miR-200c通過下調TUBB3基因表達逆轉老年肺癌患者順鉑耐藥性的機制

趙云龍，李少軍，陳平，劉陽

(1解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心胸外科，北京 100048; 2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心胸外科，北京 100853)

肺癌是全球范圍內發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一[1]。大多數(shù)肺癌患者早期并無明顯癥狀，很多患者確診時已處于中晚期且伴有病灶遠處轉移，因而失去外科手術切除或放療的機會[2]。美國2019年癌癥生存統(tǒng)計報告數(shù)據(jù)表明，約3/4的肺癌幸存者年齡≥65歲，肺癌確診的中位年齡為70歲，老年人已成為肺癌的高發(fā)人群[3]。近年來，肺癌的新型治療藥物不斷問世，其中，分子靶向治療藥物由于其特異性強和毒副反應小等優(yōu)點，為老年肺癌患者提供了更多治療選擇。但是，該類藥物因其適應證存在局限性，并不適合大多數(shù)老年肺癌患者。以鉑類藥物為主的聯(lián)合化療方案仍然是老年肺癌治療的標準一線化療方案。但是，隨著鉑類化療藥物在臨床中的廣泛應用，腫瘤細胞對此類藥物的耐藥性也逐漸增強，從而導致化療療效明顯降低，這給老年肺癌的治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)；另一方面，由于老年患者的重要器官功能均存在一定程度的衰退，因藥物耐受性欠佳等原因，很多老年患者不得不選擇放棄化療[4]。

microRNA(miRNA)是一類內源性非蛋白編碼的小分子RNA，約18～24個核苷酸，可通過與靶mRNA的互補序列相結合在轉錄后水平調控基因表達，進而誘導靶mRNA的降解或基因沉默[5]。大量研究表明，miRNA對幾乎所有已知的癌變過程，包括細胞生長、增殖、分化、血管生成、細胞凋亡以及侵襲和轉移均具有調節(jié)作用[6]。miR-200c作為miRNA家族的成員，已成為近年的研究熱點，其在惡性腫瘤發(fā)病機制中的作用備受關注[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c家族作為重要的抑癌基因在肺癌組織中呈低表達。近年有研究報道，miR-200c在正常干細胞與乳腺癌干細胞中的表達顯著下調，證實miR-200c過表達可通過靶向干細胞再生因子BMI-1顯著抑制乳腺癌干細胞的干性特征[8,9]。然而，miR-200c在肺癌耐藥性中的作用機制尚不完全清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人肺癌細胞系A549和A549/順鉑(cisplatin, DDP)均購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；順鉑和染色試劑噻唑蘭(MTT)購自Sigma生物公司；脂質體2000 購自Invitrogen 生物公司；兔抗人β-actin、TUBB3、survivin和Bcl-2單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；siRNA由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 細胞準備

采用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺癌A549細胞及其順鉑耐藥株A549/DDP，在實驗過程中取對數(shù)生長期細胞。以miR-200c模擬物(miR-200c mimics)分別轉染A549細胞和A549/DDP細胞并設陰性對照(negative control, NC)組。

1.3 MTS法檢測miR-200c對細胞耐藥性的影響

取對數(shù)生長期細胞，以2×104/ml密度接種于96孔板，每孔100 μl，放置過夜使細胞貼壁生長。將不同濃度的順鉑加入到對應的實驗孔中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后吸去培養(yǎng)基，加入100 μl 0.5 mg/ml 的MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育結束后，在490 nm波長處測定光密度(A490 nm)，并根據(jù)公式[細胞抑制率=(1-實驗組A490 nm/對照組A490 nm)×100%]計算藥物對細胞生長的抑制率。以順鉑濃度對數(shù)值為橫坐標、細胞抑制率為縱坐標作圖并擬合抑制曲線，求得IC50值。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

首先根據(jù)實驗設計分組以miR-200c mimics轉染，轉染48 h后收集細胞，以PBS緩沖液洗滌2次；取細胞數(shù)為2×105個的細胞懸液，離心并棄去上清液，加入195 μl結合液，再次輕輕反復吹打細胞懸液后，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻，在室溫和避光環(huán)境下繼續(xù)孵育10 min后，離心，棄上清液。再加入10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，混勻，在1 h內用流式細胞術檢測。以上步驟重復操作3次。

1.5 檢測A549/DDP細胞中多種蛋白的表達

取miR-200c mimics轉染的、處于對數(shù)生長期的A549/DDP細胞裂解液提取蛋白。采用二辛可寧酸法測定細胞裂解液中的蛋白含量。12%SDS-PAGE電泳分離后，采用半干轉移法將分離膠內的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1% Tween 20，pH7.5)封閉PVDF膜后洗膜，滴加一抗；4℃下過夜培養(yǎng)，洗滌去除一抗后，加HRP標記的二抗在室溫下孵育2 h，洗膜；凝膠成像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以β-actin為內參照計算蛋白的相對含量。

1.6 采用實時PCR法檢測miR-200c和TUBB3mRNA的表達

收集轉染后的各組細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明書要求操作，反轉錄合成cDNA并進行PCR反應，反應條件為95℃ 20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃ 10 s，共40個循環(huán)。miR-200c表達量以2-ΔΔCT表示。miR-200c反轉錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG-GATACGACTCCATC-3′；PCR上游引物：5′-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。TUBB3上游引物:5′-AAAGAATTCGACGCCACGGCCGAGGAAGAGG-3′，下游引物:5′-AAAAAGCTTAAGGGTATCTGACAGCAATAGA-3′。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。結果以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞株的miR-200c表達情況

A549轉染組中的miR-200c的表達水平顯著高于A549/DDP轉染組(P<0.001；圖1A)；A549/DDP miR200c mimics 轉染組中的miR-200c表達水平明顯高于NC組(P<0.01；圖1B)。

2.2 miR-200c表達對A549/DDP細胞順鉑敏感性的影響

與NC組相比，miR200c mimics組中的A549/DDP細胞株對順鉑的敏感性顯著增加，IC50值由(37.3±3.1)μmol/L下降至(15.3±3.3)μmol/L(P<0.01)。

2.3 miR-200c對A549/DDP細胞凋亡的影響

采用Annexinv-FITC/PI 雙染法檢測miR-200c過表達對A549/DDP細胞凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn)：過表達miR-200c的A549/DDP組的細胞凋亡率明顯高于NC組(P<0.01；圖2)。

2.4 miR-200c對A549/DDP細胞中survivin和Bcl-2蛋白表達的影響

為了進一步探討miR-200c逆轉A549/DDP耐藥性，我們觀察了miR-200c是否與腫瘤耐藥相關基因survivin和Bcl-2的蛋白表達相關。結果發(fā)現(xiàn)A549/DDP過表達miR-200c后，survivin和Bcl-2蛋白表達明顯下調(圖3)。

2.5 miR-200c增加肺癌細胞對順鉑的耐藥性的機制

通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，TUBB3可能是miR-200c的靶基因，而survivin和Bcl-2并非miR-200c的靶蛋白(圖4A)。為了驗證這一假設，我們首先在A549/DDP細胞中轉染miR-200c mimics，檢測TUBB3蛋白和mRNA的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-200c后，TUBB3蛋白和mRNA的表達均下調(P<0.01；圖4B,C)；其次，我們構建了TUBB3 3′UTR野生型和突變型熒光素酶報告載體，并利用雙熒光素酶活性分析檢測miR-200c對TUBB3基因表達的調控作用和結合位點(P<0.01；圖4D)。這些結果均證實TUBB3為miR-200c的下游靶基因。最后，為了與miR-200c mimics轉染組比較，我們在過表達miR-200c的A549/DDP細胞株中同時轉染了pcDNA-TUBB3質粒，結果發(fā)現(xiàn)survivin和Bcl-2蛋白的表達較miR-200c mimics組上調(圖4E)。上述結果證實miR-200c可通過下調其下游靶分子TUBB3的基因表達下調survivin和Bcl2蛋白的表達，最終增加肺癌細胞對順鉑的耐藥性。

圖1 A549/DDP細胞中miR-200c的表達

圖2 各組細胞凋亡率結果

圖3 各組survivin和Bcl-2蛋白的表達情況

Figure 3 Expression of survivin and Bcl-2 proteins in each group

圖4 miR-200c通過調控其下游靶分子TUBB3而影響survivin和Bcl2的表達

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，是最常見的惡性腫瘤之一。多數(shù)肺癌患者，尤其是老年患者，確診時已屬于中晚期。隨著全球老齡化的加劇，老年肺癌患者的人數(shù)不斷增加。由于老年肺癌患者身體的各個器官機能均處于衰退階段，而且患有的基礎疾病較多，故外科治療風險較大；另外，化療雖然是中晚期肺癌治療相對安全有效的方法，但由于老年患者腎功能減退以及藥物治療不耐受等原因，嚴重影響了其在老年肺癌患者中的療效[10，11]。

近年來，由于治療方案的不斷優(yōu)化，靶向藥物不斷涌現(xiàn)，老年肺癌的治療現(xiàn)狀得到了明顯改善[12]。靶向藥物治療和免疫療法在肺癌治療中已取得重大進展，而且效果較為顯著，但其高昂的治療費用卻使得很多患者望而卻步。目前鉑類化療方案仍然是最常用的標準治療方案，而且順鉑也是最經(jīng)濟的治療藥物。順鉑可通過誘導細胞凋亡阻止腫瘤細胞的生長，其作用機制為通過靶向DNA和拓撲異構酶Ⅱ(TopoⅡ)抑制DNA的轉錄與合成[13]。但在肺癌治療的臨床實踐中，順鉑較高的耐藥率，使其療效明顯降低[14]，這一問題亟待解決。

因此，解決腫瘤細胞的耐藥性、研究逆轉腫瘤耐藥性的機制與方法對于提高老年肺癌患者的生存率和改善生活質量具有非常重要的意義。

近年來的大量研究發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物在抗腫瘤作用和腫瘤耐藥性中的機制甚為復雜。這些機制通常與胞飲過程、銅離子受體、谷胱甘肽、銅轉運P型ATP酶(ATP7B)以及DNA修復蛋白等多種因素有關[4]。因此，目前尚未發(fā)現(xiàn)合適的靶點能夠逆轉腫瘤細胞對鉑類藥物的耐藥性。近來，miRNA作為調控腫瘤細胞侵襲、轉移、耐藥及凋亡的關鍵因子而備受關注[15,16]。其中miR-200c參與對多個經(jīng)典細胞信號通路的調節(jié)，從而調控腫瘤細胞的侵襲、耐藥及凋亡等過程。在臨床實踐中，尤其是老年肺癌患者，通常由于沒有較好的外科治療條件而不得不將化療作為首選治療方法，但腫瘤細胞對化療不敏感，這是所有臨床醫(yī)師面臨的最大挑戰(zhàn)，因為這不僅會增加患者的痛苦，而且可能會延誤治療時機，降低療效。miR-200c在腫瘤中的異常表達是抗腫瘤治療療效評估的一個重要因素，其作為一種生物標志物，使得個體化診斷及治療成為可能，以此增加抗腫瘤療效，同時也能緩解惡性腫瘤患者的心理應激狀態(tài)[17-19]。survivin僅在腫瘤細胞和胚胎組織中表達，其可抑制腫瘤細胞的凋亡并具有腫瘤特異性，是細胞凋亡抑制蛋白家族的成員，能夠促進細胞增殖和血管形成[20]，已成為一個公認的具有較高價值的腫瘤治療靶點。Bcl-2蛋白可抑制腫瘤細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的耐藥性與Bcl-2在腫瘤中的高表達密切相關[21, 22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌順鉑耐藥的細胞株A549/DDP中，下調survivin與Bcl-2蛋白的表達可逆轉腫瘤細胞的耐藥性。

本研究結果表明，在非小細胞肺癌順鉑耐藥的A549/DDP細胞株中，miR-200c表達明顯下調，表明miR-200c的低表達與腫瘤產生耐藥性的過程密切相關。miR-200c mimics轉染顯著降低了survivin和Bcl-2蛋白的表達，同時可顯著增加A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。這些結果表明，過表達miR-200c可能通過對survivin和Bcl-蛋白表達水平的調節(jié)顯著減少細胞株的順鉑耐藥性。另外，本研究同時探討了miR-200c對survivin和Bcl-2蛋白表達的調控過程。TUBB3是唯一一種能夠影響微管穩(wěn)定性的微管蛋白，其表達的差異直接與化療藥物敏感性相關。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌腫瘤細胞中，上調miR-200c表達可通過抑制TUBB3表達增加腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性。本研究同樣發(fā)現(xiàn)肺癌細胞過表達miR-200c后，TUBB3蛋白和mRNA的表達水平均下調。而且，在過表達miR-200c的A549/DDP細胞中過表達TUBB3基因后，結果發(fā)現(xiàn)survivin和Bcl-2蛋白的表達高于miR-200c mimics組。綜上，我們發(fā)現(xiàn)miR-200c過表達可明顯增加順鉑在肺癌治療中的敏感性，能夠導致與腫瘤耐藥相關基因survivin和Bcl-2的蛋白表達水平下調，進一步證實 miR-200c可通過下調其下游靶分子TUBB3基因的表達從而下調survivin和Bcl-2蛋白表達，以增加肺癌細胞對順鉑的耐藥性。

綜上所述，miR-200c通過對TUBB3基因表達調節(jié)在逆轉肺癌順鉑耐藥性的過程中發(fā)揮重要作用，其作用機制可能與多種耐藥和細胞凋亡相關蛋白的表達調控密切相關。對相關耐藥機制的進一步明確可為老年肺癌患者制定個體化治療策略提供參考依據(jù)。