HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿細(xì)胞因子與疾病指征的相關(guān)性分析

田 龍,童 玲,叢 喆,陳 霆,薛 婧,魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

通過(guò)HAART 治療臨床上已經(jīng)達(dá)到對(duì)HIV-1 感染的有效控制,但同時(shí)臨床也發(fā)現(xiàn)在血漿病毒載量得到有效控制的同時(shí)艾滋病感染者體內(nèi)多種細(xì)胞因子的濃度仍然處于高水平狀態(tài)。 這些升高的細(xì)胞因子不僅會(huì)影響疾病的進(jìn)展和治療效果,還能導(dǎo)致非HIV 定義性疾病(Non-AIDS-defining diseases,NAD),如心腦血管疾病、慢性肝腎與骨骼疾病以及非艾滋病定義性腫瘤[1-5]。 此外,在進(jìn)行HAART 治療中依然存在不少血漿病毒載量控制效果不佳的案例[6],并且在治療失敗的案例中也觀察到了細(xì)胞因子濃度異常的現(xiàn)象。 針對(duì)以上問(wèn)題,本研究對(duì)HAART 治療的SIVmac239 感染恒河猴血漿細(xì)胞因子在感染、治療和停藥狀態(tài)下的濃度及其與疾病指征的相關(guān)性進(jìn)行了研究,以期為臨床改進(jìn)治療方案降低艾滋病免疫激活的不利影響提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 只SPF 級(jí),3 ～4 歲,4 ～5 kg,雄性中國(guó)恒河猴購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所[SCXK(京)2015-0011],實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及操作在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成[SYXK(京)2017-0027]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào)為(XJ19005)。 遵循3R 原則對(duì)動(dòng)物進(jìn)行關(guān)懷。 實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)猴未受到猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D 型病毒(SRV-1)、猴T 淋巴細(xì)胞性I 型病毒(STLV-1)和猴B 病毒(BV)等可能對(duì)實(shí)驗(yàn)造成顯著影響的病原體的感染。

1.2 主要試劑

流式抗體PerCP Mouse Anti-Human CD3 (貨號(hào):552851),PE Mouse Anti-Human CD8 (貨號(hào):555367) 購(gòu) 自 BD 公 司； FITC anti-human CD4 Antibody (貨號(hào):317408) 購(gòu)自Biolegend 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit (貨號(hào): 52906) 購(gòu)自QIAGEN 公司；TaqManTMRNA-to- CTTM1-Step Kit(貨號(hào):4392938) 購(gòu)自Thermo Fisher 公司；多因子檢測(cè)試劑盒Custom Premix Non-Hu Primate Cyto MAG09 (貨號(hào):PRCYTOMAG- 40 K-09C)、TGF-β1檢測(cè)試劑盒MILLIPLEX MAP TGF?1 Magnetic Bead Single Plex Kit (貨號(hào):TGFBMAG-64 K-01)購(gòu)自Merck 公司；IP-10 Monkey ProcartaPlexTMSimplex Kit(貨號(hào):EPX01 A-40284-901)、IFN-alpha Monkey ProcartaPlexTMSimplex Kit (貨號(hào):EPX01 A-40216-901)、ProcartaPlex NHP Basic Kit (貨號(hào):EPX010-40420-901) 購(gòu)自Thermo Fisher 公司。 富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(TDF)購(gòu)自倍特藥業(yè)；拉米夫定片(3TC)購(gòu)自上海迪泰諾藥業(yè)有限公司；克力芝(Lpv/r)購(gòu)自艾伯維公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HAART 藥物配制及動(dòng)物給藥方案

將拉米夫定片(3TC)、富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(TDF)、克立芝藥片(Lpv/r)研磨成粉末。 按3TC 50 mg/kg,Lpv/r 15 mg/kg,TDF 20 mg/kg 的濃度取粉末分別溶于0.5 mL 的超純水中。 配置好的藥液分別與0.5 mL 30%的(2-羥丙基)-β-環(huán)糊精溶液混合,反復(fù)顛倒混勻至完全溶解。HAART 期間3TC 和TDF 每日肌肉注射給藥一次,Lpv/r 每日肌肉注射給藥兩次,連續(xù)給藥147 d 后停藥觀察。

1.3.2 樣本采集

分別于感染前、HAART 治療前及治療過(guò)程中的第35 天以及停藥后的第49 天采集EDTA 抗凝血。50 μL 全血用于流式檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群。 血漿用于檢測(cè)血漿病毒載量和細(xì)胞因子。

1.3.3 血漿病毒載量測(cè)定

取140 μL EDTA 抗凝血漿,使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取血漿病毒RNA,利用Real-time RT-PCR 方法檢測(cè)血漿病毒載量[7]。

1.3.4 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

取50 μL 混勻的EDTA 抗凝血依次加入PerCPCD3、FITC-CD4、PE-CD8 抗體；孵育、裂紅、洗滌過(guò)濾后。 使用Truecount 管上機(jī)檢測(cè)CD4+T 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)及CD4+/CD8+比值[8]。

1.3.5 血漿細(xì)胞因子測(cè)定

多因子檢測(cè)試劑盒在使用前室溫平衡,按照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試劑,凍存的血漿樣本解凍后渦旋混勻。 準(zhǔn)備完成后每孔加入200 μL Assay Buffer 室溫震蕩10 min,棄去Assay Buffer；標(biāo)準(zhǔn)孔加入25 μL標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)照孔每孔加入25 μL 對(duì)照品,背景孔和樣品孔加入25 μL Assay Buffer；背景孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和對(duì)照孔每孔加入25 μL matrix solution,樣品孔加入25 μL樣本后再加入25 μL Mixed Beads；貼上封口膜錫箔紙包被后置于搖床上室溫孵育2 h,洗滌兩次；每孔加入25 μL 檢測(cè)抗體置于搖床上室溫孵育1 h；加入25 μL PE 標(biāo)記的鏈霉親和素,置于搖床上室溫孵育30 min,洗滌2 次；每孔加入100 μL Sheath Fluid 搖床震蕩5 min,用Bio-Plex200 Luminex 儀器檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用BD Accuri C6 Software 對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, Prism Graph Pad 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。細(xì)胞因子與疾病指征數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿病毒載量檢測(cè)結(jié)果

HAART 治療前,SIVmac239 感染猴處于慢性感染階段,血漿病毒載量在105～106copies/mL 水平。HAART 治療中的第35 天,血漿病毒載量就全部轉(zhuǎn)陰。 停藥后血漿病毒載量依次反彈,第49 天達(dá)到105copies/mL 左右的水平(見(jiàn)圖1)。

2.2 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴外周血CD4+T 計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+結(jié)果

圖1 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿病毒載量結(jié)果Figure 1 Plasma viral load measurements in rhesus monkeys during HAART treatment

HAART 治療前實(shí)驗(yàn)猴外周血CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)為每微升(699±360)個(gè),HAART 治療中CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)升高,在治療第35 天增加到每微升(1877±767)個(gè),HAART 治療停止以后,CD4+T 細(xì)胞數(shù)又逐漸減少,到停藥后49 d,減少到每微升(651 ±305)個(gè)。

外周血CD4+/CD8+比值在HAART 治療中有小幅度升高,停藥后的一段時(shí)間基本維持不變。 治療前實(shí)驗(yàn)猴外周血CD4+/CD8+比為(1.29±0.52),HAART 治療期間外周血CD4+/CD8+細(xì)胞比值為(1.47±0.58),停藥以后在CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)下降的情況下實(shí)驗(yàn)猴CD4+/CD8+比值基本保持穩(wěn)定為(1.53±0.57)(見(jiàn)圖2)。

2.3 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴外周血細(xì)胞因子濃度的變化

感染后血漿中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的濃度較未感染前有所升高,HAART 治療中持續(xù)升高；治療的第35 天達(dá)分別達(dá)到感染前的3.51、4.58和2.57 倍。 停藥后IL-1β、IL-6 濃度比治療過(guò)程中稍有降低,但仍高于治療前,TNF-α 則繼續(xù)升高。 在停藥的第49 天三種促炎因子的濃度分別是感染前的2.07、2.26 和4.44 倍(見(jiàn)圖3A)。

血漿中抑炎因子IL-10 和TGF-β1 在感染治療過(guò)程中與促炎因子有相似的變化。 感染后濃度顯著升高,HAART 治療過(guò)程中繼續(xù)升高。 治療的第35 天分別達(dá)到感染前的4.23 和4.74 倍,停藥以后IL-10 和TGF-β1 的血漿濃度緩慢下降但仍高于治療前的水平,在停藥的第49 天仍分別達(dá)到感染前的3.57 和3.31 倍(見(jiàn)圖3B)。

圖2 SIVmac239 感染恒河猴HAART 治療前后外周血CD4+T 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)及CD4+/CD8+比值變化Note. A, Peripheral CD4+ T cell count changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment. B, Peripheral CD4+/CD8+ ratio changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment.Figure 2 Peripheral CD4+T cell count and CD4+/CD8+ ratio changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment

趨化因子的變化趨勢(shì)更加多樣化。 IP-10 在感染后濃度量有所增加,經(jīng)HAART 治療恢復(fù)到正常水平,停藥以后又有小幅度的反彈。 趨化因子MCP-1 在感染和治療中持續(xù)升高在HAART 后的第35 天達(dá)到感染前的2.79 倍,停藥以后小幅度下降。MIP-1β 是唯一在疾病過(guò)程中保持持續(xù)升高的趨化因子在停藥后第49 天達(dá)到感染前的3.22 倍,但在HAART 治療期間可以觀察到升高的趨勢(shì)放緩(見(jiàn)圖3C)。

抗病毒因子IFN-γ 和IFN-α 與促炎因子TNF-α有相似的變化趨勢(shì),在感染和治療階段及停藥后持續(xù)升高,但I(xiàn)FN-α 濃度升高的幅度更大。 抗病毒因子IFN-γ 在HAART 治療的第35 天達(dá)到感染前的1.81 倍,在停藥的第49 天濃度為感染前的3.21倍。 IFN-α 在HAART 治療的第35 天濃度為感染前的2.36 倍,在停藥的第49 天達(dá)到感染前的3.38 倍(見(jiàn)圖3D)。

圖3 SIVmac239 感染恒河猴HAART 治療前后外周血中細(xì)胞因子濃度的變化Note. A, Changes in plasma proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α during HAART treatment and drug withdrawal. B, Changes in plasma anti-inflammatory factors IL-10 and TGF-β1 during HAART treatment and withdrawal. C, Changes in plasma chemokines IP-10, MCP-1,and MIP-1β during HAART treatment and withdrawal. D, Changes in plasma pro-apoptotic growth factor IL-2 during HAART treatment and withdrawal Change. E, Changes in plasma antiviral factors IFN-γ and IFN-α during HAART treatment and withdrawal.Figure 3 Changes in expression levels of cytokines in peripheral blood from rhesus monkeys infectedwith SIVmac239 during HAART treatment

促淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-2 從感染開(kāi)始到HAART 治療階段持續(xù)升高。 在治療的第35 天達(dá)到感染前的5.61 倍,停藥以后濃度稍有下降,停藥后49 天時(shí)仍為感染前的2.79 倍。

2.4 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿細(xì)胞因子與疾病指征的相關(guān)性結(jié)果

促炎因子中IL-6 的血漿濃度與血漿病毒載量的相關(guān)性最好(r=-0.69, P=0.020),IL-1 β 與血漿病毒載量的相關(guān)性次之(r=-0.61, P=0.042),TNF-α 與血漿病毒載量沒(méi)有相關(guān)性(r=-0.16, P=0.346)；幾種促炎因子與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+比均沒(méi)有相關(guān)性。 抑炎因子TGF-β1 的濃度與血漿病毒載量存在強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性(r=-0.69, P=0.019),IL-10 與血漿病毒載量沒(méi)有顯著的相關(guān)性；兩種抑炎因子與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+均沒(méi)有顯著的相關(guān)性。 趨化因子中僅IP-10 與血漿病毒載量存在強(qiáng)的正相關(guān)性(r=0.61, P=0.041),MCP-1 和MIP-1β 與病毒載量均沒(méi)有顯著相關(guān)性；三種趨化因子與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)均沒(méi)有顯著的相關(guān)性,僅MIP-1β 與CD4+/CD8+比值存在強(qiáng)相關(guān)性(r=0.63, P=0.003)。 促淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-2,抗病毒因子IFN-γ 和IFN-α 與疾病指征沒(méi)有顯著的相關(guān)性(見(jiàn)表1)。

3 討論

近年來(lái),不斷優(yōu)化的HAART 治療方案雖然已經(jīng)能在很大范圍內(nèi)控制HIV-1 感染者的血漿病毒水平,但多種細(xì)胞因子持續(xù)高濃度狀態(tài)被認(rèn)為是導(dǎo)致多種非HIV 定義性疾病及影響艾滋病的進(jìn)展和治療效果的重要因素。 很多研究也認(rèn)為,促炎因子、抑炎因子、趨化因子、抗病毒因子等都對(duì)艾滋病的疾病進(jìn)展有一定影響。

本研究發(fā)現(xiàn),恒河猴血漿細(xì)胞因子的濃度在SIVmac239 感染后均有所升高,但在HAART 治療期間,包括促炎因子IL-1 β、IL-6、抑炎因子IL-10、TGF-β1 和促淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-2 在內(nèi)的大部分血漿細(xì)胞因子的濃度沒(méi)有伴隨著病毒水平的下降而降低,而是呈現(xiàn)出持續(xù)增高的態(tài)勢(shì)。 反而在停止HAART 治療后,逐漸下降,但下降的幅度不大,濃度基本維持在HAART 治療前的水平,仍明顯高于感染前。 促炎因子TNF-α、抗病毒因子IFN-α 和IFN-γ在感染后一直呈現(xiàn)持續(xù)增高的走勢(shì)。 趨化因子IP-10 在HAART 過(guò)程中下降,停藥后稍有反彈,MCP-1及MIP-1 β 自感染后基本維持不變。

表1 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿細(xì)胞因子與疾病指征的相關(guān)性Table 1 Correlations between plasma cytokines and disease indicators in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment

另外,本研究還發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1 β 和IL-6、抑炎因子TGF-β1、趨化因子IP-10 的血漿濃度與血漿病毒載量存在一定的相關(guān)性。 Worley M 等人最近發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞可以通過(guò)介導(dǎo)HIV 特異性抗體依賴的ADCC 作用和抗體依賴的中性粒細(xì)胞吞噬作用清除血漿病毒顆粒[9]； IL-1 β 可以促進(jìn)骨髓中性粒細(xì)胞釋放入血,IL-6 可以通過(guò)STAT3 途徑激活中性粒細(xì)胞促進(jìn)其遷移能力[10]。 推測(cè)促炎因子IL-1 β和IL-6 可能通過(guò)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞功能的途徑,間接產(chǎn)生清除血漿中病毒顆粒的作用。 TGF-β1 主要由活化的CD8+T 細(xì)胞產(chǎn)生,其主要功能是抑制炎癥和組織修復(fù)[11]；因此,TGF-β1 與血漿病毒載量的相關(guān)性可能與TGF-β1 本身的功能無(wú)關(guān),而是由病毒感染后抗病毒作用的CD8+T 細(xì)胞活化增加分泌TGFβ1 的能力增強(qiáng)引起的。 IP-10 可以直接刺激HIV在外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制[12]。對(duì)于清除血漿病毒載量來(lái)說(shuō)IL-1 β、IL-6、IP-10 這幾種細(xì)胞因子可能更具有研究的價(jià)值。 趨化因子MIP-1β 的血漿濃度與CD4+/CD8+比值相關(guān),這個(gè)因子可能對(duì)于方便快速的檢測(cè)外周血T 淋巴細(xì)胞亞群紊亂有一定意義。

綜上所述,HAART 治療前SIVmac239 感染的恒河猴血漿細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)與臨床病人基本一致。 HAART 治療中有部分細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)與臨床一致,其中IL-6、TGF-β1、IP-10 的濃度無(wú)論變化趨勢(shì)還是與疾病指征的相關(guān)性都與臨床相符合[13-15]。 這為臨床進(jìn)行艾滋病免疫激活造成的免疫重建失敗及其他并發(fā)癥研究提供了動(dòng)物模型支持。