醫(yī)用鈦板表面涂層2-MPC對細菌生物膜形成的影響

李舟，楊明坤，何坤林，王靖，劉泯邑，柯明池，王業(yè)華

(1.通江新區(qū)醫(yī)院骨科，四川 巴中 636057；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科，江蘇 徐州 221000)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，內固定在臨床使用越來越廣泛，感染是骨科內固定術后較為嚴重的并發(fā)癥之一[1]。它不僅影響骨折的愈合及患者術后的功能康復，難以治愈，并且極易形成慢性骨髓炎或感染性骨不連，甚至面臨截肢的危險[2]。近年來，針對內固定感染的原因進行了諸多研究，發(fā)現(xiàn)細菌生物膜形成是內固定術后感染難以控制和反復發(fā)作的主要原因[3]，如何預防內固定上細菌生物膜形成是研究的重點。2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，2-MPC)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型材料，它是一種仿細胞膜結構的物質，具有較好的組織相容性且能抑制血小板、蛋白質、細菌等物質的黏附作用[4]。既往日本學者制作了含有和不含有2-MPC聚合物的涂層鋼板與細菌共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中一半的標本接受了抗生素，結果在沒有涂層的樣品表面有細菌生物膜形成，而有涂層的樣品表面未觀察到生物膜的形成[5]。但是將2-MPC材料用于骨科鈦合金內固定上預防細菌生物膜形成的效果尚未見報道。本研究擬通過化學接枝法將2-MPC涂層于醫(yī)用鈦板表面[6]，探討其對金黃色葡萄球菌細菌生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及菌株生長條件

1.1.1 主要實驗材料 采用醫(yī)用鈦板(Ti-6Al-4V，尺寸：10 mm×10 mm×2 mm，創(chuàng)生醫(yī)療器械有限公司)；金黃色葡萄球菌ATCC25923(中國藥品生物制品檢定所)；2-MPC(南京樂天然生物科技有限公司)。

1.1.2 菌株生長條件 將金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC25923)在有氧條件下置入胰蛋白胨大豆肉湯溶液中震蕩過夜(130 r/min，37℃)培養(yǎng)24 h。取增菌液劃線接種Baird-Parker平板37℃培養(yǎng)48 h、顯色平板37℃培養(yǎng)24 h、血平板37℃培養(yǎng)24h?？梢删湓贐aird-Parker平板上菌落直徑2～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。金黃色葡萄球菌的鑒定：(1)染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏染色陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽孢、無莢膜。(2)血漿凝固酶試驗：挑取各平板上可疑菌落1個，分別接種到0.5 mL腦心浸液肉湯37℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物0.3 mL接種到滅菌生理鹽水溶解的凍干兔血漿瓶中，37℃培養(yǎng)，觀察6 h，呈凝固體積大于原體積的一半被判為陽性結果。將經(jīng)過檢驗的金黃色葡萄球菌挑取單個新鮮菌落，通過比濁儀將菌液調至最終菌液濃度1.5×106cfu/mL，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 醫(yī)用鈦板表面2-MPC涂層的制備 將清洗干凈的醫(yī)用鈦板浸入10 mmol/L KH550的甲苯溶液中3 h，使KH550吸附醫(yī)用鈦板表面，經(jīng)甲苯和乙醇依次清洗，用氮氣吹干后在110℃下固化1 h，將表面氨基化。表面氨基化后鈦板浸入濃度為10 mg/mL的2-MPC乙醇溶液中，使表面產(chǎn)生的氨基與2-MPC的雙鍵之間發(fā)生Michael加成反應(見圖1)[7]。室溫保持反應24h后，在無水乙醇中超聲清洗3次，用氮氣吹干后在40℃真空干燥24 h。2-MPC涂層鈦板制備成功后高壓蒸汽消毒后備用。

1.2.2 建立細菌生物膜模型 參考傳統(tǒng)Brown平板法[8]將實驗組(涂層2-MPC鈦板)及對照組(單純鈦板)鈦板各40塊分別依序放入無菌6孔培養(yǎng)板中，1塊/孔。沿培養(yǎng)孔側壁緩慢加入已制備的金黃色葡萄球菌懸液，5 mL/孔，使鈦板完全浸泡于金黃色葡萄球菌懸液中，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。

圖1 KH550吸附于鈦板表面后與2-MPC發(fā)生Michael加成反應示意圖[7]

1.2.3 噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)比色法測定細菌生物膜內活菌數(shù) 依據(jù)文獻建立金葡菌(ATCC25923)菌液濃度與MTT法吸光度(A570)的標準曲線，得出曲線方程Y=-4.961×107+4.656 8×108X(R2=0.000)[9]。于體外培養(yǎng)24 h、48 h時分別于六孔板中移出兩組鈦板各10塊，用無菌生理鹽水沖洗去除表層浮游菌，置入無菌玻璃試管并加入2 mL的胰蛋白胨大豆肉湯溶液中，弱超聲(f：50 Hz)處理7 min，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，每孔再加入5 mg/mL的MTT 10 μL，充分混勻，37℃恒溫箱中反應4 h，每孔再加入100 μL二甲基亞砜，室溫震蕩混勻后在酶標儀上，OD570處讀取酶標值，依標準曲線換算成活菌數(shù)。

1.2.4 掃描電鏡觀察 于體外培養(yǎng)24 h、48 h時分別于六孔板中移出實驗組、對照組鈦板各10塊，用無菌生理鹽水沖洗去除表層浮游菌，然后于質量濃度為2.5%的戊二醛溶液中固定，無水乙醇梯度脫水后，離子濺射儀噴金，應用掃描電鏡觀察單個視野下的細菌計數(shù)(放大5 000倍下觀察)，同時觀察48 h時細菌生物膜形成情況(放大20 000倍視野)。

2 結 果

2.1 鈦板表面形貌的掃描電鏡觀察 掃描電鏡所采集圖像顯示單純醫(yī)用鈦板表面紋理清晰，凹凸不平(見圖2a)，涂層2-MPC醫(yī)用鈦板表面平整光滑，鈦板原有紋理消失(見圖2b)。

2.2 鈦板表面活菌計數(shù) 由標準曲線方程換算所得膜內活菌數(shù)，實驗組24 h膜內活菌數(shù)為(1.49±0.91)×107cfu/mL，48h膜內活菌數(shù)為(5.60±1.71)×107cfu/mL；對照組24 h膜內活菌數(shù)為(23.01±2.23)×107cfu/mL，48h膜內活菌數(shù)為(45.31±4.46)×107cfu/mL。同一時間點實驗組與對照組膜內活菌數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

2.3 掃描電鏡觀察結果 依據(jù)文獻[10]的方法對鈦板表面細菌進行半定量評估，實驗組24 h黏附金葡菌為“+”，48 h黏附金葡菌為“++”；對照組24h黏附金葡菌為“+++”，48 h黏附金葡菌為“++++”(共采集5個視野，“+”為每個視野中少于20個細菌，“++”為每個視野中有20～100個細菌，“+++”為每個視野中有100～200個細菌，“++++”為每個視野中超過200個細菌)。

對照組與實驗組體外培養(yǎng)24 h后均觀察到鈦板表面有細菌黏附，但實驗組鈦板表面細菌黏附量明顯少于對照組(P=0.000，見圖3a～b)；對照組與實驗組體外培養(yǎng)48 h后鈦板表面細菌黏附量較24 h時均增多，但實驗組亦明顯少于對照組(P=0.000，見圖3c～d)。于20 000倍視野下觀察實驗組及對照組鈦板表面細菌生物膜形態(tài)，可見對照組鈦板表面黏附細菌胞周分泌大量多糖蛋白，纖維樣網(wǎng)狀結構，將細菌與細菌、細菌與鈦板黏附在一起。而實驗組鈦板表面黏附細菌胞周僅分泌少量多糖蛋白，細菌與細菌、細菌與鈦板之間無明顯聯(lián)系(見圖4)。

a 普通鈦板表面形貌特征 b 鈦板表面接枝2-MPC后表面形貌特征

圖2 實驗組及對照組鈦板表面形貌特征(掃描電鏡，×5 000)

a 體外培養(yǎng)24 h對照組鈦板表面的細菌量 b 體外培養(yǎng)24 h實驗組鈦板表面的細菌量

c 體外培養(yǎng)48 h對照組鈦板表面的細菌量 d 體外培養(yǎng)48 h實驗組鈦板表面的細菌量圖3 細菌在實驗組及對照組鈦板表面黏附量(掃描電鏡，×5 000)

3 討 論

內固定術后感染難以治愈的主要原因是內固定材料上細菌生物膜的形成[1]。細菌生物膜是細菌克隆產(chǎn)生的一層多糖-蛋白質復合物，是細菌在自然界的一種生存方式，是細菌避免受到宿主的防御反應和化學治療藥物的攻擊的一道防御屏障[9]。細菌生物膜上細菌對抗生素的耐藥性高于浮游菌狀態(tài)下細菌耐藥性[10]，從而導致全身應用抗生素的效果不佳。

細菌通過黏附與聚集兩個階段在內固定材料表面形成細菌生物膜[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，細菌能黏附于大多數(shù)醫(yī)療器械、生物醫(yī)學材料表面，并可在24～48 h內形成細菌生物膜。目前對已成熟穩(wěn)定的生物膜尚無有效的治療方法，因此采取相應措施干預內固定物表面細菌生物膜形成，是預防內固定術后感染的重要手段。

細菌黏附在內固定表面是細菌生物膜形成的起始步驟，如果能夠抑制細菌在內固定材料表面的黏附，則可抑制細菌生物膜的形成[13]。但是目前抑制細菌黏附的方法不多，主要包括：(1)植入體內的內置物必須非常潔凈，在植入時才從包裝內取出，最大限度減少細菌的黏附；(2)設計能夠抵抗細菌黏附的內置物材料，如在內置物材料內加入銀離子；(3)在內置物材料表面涂層抗生素；上述方法效果均有限[14]。2-MPC是較早提出的仿細胞膜結構的物質[4]，將其與憎水性丙烯酸酯類單體共聚得到具有親水、親油兩親性的共聚物。研究表明用2-MPC聚合物對生物材料表面進行仿細胞膜外層結構的修飾，可顯著增加材料的生物兼容性，減少蛋白吸附及細胞黏附[15]。本研究中，我們通過化學接枝法將2-MPC涂層于醫(yī)用鈦板表面，掃描電鏡觀察可見涂層2-MPC鈦板表面光滑平整，鈦板原有凹凸不平紋理消失，說明應用化學接枝法將2-MPC涂至鈦板表面是一種簡單可行的方法。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)對照組與實驗組體外培養(yǎng)24 h后均觀察到鈦板表面細菌黏附，但實驗組鈦板表面細菌黏附量明顯少于對照組(P=0.000)，對照組與實驗組體外培養(yǎng)48 h后鈦板表面細菌黏附量較24 h時均增多，但實驗組亦明顯少于對照組(P=0.000)。這就說明2-MPC涂層于骨科內固定材料表面有抑制細菌黏附的作用。進一步通過掃描電鏡20 000倍視野觀察可見48 h時對照組鈦板表面黏附細菌胞周分泌了大量多糖蛋白，纖維樣網(wǎng)狀結構形成，細菌與細菌之間形成緊密聯(lián)系，而實驗組鈦板表面黏附細菌僅有少量多糖蛋白分泌，細菌間無明顯聯(lián)系。掃描電鏡結果說明涂層2-MPC鈦板能有效抑制細菌黏附進而減少細菌生物膜的形成。

2-MPC聚合物抑制細菌在鈦板表面的黏附，進而減少細菌生物膜的形成，其機制目前還不清楚[16]。許多抗菌材料在體外實驗均顯示出較好的抗菌效果，但在體內的抗菌效果卻并不太理想[17]。主要的問題是當材料被移植到體內，材料表面就會立即被纖維蛋白原、纖維蛋白、血小板等黏附，從而形成了細菌黏附的載體，細菌就能很輕易的形成菌膜，失去了體外明顯的抗菌效果。2-MPC能有效抑制體內纖維蛋白、血小板等物質的黏附[18]。其可能機制是：2-MPC仿細胞膜結構能夠有效的降低細菌胞外多糖的黏附作用，使細菌生物膜形成的初始黏附階段受到抑制，進而大量的細菌無法通過胞外多糖黏附于一起，最終減少細菌生物膜的形成。

綜上所述，涂層2-MPC鈦板在體外實驗中能有效抑制細菌在鈦板表面的黏附，進而減少細菌生物膜的形成。但是在體內的應用還需進一步實驗驗證，目前看來，2-MPC材料應用于預防細菌生物膜的形成具有光明的應用前景。