構(gòu)建與鑒定人源 ITPKB 基因腺病毒載體

傅海壽 蔡鵬威

福建省立金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建省福州市 350008

肌醇1,4,5-三磷酸3-激酶(The Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase，ITPKs)是能催化Ins(1,4,5)P3 (IP3) 生成Ins(1,3,4,5)P4 (IP4)的蛋白酶，屬于肌醇多磷酸激酶(IPK)家族，在人類有ITPKA、ITPKB、ITPKC三種亞型[1-2]。其中ITPKA主要表達(dá)在前腦、浦肯野神經(jīng)元及睪丸；ITPKB在腦及其他組織中廣泛表達(dá)，主要參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞起作用；ITPKC在大部分組織中均有表達(dá)，可能與川崎病及主動(dòng)脈瘤有關(guān)[1，3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)局麻藥毒性反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載有關(guān)[4]。ITPKB對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控最敏感[5]，故設(shè)計(jì)制作人源 ITPKB 基因腺病毒載體可能為局麻藥毒性的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于吉?jiǎng)P基因生物公司；ITPKB基因及質(zhì)粒由維真生物公司包裝合成；高糖培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)于Gibico；胎牛血清購(gòu)于Gibico；DNA限制性內(nèi)切酶ASISI/NotI、T4DNA連接酶、脫氧核糖核苷三磷酸(dNDP)、DNA marker、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、q-PCR試劑盒均購(gòu)于Takara公司；PCR引物由Thermofisher公司合成；轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(PEI)購(gòu)于上海廣瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù) Genbank查詢的結(jié)果,全基因合成人源ITPKB基因，目的基因前都加kozak序列GCCACC，C端添加標(biāo)簽：flag，上游引物為5’-AGGACACGCAGGGAGTTTC-3’，下游引物為5’-TGGTAGGCAGGTACGAAGGG-3’，分別在上游引物和下游引物的5’端加入ASISI和NotI酶切位點(diǎn)。

1.2.2 人源ITPKB基因的獲?。壕酆厦告湻磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增合成的ITPKB基因，ITPKB基因全長(zhǎng)為2 841bp。反應(yīng)條件設(shè)置95℃ 預(yù)變性15s，60℃退火 15s，72℃延伸15s， 40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析并進(jìn)行膠回收。

1.2.3 腺病毒穿梭載體pADM-ITPKB-FLAG-GFP的構(gòu)建：將步驟1.2.2膠回收的擴(kuò)增產(chǎn)物與pAdM-FH-GFP質(zhì)?；旌?，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶ASISI/NotI雙酶切，37℃，3h反應(yīng)后行凝膠電泳鑒定?；厥漳康臈l帶的凝膠，將回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于含有芐青霉素的培養(yǎng)皿的LB平板37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16h。挑取質(zhì)粒陽性克隆的菌落，酶切驗(yàn)證菌落的產(chǎn)物，選擇酶切正確載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物CMV-F，BGH-R，正確質(zhì)粒進(jìn)行去內(nèi)毒素手提，下傳包裝。

1.2.4 在HEK293細(xì)胞中制備ITPKB重組腺病毒：250μl DMEM和8μl PEI配成Mix 1，靜置5min以上；250μl DMEM和酶切后的重組質(zhì)粒配成Mix 2；將Mix 1和Mix 2混合，震蕩混勻，離心后靜置30min；隨后與新鋪6孔板HEK293細(xì)胞[(0.3～0.5)×106個(gè)/孔]混合置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約6h后更換培養(yǎng)液。觀察90%細(xì)胞出現(xiàn)病變(Cytopathic effect，CPE)，收集上清繼續(xù)感染HEK293細(xì)胞以擴(kuò)增病毒；同時(shí)收集具有細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的細(xì)胞，離心，分別收集上清和細(xì)胞沉淀。

1.2.5 收集、純化及濃縮腺病毒：病毒上清中加入NaCl和PEG8000后搖勻，4℃直立放置過夜后，離心，收集病毒沉淀，用2ml A195將病毒沉淀重懸，收集到15ml管中。細(xì)胞沉淀用6ml A195重懸，混勻，反復(fù)凍融4次。凍融時(shí)把樣品放在干冰中凍12～15min，然后拿到37℃水浴鍋中融2～3min，如此反復(fù)4次；4℃，離心，分別收集上清和沉淀(細(xì)胞碎片)，上清與重懸后的病毒沉淀混合；細(xì)胞碎片用2ml A195重懸后加入0.5ml 5mol/L NaCl至終濃度為1mol/L。超聲破壞細(xì)胞碎片，離心完后，與病毒上清和細(xì)胞沉淀處理后的樣品混合。采用碘克沙醇密度梯度離心純化病毒，超濾管過濾收集濃縮病毒。

1.2.6 PCR檢測(cè)腺病毒滴度：腺病毒破除病毒外殼，離心，取上清進(jìn)行q-PCR檢查。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，7個(gè)梯度稀釋濃度分別：2.58E+12vp/μl，2.58E+11vp/μl，2.58E+10vp/μl，2.58E+9vp/μl，2.58E+8vp/μl，2.58E+7vp/μl, 2.58E+6vp/μl，并將超純水作為陰性對(duì)照。配制PCR反應(yīng)體系，每個(gè)樣品20μl體系(2X SYBR Green緩沖液 10μl、引物 0.8μl、超純水 7.2μl、病毒樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 2μl)，進(jìn)行PCR反應(yīng): 95℃ 5min；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 15s； 40個(gè)cycles。病毒顆粒數(shù):病毒顆粒數(shù)(個(gè)/ml)=標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)值×1 000。

1.2.7 PCR檢測(cè)pADM-ITPKB-FLAG-GFP與pADM-FH-GFP感染HEK293細(xì)胞：pADM-ITPKB-FLAG-GFP腺病毒感染HEK293細(xì)胞，MOI為10-3，設(shè)置為ADM-ITPKB組，pADM-FH-GFP腺病毒感染HEK293細(xì)胞，MOI為10-3，設(shè)置為ADM-FH-GFP組。設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，24h后收取細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA。分光光度計(jì)測(cè)定提取 RNA 的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA并進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ITPKB基因擴(kuò)增產(chǎn)物PCR鑒定 利用PCR方法擴(kuò)增ITPKB基因后得到ITPKB片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到的PCR產(chǎn)物大小約2 800bp，與Genbank中的ITPKB DNA 2 841bp大小一致，見圖1。

圖1 ITPKB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 重組穿梭質(zhì)粒pADM-ITPKB的鑒定 pADM-ITPKB陽性克隆的PCR和雙酶切鑒定用ITPKB引物對(duì)隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)出陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增獲得約為3 000bp的條帶；雙酶切鑒定得到3 000bp的條帶與ITPKB相當(dāng)，表明陽性轉(zhuǎn)化子中含有ITPKB的目的基因。見圖2～4。

圖2 包裝前載體圖

2.3 腺病毒的包裝 助感染試劑(ADV-HR)和pADM-ITPKB-FLAG-GFP與pADM-FH-GFPrAd-pADM-GFP的包裝穿梭質(zhì)粒感染HEK293細(xì)胞1～2d，可見到光鏡下可觀察到空斑形成，細(xì)胞變圓、腫脹、脫壁、細(xì)胞核變大等病變。1周后熒光顯微鏡下可見大約40%的綠色熒光。第12日，可見大部分包裝細(xì)胞腫脹脫落。熒光顯微鏡觀察視野滿布綠色熒光(圖5)，重組腺病毒構(gòu)建成功。

圖3包裝后載體圖

圖4限制性核酸內(nèi)切酶酶切后電泳圖

圖5 重組腺病毒在HEK293細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白

2.4 病毒滴度的測(cè)定 經(jīng)過反復(fù)感染、擴(kuò)增，根據(jù)TCID50法進(jìn)行滴度測(cè)定，測(cè)得重組腺病毒滴度5×1010PFU/ml，重組腺病毒滴度1×1010PFU/ml。pADM-ITPKB-FLAG-GFP陽性克隆測(cè)序鑒定結(jié)果顯示正確。

2.5 q-PCR檢測(cè)HEK293細(xì)胞mRNA表達(dá)量 ADM-ITPKB組HEK293細(xì)胞ITPKB mRNA的表達(dá)量為ADM-FH-GFP組的 22 851.6 倍，兩組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

圖6 ADM-FH-GFP組與ADM-ITPKB組ITPKB表達(dá)量的比較與ADM-FH-GFP組比較,

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載可能與局麻藥毒性相關(guān)并通過以下途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷[6-8]，第一，通過線粒體途徑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時(shí)，線粒體可通過Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)器攝取胞內(nèi)Ca2+，當(dāng)超過一定范圍時(shí)，可造成線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔道(Permeability transition pore，PTP)開放，許多大分子物質(zhì)可由此通道進(jìn)入線粒體，造成線粒體膜電位改變及功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第二，通過激活鈣敏感相關(guān)酶途徑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí)，Ca2+可激活Ca2+依賴性磷脂酶，導(dǎo)致膜磷脂分解，同時(shí)產(chǎn)生游離脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物均對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生毒性作用。此外Ca2+還可激活鈣蛋白酶，而鈣蛋白酶是各種細(xì)胞毒物質(zhì)造成細(xì)胞死亡的重要物質(zhì)。

ITPKb可通過介導(dǎo)IP3生成IP4參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)。一方面，IP3是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使分子，通過作用于胞漿中的肌醇三磷酸受體，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣釋放，Ca2+可與鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，激活下游鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)，形成Ca2+-CaM-CaMKⅡ信號(hào)通路誘發(fā)細(xì)胞凋亡。另一方面ITPKB可能通過上調(diào)IP4, 與特異性蛋白R(shí)as3結(jié)合，抑制Ras/ERK1/2活性，抑制Bim活化，從而抑制細(xì)胞凋亡[9]。

本課題以人源ITPKB為目的基因。采用重組腺病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了pADM-ITPKB-FLAG-GFP，所獲病毒滴度較高，序列測(cè)序和PCR簽定結(jié)果表明重組腺病毒ITPKB基因表達(dá)正確。通過q-PCR檢測(cè)腺病毒感染HEK293細(xì)胞后ITPKB mRNA的表達(dá)量，表明腺病毒可上調(diào)ITPKB基因表達(dá)。本研究為ITPKB基因治療和局麻藥毒性研究提供了某些參考。