不同濕地植物脫氮效果與根際土壤微生物群落功能多樣性特征分析

潘福霞, 來曉雙, 李 欣, 趙玉強, 王樹志, 王 惠

1.濟南市環(huán)境研究院, 山東 濟南 250100 2.濟南大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院, 山東 濟南 250022

人工濕地是指由人工建造和控制運行的濕地系統(tǒng)，通過植物-微生物-基質(zhì)系統(tǒng)的物理、化學(xué)、生物協(xié)同作用來實現(xiàn)對污水的高效凈化[1]，與傳統(tǒng)污水處理方法相比，人工濕地具有建設(shè)費用低、運行費用低、處理效果好等優(yōu)點，被廣泛用于處理農(nóng)村生活污水、污水廠尾水以及微污染的河水[2-3].

2017年全國環(huán)境統(tǒng)計公報數(shù)據(jù)顯示，我國工業(yè)源氨氮、農(nóng)業(yè)源氨氮、城鎮(zhèn)生活氨氮排放量分別為21.7×104、72.6×104、134.1×104t[4]，氮是主要的富營養(yǎng)化元素之一，并且以多種形態(tài)存在于水體環(huán)境中，是威脅水環(huán)境安全的重要因子，因此對人工濕地脫氮效果的研究尤為重要. 濕地植物可直接吸收利用水體中的氮素，通過收割可將其從濕地中去除[5]. 但李林鋒等[6]研究表明，收割植物地上部分在人工濕地系統(tǒng)氮去除中并非重要措施，并且不同植物間差異較大，去除率范圍為0.3%～14.1%，濕地植物更多的是發(fā)揮間接生態(tài)效應(yīng). LIN等[7]研究表明，88%～96%的硝態(tài)氮是通過微生物的反硝化過程去除的. HU等[8]采用15N同位素標記方法研究復(fù)合垂直流人工濕地NH4+去除率，表明約75.2%～85.6%的NH4+是通過硝化-反硝化和厭氧氨氧化微生物轉(zhuǎn)化去除的，可見微生物在脫氮過程中居主導(dǎo)地位. 濕地植物發(fā)揮生態(tài)效應(yīng)的重要方面之一是植物根對微生物活性和群落組成的影響，植物根際對微生物的影響主要表現(xiàn)在2個方面：①為微生物提供能源物質(zhì)，植物根系向土壤中釋放大量糖類、醇類和酸類等分泌物，這些碳源可促進微生物的生長繁殖，同時細根的腐解也向土壤中補充了有機碳，為異養(yǎng)微生物提供能源，促進微生物生長繁殖[9]；②植物根系泌氧為好氧微生物提供適宜生境，在整體還原態(tài)的基質(zhì)中，形成了根區(qū)氧化態(tài)的微環(huán)境，為好氧、兼性、厭氧微生物提供適宜生境，增加微生物種類，有利于微生物對污染物的降解，促進了人工濕地凈化效果[10-11]. 可見，植物對基質(zhì)中微生物的影響直接關(guān)系到氮素的去除效率. 研究表明，植物的根系形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理生態(tài)特征與養(yǎng)分去除率密切相關(guān)[12]，不同種類植物的總有機碳釋放速率存在顯著差異，其范圍為 0.171 5～0.922 1 mg/(g·d)(以根干質(zhì)量計)[13]，植物種類對總氮和銨態(tài)氮的去除率有顯著影響，相同水力負荷下表現(xiàn)為旱傘草(長根型)>花葉蘆竹(中根型)>黃菖蒲(短根型)[14]，因此，了解不同濕地植物根際效應(yīng)對微生物群落功能多樣性的影響是探究人工濕地脫氮機制的重要方面之一.

Biolog法是研究微生物代謝功能多樣性的有效方法，能夠擺脫傳統(tǒng)分離純菌的限制而獲得微生物群落總體活性與代謝功能的信息[15]. Biolog生態(tài)板有31種碳源，通過微生物對多種碳底物的不同利用差異來反映微生物群落生理特征的變化，是描述微生物群落總體活性與代謝功能多樣性的一種簡單、快速的方法[16]. 濕地植物種類眾多，應(yīng)優(yōu)先選擇鄉(xiāng)土植物、養(yǎng)護管理要求低、對環(huán)境友好的植物種類. 北方地區(qū)冬季寒冷，在植物選擇上需考慮其耐寒性，蘆葦和香蒲抗寒能力強，為多年生植物，易于管理、較易成活、成本低，在北方濕地中應(yīng)用較廣. 該研究以蘆葦和香蒲為研究對象，在水平潛流型人工濕地原位采集土壤樣品，比較不同濕地植物根際效應(yīng)對微生物活性的影響，以期為水平潛流型人工濕地植物-微生物-土壤(基質(zhì))系統(tǒng)中氮去除提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試水平潛流型人工濕地

供試水平潛流型人工濕地位于濟南市長清區(qū)的西區(qū)污水廠，共7個濕地單元，每個濕地單元長6 m，寬4 m. 該濕地主要采用原土、粗砂和礫石作為填料，基質(zhì)層厚度為1.05 m，基質(zhì)層由上到下依次為土壤種植層、粗砂層、5～10 mm礫石層、10～30 mm礫石層、30～70 mm礫石層、70～100 mm礫石層、粗砂層，各層厚度依次為0.20、0.10、0.15、0.15、0.15、0.30、0.10 m. 濕地進水為污水廠處理的尾水，ρ(DO)、ρ(CODCr)、ρ(NH4+)、ρ(TN)、ρ(TP)分別為7.99、24.24、2.28、32.79、2.01 mg/L，人工濕地水力負荷為0.33 m3/(m2·d).

水平潛流型人工濕地種植植物為北方地區(qū)常用的香蒲和蘆葦，其中，1、3、5號濕地單元種植蘆葦，2、4、6號濕地單元種植香蒲，7號濕地不種植物做空白對照. 2017年2月移栽蘆葦和香蒲，于根袋(孔徑為0.074 mm)中裝入2 kg土壤，將蘆葦和香蒲分別種植于根袋中，再將根袋埋到土壤層中. 2017年8月30日蘆葦和香蒲生長旺盛期采集土壤樣品，分別采集1、3、5號濕地單元中蘆葦根際土壤(簡稱“LR”)和2、4、6號濕地單元中香蒲根際土壤(簡稱“XR”)，采集7號地中不種植物的土壤作為對照(簡稱“CK”)，采集的土壤樣品用于測定土壤理化性質(zhì)和微生物群落功能多樣性.

1.2 水質(zhì)監(jiān)測

水質(zhì)監(jiān)測從8月9日開始，每5 d采集1次，采樣后立即測定ρ(TN)和ρ(NH3-N). 采用《水和廢水檢測分析方法》[17]中的方法進行測定.

1.3 土壤樣品理化性質(zhì)測定

土壤pH采用土水比為1∶5(4 g土加入20 mL水)的土壤懸浮液測定[18]. 土壤樣品用2 mol/L KCl浸提(5 g土加入25 mL KCl溶液浸提)后用流動分析儀(FIA QC8500，Lachat，美國)測定w(NH4+)、w(NO3-)、w(NO2-)[18]. 土壤樣品經(jīng)超純水浸提(5 g土加入25 mL超純水浸提)后用總有機碳分析儀(TOC-V CPH，SHIMADZU，日本)測定可溶性有機碳濃度[18].

1.4 土壤微生物碳源利用特征分析

稱取新鮮土壤10 g(以干物質(zhì)計)于滅菌錐形瓶中，加入90 mL滅菌生理鹽水(0.85% NaCl溶液)，以200 r/min振蕩30 min，靜置10 min后，依次稀釋至 1 000 倍，接種至Biolog生態(tài)板上，每孔加樣量為150 μL. 在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，分別于24、48、72、96、120、144 h在590 nm測定每孔的吸光值[19].

土壤微生物碳源利用指標有微生物代謝活性、碳源利用豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener 均勻度指數(shù)，各指標計算方法參考文獻[20].

微生物的代謝活性采用AWCD (average well color development，顏色平均變化趨勢)表示，計算公式：

(1)

式中，ODi為第i個孔的吸光值與空白對照孔吸光值之差.

碳源利用豐富度指數(shù)(S)用顏色變化的孔數(shù)表征.

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)計算公式：

(2)

(3)

式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板所有孔中相對吸光值總和的比值.

Shannon-Wiener均勻度指數(shù)(E)：

E=H/lgS

(4)

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素(one-way ANOVA)和鄧肯(Duncan)法進行方差分析和差異顯著性比較，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 污水TN和NH3-N去除率

對人工濕地出水的ρ(NH3)和ρ(TN)進行了測定，結(jié)果表明不同處理中NH3-N去除率均高于44%，TN去除率均高于41%. 由圖1可見：LR和XR的NH3-N去除率均高于CK，LR的NH3-N去除率較CK高12%～30%，XR的NH3-N去除率較CK高7%～33%；XR的TN去除率較CK高10%～24%，除8月19日LR的TN去除率低于CK外，其余均高于CK.

2.2 土壤理化性質(zhì)

由表1可見：LR和XR的pH均低于CK；而LR和XR的w(DOC)和w(NH4+)均顯著高于CK; XR的w(NO3-)顯著高于CK，而LR的w(NO3-)則與CK無顯著差異; XR的w(DOC)和w(NO3-)均顯著高于LR.

2.3 土壤微生物碳源利用比較分析

AWCD是反映土壤微生物代謝活性的重要指標. 由圖2可見：隨培養(yǎng)時間的延長，土壤微生物的總碳源代謝強度呈逐漸增加趨勢，培養(yǎng)24～120 h內(nèi)呈線性增加，培養(yǎng)148 h后趨于穩(wěn)定；LR和XR的土壤微生物碳源利用率增加速度顯著快于CK，XR土壤微生物碳源利用率高于LR.

表1 土壤理化性質(zhì)

注：不同小寫字母表示差異性檢測達到顯著水平(p<0.05).

圖2 土壤微生物群落AWCD分析Fig.2 Changes in average well color development with incubation time

按照Gryta等[21]的方法將31種碳源分為5類，分別為聚合物類、碳水化合物類、氨基酸類、羧酸和酮酸類、胺類. 由圖3可見：LR和XR的土壤微生物均表現(xiàn)為對碳水化合物類碳源的相對利用率最高，均在48.0%以上. LR的土壤微生物對氨基酸類、聚合物類、羧酸和酮酸類碳源的相對利用率基本一致，分別為18.9%、17.0%、16.3%. XR的土壤微生物對羧酸和酮酸類碳源的相對利用率僅次于碳水化合物類，為27.0%；其次是氨基酸類碳源，為19.6%. CK的土壤微生物對碳水化合物類和聚合物類碳源的相對利用率均較高，分別為34.4%和32.7%；其次是氨基酸類以及羧酸和酮酸類碳源，分別為15.9%和14.4%.

2.4 土壤微生物多樣性指數(shù)分析

由表2可見：LR和XR土壤微生物的碳源利用豐富度指數(shù)分別為22和23，比CK分別增加了47.0%和53.0%；LR和XR土壤微生物的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分別為1.29和1.17，比CK分別增加了61.3%和46.3%；LR和XR土壤微生物的Shannon-Wiener均勻度指數(shù)分別為0.96和0.85，比CK分別增加了41.2%和25.0%. LR和XR土壤微生物的豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均顯著高于對照土壤.

圖3 培養(yǎng)96 h后土壤微生物對碳源的相對利用率Fig.3 Relative microbial utilization rate of carbon sources after incubate for 96 h

表2 土壤微生物多樣性指標分析結(jié)果

注：不同小寫字母表示差異性檢測達到顯著水平(p<0.05).

圖4 培養(yǎng)96 h后土壤微生物群落碳源利用特征的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil microbial community carbon source utilization after incubate for 96 h

2.5 土壤微生物群落碳源利用特征的主成分分析

選取微生物對數(shù)生長期(96 h)的AWCD值做主成分分析，PC1和PC2的累積貢獻率達61.7%，基本可以表征原來31個變量的特征，因此取前2個主成分作圖表征不同土壤微生物群落碳源代謝特征. 由圖4可見，種植植物的根際土壤(LR和XR)與CK完全區(qū)分開，LR和XR集中在PC1正端和PC2負端，CK集中在PC1負端和PC2正端，說明種植植物的根際土壤和對照土壤的微生物對碳源利用率存在顯著差異，而LR與XR的土壤微生物對碳源利用多樣性不能完全區(qū)分，說明不同植物對土壤微生物碳源利用多樣性的影響較小.

3 討論

3.1 種植植物對脫氮效率的影響

該研究中種植蘆葦和香蒲均增加了水平潛流型人工濕地出水NH3-N的去除效率，種植香蒲增加了TN的去除效率. 奉小憂等[22]在模擬人工濕地上研究了菖蒲、香蒲、千屈菜、蘆葦和白鶴芋對NH3-N的去除效果，認為在相同水力停留時間條件下，植物對NH3-N去除率無顯著影響；而Carballeira等[23]研究表明，與不種植物相比，種植植物能夠提高70%的氮去除率. 人工濕地植物脫氮研究結(jié)果差異可能歸咎于植物對人工濕地的影響較復(fù)雜，其對脫氮效率的影響主要表現(xiàn)在2個方面：①植物對污染物的直接吸收作用. 對人工濕地植物不同種植密度的研究[24]發(fā)現(xiàn)，高密度(20株/m2)與低密度(10株/m2)處理的污水凈化效果和微生物群落組成無顯著差異，但種植植物的水質(zhì)凈化效果和微生物豐度均顯著高于不種植物的對照；也有研究[6]認為，植物吸收的氮主要儲存在地下部，若在植物不收割的情況下，植物的吸收對氮去除的貢獻不大. 該研究中種植的植物為多年生蘆葦和香蒲，均未進行收割，因此植物的吸收作用對氮去除的影響可能較小. ②植物根際效應(yīng)重塑了微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物活性增加，實現(xiàn)微生物對氮的轉(zhuǎn)化，提高脫氮效率. WANG等[25]對潛流型人工濕地處理低濃度生活污水的研究表明，在夏季種植植物和不種植物處理的微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著差異，而冬季則存在顯著差異，因此在不同溫度條件下，植物可能通過對微生物的間接影響提高脫氮效率. 硝化和反硝化過程作為人工濕地主要脫氮途徑，其脫氮效率也會受到植物根際影響. 植物根系泌氧導(dǎo)致根際周圍存在好氧、缺氧和厭氧環(huán)境，為多種微生物提供適宜生境，促進了多種微生物共同協(xié)作，并在脫氮中發(fā)揮作用. 硝化作用是氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟，在低氧條件下，該過程會成為人工濕地脫氮的限速步驟. Paranychianakis等[26]認為，濕地植物通過釋放氧氣提高脫氮效率，植物根系泌氧促進了根際好氧的氨氧化菌繁殖及其活性的提高，有利于硝化作用對NH3-N的去除，氨氧化古菌在NH3氧化中起重要的作用，且在不同植物間無顯著差異. 當人工濕地中各種形態(tài)的氮轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定態(tài)的NO3-后，可以通過反硝化作用將其轉(zhuǎn)化成N2，反硝化菌大多為異養(yǎng)，植物根系分泌物中含有的低分子量有機酸(如乙酸、草酸和琥珀酸等)、糖、氨基酸和次級代謝產(chǎn)物可以為其提供碳源，促進反硝化菌繁殖和活性提高，從而提高反硝化作用對硝態(tài)氮的去除率[9]. WU等[27]研究表明，反硝化菌受根系分泌物濃度的影響，如蔗糖顯著影響根際編碼nirS蛋白的反硝化菌群落結(jié)構(gòu)，蔗糖和草酸顯著影響根際編碼nirK蛋白的反硝化菌群落結(jié)構(gòu). 然而，該研究未對硝化和反硝化活性及功能微生物進行分析，在后期研究中應(yīng)采用同位素技術(shù)深入研究種植植物對硝化和反硝化速率以及功能微生物的影響，闡明人工濕地植物對脫氮的間接生態(tài)效應(yīng).

3.2 不同植物對微生物群落功能多樣性的影響

AWCD值變化速率的差異可以反映不同處理土壤微生物的代謝活性差異，AWCD值增加越快，表明微生物的代謝活性越高. 該研究中種植植物的根際土壤微生物的AWCD值均高于不種植物的對照，可能是根際環(huán)境對土壤微生物具有較大的影響. 研究[28]表明，植物光合作用固定的碳有5%～25%會以根系分泌物的形式釋放到土壤中，根系分泌物在根際微生物分布、生長和繁殖中發(fā)揮著重要作用，濕地植物根際有機碳釋放速率、根系分泌物類型或數(shù)量均會影響根系周圍微生物豐度和活性. 該研究中根際土壤微生物的豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均高于對照，說明種植植物促進了微生物物種多樣性，除了根際碳沉積作用外，植物根系泌氧也會對土壤微生物碳源代謝活性產(chǎn)生影響[29]，植物氧釋放可以改變氧化還原電位和促進微生物活性[30]，氧氣釋放量與總氮的去除率存在正相關(guān)關(guān)系[31]. WANG等[32]對比了種植植物、植物收割和不種植物三種處理，發(fā)現(xiàn)種植植物能夠增加氧釋放、促進銨態(tài)氮的去除、顯著增加微生物豐度. WANG等[33]采用13C-PLFA 技術(shù)研究了種植植物對土壤微生物的影響，發(fā)現(xiàn)與不種植物的空白對照相比，種植植物的土壤微生物量顯著增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，真菌和革蘭氏陰性菌相對比例增加. 該研究中空白對照的土壤微生物對碳水化合物、氨基酸、羧酸和酮酸類碳源的相對利用率均低于種植植物的根際土壤，而對聚合物和胺類的相對利用率均高于種植植物的根際土壤，不同處理間對碳源相對利用率的差異也歸咎于植物根際環(huán)境對微生物群落組分的改變，然而Biolog技術(shù)只能從整體上反映微生物活性的變化，無法準確分析碳源利用率與脫氮效率的關(guān)系，因此后期工作中需進一步研究植物對氮轉(zhuǎn)化功能微生物群落結(jié)構(gòu)的影響.

該研究中對96 h的AWCD值進行PCA分析，結(jié)果表明種植植物與不種植物存在顯著差異，而種植蘆葦和香蒲對土壤微生物碳源利用的差異不顯著. 研究[34]發(fā)現(xiàn)，植物根系泌氧量和植物根系分泌物組成受營養(yǎng)物質(zhì)組分、溫度和光照等環(huán)境條件的影響，并且根系泌氧量和根系分泌物需達到一定濃度才對微生物產(chǎn)生作用，因此該研究中不同植物對土壤微生物碳源代謝不顯著的原因，可能是蘆葦和香蒲的生長條件相似且根系泌氧量和根系分泌物濃度差異較小，不足以對微生物整體活性產(chǎn)生顯著差異. 因此，在后期研究中需要對蘆葦和香蒲根系泌氧狀況及根系分泌物總量和種類進行分析，還需對植物根系泌氧和根系分泌物與微生物群落組分和氮轉(zhuǎn)化功能微生物相關(guān)性進行分析，以期闡明植物對水平潛流型人工濕地氮去除的作用機制.

4 結(jié)論

a) 水平潛流型人工濕地種植蘆葦和香蒲均可提高NH3-N去除率，其出水中NH3-N去除率較對照高7%～33%.

b) 蘆葦和香蒲根際土壤的w(DOC)和w(NH4+)均顯著高于對照土壤.

c) 在水平潛流型人工濕地種植蘆葦和香蒲改變了土壤微生物碳源利用率和碳源利用類型. 蘆葦和香蒲的根際土壤微生物碳源利用率增加速度均顯著高于對照. 蘆葦和香蒲的根際土壤微生物均對碳水化合物的相對利用率最高，均在48.0%以上，而對照土壤微生物對碳水化合物和聚合物的相對利用率較高，分別為34.4%和32.7%.

d) 水平潛流型人工濕地種植蘆葦和香蒲改變了土壤微生物的多樣性. 蘆葦和香蒲根際土壤微生物的豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener均勻度指數(shù)均顯著高于對照土壤，而蘆葦和香蒲根際土壤的微生物群落組成無顯著差異.