差異性炮制方法對(duì)丹參藥材中丹酚酸B的變化研究

譚利平 竹林 黃崢崢

摘要 目的：研究差異性炮制方法對(duì)丹參藥材中丹酚酸B的變化。方法：選取和制備炒丹參、丹參炭、米炒丹參、酒丹參、醋丹參，隨后采用高效液相色譜法檢測(cè)各種丹參炮制品中的丹酚酸B的含量。結(jié)果：酒丹參炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹參位列第二，按照醋丹酚酸B含量從高到低的順序依次為生丹參、米炒丹參、炒丹參、丹參炭。結(jié)論：丹酚酸B的熱穩(wěn)定性較差，通過(guò)乙醇以及酸性添加劑可在一定程度上增加丹酚酸B的熱穩(wěn)定性，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。

關(guān)鍵詞 丹參;丹酚酸B;差異性炮制方法;高效液相色譜法;水平變化;熱穩(wěn)定性

Abstract Objective：To study the change of different processing methods on salvianolic acid B in Radix Salviae Miltiorrhizae.Methods：The preparation of fried Radix Salviae Miltiorrhizae，Radix Salviae Miltiorrhizae charcoal，rice fried Radix Salviae Miltiorrhizae，wine Radix Salviae Miltiorrhizae and vinegar Radix Salviae Miltiorrhizae were carried out respectively.Subsequently，high-performance liquid chromatography was used to detect salvianolic acid B in various processed products of Radix Salviae Miltiorrhizae.Results：The content of salvianolic acid B in the processed products of wine Radix Salviae Miltiorrhizae was the highest，and that of vinegar Radix Salviae Miltiorrhizae was the second.According to the order of vinegar salvianolic acid B content from high to low was Radix Salviae Miltiorrhizae，rice fried Radix Salviae Miltiorrhizae，fried Radix Salviae Miltiorrhizae and Radix Salviae Miltiorrhizae charcoal.Conclusion：The thermal stability of salvianolic acid B is poor，and the thermal stability of salvianolic acid B can be increased to some extent through ethanol and acidic additives，which is worthy of clinical attention.

Keywords Radix Salviae Miltiorrhizae; Salvianolic acid B; Different processing methods; High performance liquid chromatography; Horizontal variation; Thermal stability

丹參屬于常見(jiàn)的中草藥之一，屬于唇形科植物丹參的干燥根或根莖，多為春、秋二季采挖，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩以及涼血消癰的功效，主要用于胸痹心痛、脘腹脅痛、熱痹疼痛、月經(jīng)不調(diào)以及癓瘕積聚等的治療中，效果顯著[1-2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，丹參多以治療心血管系統(tǒng)疾病為主，而現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參在抗炎、心肌保護(hù)、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等方面均有一定的藥理作用，其中主要成分囊括丹參酮ⅡA、丹酚酸以及丹參素等[3-4]。有研究報(bào)道顯示，丹酚酸B屬于丹參水溶性成分的重要代表，同時(shí)亦是丹參發(fā)揮藥理學(xué)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量的高低直接影響丹參的藥效。中藥加工是中藥品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，亦是影響臨床用藥的主要因素之一[5]。目前，關(guān)于丹參的炮制方式較多，主要可包括炒丹參、米炒丹參、丹參炭、酒丹參以及醋丹參等[6]。本研究通過(guò)研究對(duì)比炒丹參、米炒丹參、丹參炭、酒丹參以及醋丹參中的丹酚酸B含量差異，旨在明確不同炮制方式對(duì)丹參中丹酚酸B含量的影響，繼而為丹參的炮制方式提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平（德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)：BS124S），高效液相色譜儀（日本島津公司，型號(hào)：Nexera Quaternary），薄層色譜成像儀（瑞士GAMAG公司，型號(hào)：REPROSTAR3），1/10萬(wàn)電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)R200D），GMB-20A系統(tǒng)連接器（上海祥樹(shù)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，型號(hào)：TSS6K），NANOMAT4型定量點(diǎn)樣器（瑞士GAMAG公司，型號(hào)：Linomat-5），手動(dòng)定量進(jìn)樣閥（杭州賽智公司，型號(hào)：7725i），二極管陣列檢測(cè)器（上海玖梧公司，型號(hào)：SPD-M20A），柱溫箱（購(gòu)自日本島津公司，型號(hào)：GTO-10AS），微量進(jìn)樣器（鄭州克萊克特公司，型號(hào)：AS-2902-110通用型），LC solution工作軟件（購(gòu)自日本島津公司，型號(hào)：LC-Solution）。

1.2 試劑 由中國(guó)藥品生物制品鑒定所購(gòu)入丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)11562-200907）。使用試劑中將甲醇作為色譜純，水為超純水，其與均為分析純。本研究所用丹參均購(gòu)自蘇州市天靈中藥飲片廠（批號(hào)：20180203），且符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》中所制定的質(zhì)檢合格相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 分析樣品 1）炒丹參的制備：采用文火炒丹參，直至其呈紫褐色為止，待其出現(xiàn)焦斑后取出放涼即可。2）丹參炭的制備：取丹參以武火炒至內(nèi)外呈焦褐色為宜，隨后取適量的涼水進(jìn)行噴灑，取出丹參放涼即可。3）米炒丹參的制備：首先取適量的水對(duì)炒鍋進(jìn)行潤(rùn)濕處理，隨后將適量的米撒貼在鍋內(nèi)，加熱直至米冒煙時(shí)，將丹參倒入鍋中，持續(xù)翻動(dòng)，直至丹參片從紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙珵橹?，出鍋除去米粒，冷卻后即可，制備過(guò)程中要求100 kg丹參片用米20 kg。4）酒丹參的制備：取丹參予以黃酒進(jìn)行攪拌均勻，悶透，放置于鍋內(nèi)使用文火炒干，取出放涼即可，制備過(guò)程中要求100 kg丹參片用黃酒10 kg。5）醋丹參的制備：取丹參片加入適量的醋進(jìn)行均勻攪拌，悶透。放置于鍋內(nèi)采用文火炒干，取出放涼即可，制備過(guò)程中要求100 kg丹參片用米醋10 kg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相，兩者比例為21∶79，流速為1.0 mL/min，色譜柱為Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以室溫作為柱溫，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為286 nm。

2.2 對(duì)照品溶液制備 采用電子天平精密稱取丹酚酸B對(duì)照品共12.65 mg，將其放置于50 mL的量瓶中，加入甲醇直至刻度為止，晃蕩均勻后獲取253 mg/L的丹酚酸B對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 采用電子天平精密稱取供試藥粉0.500 g，加入25 mL濃度為75%的甲醇溶液，采用封口膜進(jìn)行密封處理，超聲處理30 min后放冷，通過(guò)0.45 μm的微孔濾膜進(jìn)行濾過(guò)處理，即可獲得供試品溶液。根據(jù)上述色譜條件可得到丹酚酸B色譜圖以及丹參樣品色譜圖。見(jiàn)圖1～2。

2.4 專屬性試驗(yàn) 分別取適量的對(duì)照品溶液以及陰性對(duì)照品溶液混合，根據(jù)擬定色譜條件實(shí)施測(cè)定記錄色譜圖，結(jié)果證實(shí)，陰性對(duì)照無(wú)影響。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取丹酚酸B對(duì)照品1，2，4，8，16，32依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積的積分值。將進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，將色譜峰面積作為縱坐標(biāo)，予以回歸分析，可獲得回歸方程為Y=26 512.5+234 480.1X（r=1.000），結(jié)果提示了丹酚酸B于0.251～9.099 μg線性關(guān)系良好。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取丹酚酸B對(duì)照品10 μL，務(wù)必以上述色譜條件為準(zhǔn)連續(xù)進(jìn)樣5次，獲取丹酚酸B的峰面積，計(jì)算RSD為0.64%。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取丹酚酸B對(duì)照品與供試品溶液10 μL，分別在0，2，4，8，16 h依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，RSD分別為0.74%與0.87%。結(jié)果說(shuō)明丹酚酸B對(duì)照品與供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性較佳。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 遵從上述供試品的制備方式，分別制備5份丹參70%乙醇回流提取物供試品溶液，供試品溶液中丹酚酸B的含量平均值為6.255 0%，RSD為2.13%即表示本法的重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取上述5分丹參70%乙醇回流提取物藥粉，每份為0.050 0 g，分別計(jì)入5，5，7.5，7.5以及10 mL，質(zhì)量濃度為10.75 mg/L丹酚酸B對(duì)照品，加入甲醇不足溶液量至25 mL，根據(jù)上述供試品溶液的制備方式制備成供試品溶液，測(cè)量5份樣品的平均加樣回收率。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

分別精密吸取對(duì)照品溶液以及各供試品溶液20 L，依次進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中丹酚酸B的含量。

2.10.1 丹參藥材中丹酚酸B占加樣回收率的測(cè)定結(jié)果

丹參藥材的平均加樣回收率為98.83%，RSD為1.34%。見(jiàn)表1。

2.10.2 丹參不同炮制品中丹酚酸B的含量測(cè)定結(jié)果

酒丹參炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹參位列第2，其次按照醋丹酚酸B含量從高到低的順序依次為生丹參、米炒丹參、炒丹參、丹參炭。見(jiàn)表2。

3 討論

丹參的化學(xué)成分主要涵蓋脂溶性有效成分、水溶性有效成分以及其他成分，而丹酚酸B是丹參最主要的水溶性有效成分，更是被《中華人民共和國(guó)藥典》列為測(cè)定丹參含量的重要指標(biāo)之一[7-8]。相關(guān)研究報(bào)道顯示，丹酚酸B是丹參用于心血管疾病治療中的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分，具有抗氧化、抗血栓形成、調(diào)血脂、細(xì)胞保護(hù)以及抗凝血等藥理作用，同時(shí)可發(fā)揮保護(hù)心血管系統(tǒng)、腎臟、肝臟等系統(tǒng)器官以及抗腫瘤等藥理作用[9-11]。丹參片是臨床上應(yīng)用較為廣泛的丹參炮制品，《中華人民共和國(guó)藥典》中明文規(guī)定其加工過(guò)程如下，首先去除雜質(zhì)以及殘莖，洗凈潤(rùn)透后切厚片，并予以干燥處理。而在飲片炮制過(guò)程中，極易導(dǎo)致根皮中的水溶性有效成分丹酚酸B的損失，繼而可能影響丹參炮制品的藥效，不利于臨床疾病的治療，同時(shí)會(huì)大量浪費(fèi)藥材資源[12-15]。因此，尋找一種有效減少丹參炮制品中丹酚酸B損失的方式顯得尤為重要，亦是目前臨床廣大醫(yī)務(wù)人員共同關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，酒丹參炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹參位列第二，其次按照醋丹酚酸B含量從高到低的順序依次為生丹參、米炒丹參、炒丹參、丹參炭。這與相關(guān)研究報(bào)道相一致[16-18]，說(shuō)明了酒丹參以及醋丹參中的丹酚酸B含量最高，可將其作為丹參炮制品制備的主要方式。分析原因，認(rèn)為丹酚酸B主要是由3個(gè)分子的丹參素以及1個(gè)分子的咖啡酸結(jié)合形成，具有2個(gè)羧基，以不同的鹽形式廣泛存在，其中酯鍵的存在直接影響其于水溶液中的穩(wěn)定性[19-21]。在對(duì)丹參進(jìn)行煎煮以及濃縮的過(guò)程中，可能導(dǎo)致部分丹酚酸水解形成紫草酸以及丹參素，另有少部分丹參素可在酸性的條件下轉(zhuǎn)變成迷迭香酸?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，丹酚酸B對(duì)溫度的敏感性較高，而丹參提取液中的丹酚酸B含量與加熱方式存在密切相關(guān)，其中不同的加熱方式會(huì)對(duì)其造成差異性影響[22-24]。此外，丹酚酸B的含量在一定程度上受pH值、提取溶液劑以及緩沖鹽濃度等因素的影響，其在1

綜上所述，丹參中有效成分丹酚酸B的含量隨著炮制溫度的不斷升高，其減少程度越高，其中酒制丹參以及醋制丹參可有效避免丹酚酸B的損失，其主要機(jī)制可能與乙醇和酸性添加劑有效提高丹酚酸B的熱穩(wěn)定性有關(guān)。

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（2019-04-20收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）