α-突觸核蛋白A53T 突變損傷小鼠認(rèn)知功能

王嫚詩(shī),張 玲,秦 川,叢 斌

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021；2.河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心,石家莊 050017)

突觸核蛋白相關(guān)路易體病是一種常見(jiàn)的中老年人癡呆性疾病,主要包括帕金森病癡呆(PDD)、路易氏體癡呆(DLB)[1-2]。 其病理特征主要為多巴胺能神經(jīng)元缺失以及突觸核蛋白(α-synuclein)的沉積即路易氏小體(Lewy bodies,LBs)的形成[3]。 突觸核蛋白相關(guān)路易體病的主要癥狀表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙以及帕金森病癥狀,包括早期出現(xiàn)進(jìn)展性癡呆,后期伴隨錐體外系癥狀表現(xiàn)[4-5],并且其SNCA 基因中特定的遺傳變異可以影響臨床表型[6],其A53T 突變起病年齡早,生存期短[7]。 但在目前,沒(méi)有針對(duì)DLB 及PDD 確切的治療以及理想的動(dòng)物模型。

此外,研究表明α-synuclein 沉積可以通過(guò)干擾線粒體外膜,影響線粒體融合與裂變,從而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞[8-10],并且其A53T 突變能夠直接抑制線粒體呼吸鏈中復(fù)合物的活性,從而導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激,進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的正常功能[11-12]。 在認(rèn)知功能方面,神經(jīng)突觸內(nèi)的線粒體含量變化、電子傳遞鏈的改變直接影響神經(jīng)元的傳遞[13-14],因此,保護(hù)線粒體形態(tài),維持線粒體穩(wěn)定可作為潛在的治療方向。

突觸核蛋白相關(guān)疾病至今仍無(wú)確切的治療措施,而有效的動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。 因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)該模型進(jìn)行運(yùn)動(dòng),焦慮樣行為以及認(rèn)知方面評(píng)價(jià)；結(jié)合免疫組化觀察小鼠不同腦區(qū)的突觸核蛋白沉積,多巴胺能神經(jīng)元的變化；應(yīng)用電鏡觀察其對(duì)線粒的影響,進(jìn)而評(píng)價(jià)該模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí),雌雄各半,表達(dá)人α-synuclein A53T 突變的轉(zhuǎn)基因模型小鼠和野生型C57BL/6 小鼠各30只,10 月齡,體重20 ～30 g,購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004],飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(京)2018-0019]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)的批準(zhǔn)(ILAS-QC-19004),并根據(jù)3R 原則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及飼養(yǎng)給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

引物購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)生工生物工程股份有限公司；Mouse Direct PCR Kit 購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Biotool 公司；TH(EP1532Y)抗體,α-synuclein (EP1536Y)抗體,P-αsynuclein (ab59264)抗體購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Abcam 公司；HRP 標(biāo)記兔抗購(gòu)買(mǎi)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BSA(牛血清白蛋白)購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)SIGMA 公司；免疫組化試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；尼氏染色試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京索萊寶科技有限公司。 EthoVision XT 動(dòng)物軌跡跟蹤于行為觀察記錄分析系統(tǒng)購(gòu)自荷蘭Noldus 公司；條件恐懼分析系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)MED Associates 公司；轉(zhuǎn)棒分析系統(tǒng)購(gòu)于中國(guó)淮北正華公司；抓力分析系統(tǒng)購(gòu)于法國(guó)BIOSEB 公司；圓筒實(shí)驗(yàn)裝置為自行設(shè)計(jì)；冰凍切片機(jī)購(gòu)于美國(guó)SAKURA Tissue-Tek 公司；電鏡JEM-1400 購(gòu)于日本電子公司；顯微鏡購(gòu)于德國(guó)萊卡公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物鑒定

子代小鼠出生8 ～14 d 內(nèi)剪鼠尾,按照試劑盒說(shuō)明加入組織消化液,配置20 μL 反應(yīng)體系,上下游引 物 為: 5’-GAGGAAGGGTATCAAGACTACGAAC-3’； 5’-GCCGGATCATAATCAGCC ATACCAC-3’,參照文獻(xiàn)設(shè)置循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增基因型鑒定[15]。

1.3.2 認(rèn)知、焦慮樣及運(yùn)動(dòng)行為學(xué)檢測(cè)

曠場(chǎng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可以反應(yīng)小鼠的自主運(yùn)動(dòng)能力、探索能力及焦慮程度。 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱為40 cm×40 cm×40 cm 正方體,未有頂部遮蓋,上方懸掛攝像機(jī)。設(shè)置實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)觀察區(qū),中央?yún)^(qū)及邊緣區(qū),記錄小鼠5 min 內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)間,距離,平均運(yùn)動(dòng)速度,中央?yún)^(qū)及邊緣區(qū)停留時(shí)間。 圓筒實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠在圓筒內(nèi)的自發(fā)活動(dòng),主要包括小鼠在圓桶內(nèi)的站立,理毛和前肢活動(dòng)情況。 圓筒為一直徑7.5 cm 的圓柱型透明有機(jī)玻璃,未有頂部遮蓋,在圓筒前后方分別放有攝像機(jī)和鏡子,用于全方位觀測(cè)和量化小鼠自發(fā)活動(dòng)情況。 實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入圓筒內(nèi),記錄3 min內(nèi)小鼠的站立次數(shù)和理毛時(shí)間。 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。 轉(zhuǎn)棒儀主要由轉(zhuǎn)軸和獨(dú)立隔間組成,實(shí)驗(yàn)分3 d 進(jìn)行,前2 d 為訓(xùn)練期,轉(zhuǎn)速為10 r/min,每天訓(xùn)練3 次,每次持續(xù)5 min；第3 d為測(cè)試期,從初始逐漸加速至40 r/min 共計(jì)5 min,每只小鼠檢測(cè)3 次,每次間隔20 min,取3 次均值記為在棒時(shí)間,實(shí)驗(yàn)期間小鼠掉落系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄。

抓力實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠的前肢肌張力,主要由抓力網(wǎng)格以及計(jì)算機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)組成。 實(shí)驗(yàn)時(shí)提起小鼠尾部,讓小鼠前肢抓取網(wǎng)格,由上至下輕拉小鼠尾部拖動(dòng)小鼠,記錄拉力最大值,每只小鼠測(cè)試三次,取平均值。

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為。 設(shè)置水池內(nèi)四個(gè)象限及隱藏平臺(tái)。 操作者每次從不同象限放入小鼠,共訓(xùn)練7 d,第8 天撤掉平臺(tái),進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試,記錄小鼠穿越平臺(tái)所在象限時(shí)間及次數(shù)。

條件恐懼實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)小鼠對(duì)恐懼場(chǎng)景的記憶,包括場(chǎng)景性條件恐懼及線索性條件恐懼,通過(guò)記錄小鼠僵直時(shí)間反應(yīng)小鼠的恐懼程度。 實(shí)驗(yàn)分4 d 進(jìn)行,第1 天為適應(yīng)期,第2 天給予電擊及聲音刺激,第3 天無(wú)任何刺激,第4 天更換場(chǎng)景僅給予聲音刺激。 第1 天設(shè)置光照強(qiáng)度為130 lx,將小鼠放入條件恐懼箱內(nèi)適應(yīng)10 min；第2 天設(shè)置光照強(qiáng)度為130 lx,電擊強(qiáng)度0.5 mA,聲音強(qiáng)度為80 db,刺激頻率為5000 hz。 將小鼠放入條件恐懼箱內(nèi),3 min 后給予單一頻率聲音刺激(30 s),于聲音刺激的最后2 s 給予電擊刺激,每段間隔1 min,10 min 內(nèi)給予5次聲音及電擊刺激,記錄小鼠在恐懼箱10 min 內(nèi)的僵直時(shí)間；第3 天設(shè)置光照強(qiáng)度為130 lx,無(wú)任何條件刺激,記錄小鼠5 min 內(nèi)的僵直時(shí)間。 第4 天更換場(chǎng)景,放置黑板遮光,并在其側(cè)壁涂有帶有氣味的果汁。 光照強(qiáng)度、聲音刺激及檢測(cè)時(shí)間同第2 天,記錄小鼠在恐懼箱內(nèi)僵直時(shí)間。

1.3.3 免疫組化觀察突觸核蛋白/路易小體沉積,TH 細(xì)胞變化

1)TH 染色及α-synuclein 染色

PBS 洗腦片后置于3%過(guò)氧化氫封閉液室溫孵育10 min,再次用PBS 沖洗3 次,每次10 min,置于BSA 孵育30 min,一抗(TH 抗體1 ∶5000 稀釋?zhuān)沪羢ynuclein 抗體1 ∶1000 稀釋)孵育過(guò)夜。 PBS 洗腦片后,二抗(兔抗1 ∶1000；鼠抗1 ∶1000)室溫孵育30 min,PBS 洗腦片4 次,每次5 min,DAB 顯色30 s。 取相同層面紋狀體,黑質(zhì),海馬貼片,烤片1 h,置于氯仿及酒精混合溶液(1 ∶1)過(guò)夜。

2)尼氏染色及計(jì)數(shù)

將玻片置于100%乙醇、95%乙醇梯度脫水各30 s,自來(lái)沖洗后甲酚紫染色,再用95%乙醇、100%乙醇梯度脫水各10 s,置于二甲苯30 s 后中性樹(shù)膠封片。將染色后的黑質(zhì)及紋狀體置于顯微鏡下觀察并畫(huà)出黑質(zhì)區(qū)域,用image J 軟件計(jì)數(shù)TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 電鏡觀察線粒體形態(tài)變化

生理鹽水及多聚甲醛灌注后,取紋狀體經(jīng)2.5%的戊二醛固定過(guò)夜后用1%鋨酸4℃固定2 h,蒸餾水沖洗后梯度乙醇脫水,環(huán)氧丙烷處理,樹(shù)脂浸透,包埋,制備超薄切片,染色后置于電鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6 軟件處理數(shù)據(jù)、作圖,結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物的鑒定

部分α-synuclein A53T 小鼠基因鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1,攜帶α-synuclein A53T 基因的陽(yáng)性鼠可見(jiàn)清晰PCR 擴(kuò)增條帶,與目的片段大小相符,陰性鼠無(wú)條帶(圖1)。

2.2 α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知行為學(xué)改變

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)距離增加,但在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A～2C)；在圓筒實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、抓力實(shí)驗(yàn)(圖2D ～2E、圖3)及水迷宮實(shí)驗(yàn)(圖4A ～4C)中,α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠與Control 組小鼠相比均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在條件恐懼實(shí)驗(yàn)中,α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠在第場(chǎng)景依賴條件恐懼(海馬依賴,0～330 s)與線索依賴條件恐懼(杏仁核依賴,180 ～570 s)中表現(xiàn)為僵直時(shí)間縮短(圖4D～4E),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 免疫組化觀察α-synuclein 沉積增多，TH 細(xì)胞減少

應(yīng)用免疫組化染色評(píng)價(jià)α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠α-synuclein,TH 變化。 P-α-synuclein 顯示α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體、黑質(zhì)、梨狀皮層及海馬P-α-synuclein 沉積增多(圖5A)；Pα-synuclein 染色觀察小鼠前額葉路易氏小體的沉積,LB 的典型外觀是一個(gè)或多個(gè)嗜酸性球體,中間為致密核心,周邊為暈圈[16]如箭頭所示(圖5 B),紋狀體、黑質(zhì)α-synuclein 增多(圖6)；TH 染色顯示A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)TH 陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元減少(圖7),結(jié)果表明A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠具有不同腦區(qū)α-synuclein 沉積及TH 細(xì)胞減少的病理特征。

2.4 電鏡觀察小鼠腦線粒體形態(tài)變化

文獻(xiàn)表明α-synuclein 可以直接影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性,從而導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激損傷。 電鏡結(jié)果顯示α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體內(nèi)容物,線粒體嵴結(jié)構(gòu)不清；線粒體形態(tài)改變,裂變?cè)龆?提示α-synuclein 的沉積可以影響線粒體的結(jié)構(gòu)及形態(tài)(見(jiàn)圖8)。

3 討論

α-synuclein A53T 相 關(guān) 小 鼠 模 型 具 有 αsynuclein 的聚集以及TH 細(xì)胞的減少,常被用做PD模型。 研究表明,不同外源啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的αsynuclein A53T 小鼠模型的表型有所差別,朊病毒啟動(dòng)子主要在神經(jīng)元表達(dá)[12]；Teto 啟動(dòng)子主要在四環(huán)素誘導(dǎo)下表達(dá)[17]；thy1 啟動(dòng)子主要在皮層以及皮層下神經(jīng)元表達(dá)[18]。 此外,AAV1/2-A53T-α-synuclein誘導(dǎo)的小鼠模型,可在SN 中引起α-synuclein 的廣泛過(guò)表達(dá),從而導(dǎo)致多巴胺能纖維丟失和紋狀體中多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的減少,早期可伴有運(yùn)動(dòng)障礙[19]。

本實(shí)驗(yàn)采用的小鼠為血小板源生長(zhǎng)因子啟動(dòng)子(PDGF-h-α-Synuclein) A53T 突變小鼠,PDGF-β啟動(dòng)子可以在新皮層、嗅球、膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元中廣泛表達(dá),并且據(jù)報(bào)道該小鼠具有α-synuclein 的沉積以及進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙[20]。

圖1 部分α-synuclein A53T 小鼠PCR 鑒定凝膠電泳圖Figure 1 PCR identification of α-synuclein A53T mice by gel electrophoresis

圖2 α-synuclein A53T 小鼠焦慮樣行為學(xué)表現(xiàn)Note. A, The experimental area of the open field test. B ～C, Comparison of distance moved and cumulative duration spent in zone C. D ～E,Comparison of grooming and rearing time in the Cylinder test.Compared with the control group,*P ＜0.05.Figure 2 Anxiety behavior in α-synuclein A53T mice

在α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,12 月齡A53T 小鼠可以出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)學(xué)障礙表現(xiàn)[21],此外,朊病毒啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的α-synuclein A53T小鼠在6 月齡出現(xiàn)空間記憶障礙,以及減少的焦慮樣行為,并且空間記憶缺陷隨著月齡增長(zhǎng)而發(fā)展[12]。 但對(duì) 于PDGF-β 啟 動(dòng) 子 調(diào) 控 表 達(dá) 的αsynuclein A53T 小鼠并未有系統(tǒng)的認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)及焦慮樣行為學(xué)評(píng)價(jià)。

圖3 α-synuclein A537 小鼠運(yùn)動(dòng)行為學(xué)表現(xiàn)Note. A, Comparison of duration in the rotating rod test. B,Comparison of maximum strength.Figure 3 Motor behavior in α-synuclein A53T mice

在本實(shí)驗(yàn)中,PDGF-β 啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的αsynuclein A53T 小鼠運(yùn)動(dòng)距離增加,呈現(xiàn)過(guò)度活躍狀態(tài),同之前的研究相符[22]；而焦慮樣及運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)未顯示明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明10 月齡時(shí)α-synuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠并未有焦慮癥狀以及明顯運(yùn)動(dòng)學(xué)癥狀改變,在認(rèn)知行為學(xué)評(píng)價(jià)中,海馬及杏仁核依賴的條件孔恐懼記憶時(shí)間縮短,表明10 月齡αsynuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)認(rèn)知記憶障礙,但是對(duì)于水迷宮實(shí)驗(yàn)中空間學(xué)習(xí)記憶能力并未有明顯改變,因此在PDGF-β 啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的10 月齡αsynuclein A53T 小鼠模型中,行為學(xué)檢測(cè)表現(xiàn)為條件恐懼認(rèn)知功能障礙,并且其發(fā)生早于運(yùn)動(dòng)功能障礙,以及未見(jiàn)明顯的焦慮樣行為改變。 免疫組化實(shí)驗(yàn)中,在黑質(zhì)、紋狀體、梨狀皮層、海馬觀察到P-αsynuclein 沉積,前額葉皮層中觀察到LBs,并且研究表明,在突觸核蛋白相關(guān)路易氏體疾病中,大部分α-synuclein 沉積在129 位絲氨酸是磷酸化的,而在正常人中僅有少部分是磷酸化的[23]。 此外,在αsynuclein 染色中黑質(zhì)紋狀體α-synuclein 有明顯改變,TH 染色觀察黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元減少,符合突觸核蛋白相關(guān)路易氏體疾病中類(lèi)似PD 的病理表現(xiàn),并且電鏡觀察顯示,與對(duì)照組相比,10 月齡αsynuclein A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠線粒體內(nèi)容物不清,形態(tài)發(fā)生改變,裂變?cè)龆郲24],以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合突觸核蛋白相關(guān)疾病(路易氏體癡呆/帕金森病癡呆)報(bào)道[1-2]。

綜上所述,在本實(shí)驗(yàn)研究中,10 月齡PDGF-β啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的α-synuclein A53T 小鼠在行為學(xué)表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙先于運(yùn)動(dòng)功能障礙,在病理學(xué)表現(xiàn)為磷酸化突觸核蛋白的沉積以及多巴胺能神經(jīng)元減少,線粒體裂變?cè)龆?進(jìn)而提出該小鼠可作為一種突觸核蛋白相關(guān)認(rèn)知障礙性疾病如(路易氏體癡呆/帕金森病癡呆)相關(guān)的動(dòng)物模型,為αsynuclein 引起的認(rèn)知障礙性疾病的機(jī)制研究與藥物開(kāi)發(fā)提供支撐。

圖4 α-synuclein 小鼠認(rèn)知行為學(xué)表現(xiàn)Note. A,Latency to find the hidden platform during 7 consecutive days of training. B-C,Time and frequency of crossing of the quadrant containing the platform. D-E, Freezing time in the context memory test and cued memory test.Compared with the control group, *P ＜0.05,**P ＜0.01.Figure 4 Cognitive behavior in α-synuclein A53T mice

圖5 不同腦區(qū)P-α-synuclein 沉積Note. A, P-α-synuclein accumulation in the substantia nigra (SN), striatum (STR), piriform cortex (PIR), and hippocampus (HIP) of αsynuclein A53T mice. B, Lewy-body (LBs) deposition in the prefrontal cortex.Figure 5 P-α-synuclein deposition in different brain regions in α-synuclein A53T mice

圖6 黑質(zhì)、紋狀體中α-synuclein 沉積Figure 6 α-synuclein deposition in the SN and STR of α-synuclein A53T mice

圖7 小鼠腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化Note. A, Immunohistochemical staining showed TH expression in the SN. B, Quantification of TH-positive cells in the SN.Figure 7 TH expression in the SN of α-synuclein A53T mice

圖8 電鏡下小鼠腦線粒體變化Figure 8 Mitochondrial morphology in the amygdala of α-synuclein A53T mice