多的雜質(zhì)進(jìn)入濾膜，增大了濾膜堵塞的可能性. 離心操作在密度浮選法中常被用來減少進(jìn)入到濾膜上的雜質(zhì)[24]，但不能夠應(yīng)用于油提取中，這會使微塑料回到土壤或沉積物中并降低回收率. 該研究將Crichton等[23]方案中的靜置時間從3～5 min延至15～40 min，通過延長靜置時間達(dá)到減少雜質(zhì)的目的，在應(yīng)用中可根據(jù)需要進(jìn)一步延長. 此外，還可以在每次傾倒后更換濾膜，將一個樣品過濾至3個不同的濾膜上，以預(yù)防濾膜堵塞.

NaCl-Oil聯(lián)合提取可將微塑料的回收率提至95%以上，同時加快了沉降速率，減少沉降時間，但也增加了進(jìn)入濾膜上的雜質(zhì)含量(見圖5)，加大了顯微鏡檢的難度. 在使用密度浮選法時，常在浮選之前使用30%的H2O2進(jìn)行凈化. 而在使用油提取法時，Crichton等[23]研究表明，在提取之前進(jìn)行H2O2凈化處理會降低回收率. 該研究在壤土中進(jìn)行油提取時，同樣發(fā)現(xiàn)在提取之前進(jìn)行H2O2凈化時，微塑料回收率從88.3%±3.82%降至36.7%±13.8%，與Crichton等[23]的結(jié)論一致. 在油提取后進(jìn)行H2O2凈化處理則不會對微塑料回收率造成顯著影響，但會延長樣品處理時間.

3.2 樣品質(zhì)量要求

將該研究與國內(nèi)近期其他研究所得數(shù)據(jù)進(jìn)行對比(見表2)發(fā)現(xiàn)，不同研究者所得土壤中微塑料豐度存在數(shù)量級的差距. 由于各研究所采用的提取方法不同，導(dǎo)致數(shù)據(jù)之間的可比性較差. 大部分研究沒有給出具體的樣品量，筆者使用約10 g土壤樣品進(jìn)行微塑料的浮選，獲得微塑料約20個，足夠進(jìn)行微塑料的目視鑒定與光譜表征；Mathalon等[27]使用10 g的樣品也觀察到了20～80個微塑料. 在使用更大的樣品質(zhì)量進(jìn)行微塑料提取時，不僅會增加前處理過程的難度，延長處理時間并可能堵塞濾膜，也不太可能將得到的所有微塑料逐個進(jìn)行光譜表征. 因此，筆者建議，在能夠獲取到約20個微塑料時，使用10 g左右的小樣品質(zhì)量進(jìn)行微塑料提取是可行的. 在未來的研究中也應(yīng)該注意樣品質(zhì)量對所得微塑料豐度的影響.

表2 不同研究中土壤微塑料提取方法與微塑料特征對比

注：—表示無數(shù)據(jù).

3.3 微塑料形態(tài)特點(diǎn)與聚合物種類

該研究所選不同質(zhì)地土壤中纖維狀與長條狀碎片是最主要的微塑料形態(tài). 大量實地研究[22,27-31]也表明，纖維狀是最常見的微塑料形態(tài)，但回收率研究中使用的標(biāo)準(zhǔn)品卻是不規(guī)則顆粒狀微塑料. 因此，如何制備并投放纖維狀微塑料標(biāo)準(zhǔn)品是今后方法學(xué)研究工作的一個難點(diǎn). 纖維狀微塑料長度為 2 000～5 000 μm，但其寬度只有5～15 μm. 顯微紅外光譜儀最小檢測直徑通常為20 μm，無法滿足纖維狀微塑料的檢測要求[15]. 因此，在鑒定纖維狀微塑料時，推薦使用顯微拉曼光譜進(jìn)行表征.

武漢市東湖沉積物中微塑料豐度為 7 624個/kg，高于YUAN等[27]在鄱陽湖沉積物中測得的54～506個/kg，除了不同提取方法對微塑料豐度的影響外，可能也與武漢市東湖作為我國最大的城中湖，其周圍人類活動頻繁有關(guān). 有研究表明，洗滌期間每套成人衣服可以減少約 1 900 根PET[32]，而武漢市東湖沉積物中微塑料主要類型為PET與Rayon，且主要形態(tài)為纖維狀，說明紡織品洗滌可能是微塑料的重要來源之一.

相比于其他研究(見表2)而言，該研究在土壤中檢出PP與PE的基礎(chǔ)上，更多地檢出了PET與PVC這兩種密度較高的微塑料. PET與PVC是在使用飽和NaCl提取時很難被檢出的，以往的研究中可能忽視了環(huán)境中存在的PET與PVC微塑料.

4 結(jié)論

a) 油提取法針對常見種類的微塑料均具有良好的回收率，是當(dāng)下密度浮選技術(shù)的可替代方案，具有高回收率、經(jīng)濟(jì)、快速、可靠的特點(diǎn).

b) 油提取法針對高密度聚合物(PVC、PET)仍然具有較高的回收率(>90%)，在不同質(zhì)地土壤與沉積物中均可使用，具有廣泛的適用性.

c) 油提取法具有較快的樣品處理速度，根據(jù)樣品質(zhì)地不同，60～120 min內(nèi)即可處理一個樣品. 處理后的雜質(zhì)較少，便于在顯微鏡下進(jìn)行觀察與計數(shù).

d) 油的加入會干擾FT-IR與Raman光譜表征，但可使用無水乙醇沖洗去除，具有良好的兼容性.