基于TCGA數(shù)據(jù)庫探討NKAIN1表達(dá)增高與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系*

王翠翠，孔繁菲,馬劍,張運(yùn)征,馬曉欣

110000 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 婦產(chǎn)科

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居于婦科惡性腫瘤首位[1]。隨著肥胖、糖尿病、高血壓等人群逐年增多，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率及死亡率近年來逐漸上升并呈現(xiàn)年輕化趨勢。經(jīng)過規(guī)范化治療的子宮內(nèi)膜腺癌，患者的5年生存率能達(dá)到80%[2-3]。70%的子宮內(nèi)膜癌患者為I期，預(yù)后好，而III期尤其是IV期的患者預(yù)后較差[4]。雖然CA125水平對嚴(yán)重的子宮內(nèi)膜癌有參考價值，但是目前仍沒有有效的生物標(biāo)記物能預(yù)測不良預(yù)后并指導(dǎo)治療。因此從基因水平研究子宮內(nèi)膜癌的病理機(jī)制，對尋求治療靶點并改善預(yù)后至關(guān)重要。NKAIN1是一種可以與Na,K-ATP酶β亞基相互作用的新型跨膜蛋白[5]。有研究嘗試?yán)没蛐酒磉_(dá)譜數(shù)據(jù)分析及定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測NKAIN1是否可以作為前列腺癌早期診斷的候選基因[6]。然而目前NKAIN1在子宮內(nèi)膜癌中的研究鮮有報道，因此，本文的研究目的是基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析NKAIN1評價子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的價值，并通過基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)進(jìn)一步了解那些既參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展又和NKAIN1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的生物學(xué)通路。

1 材料和方法

1.1 材料

子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(共575例，工作流程類型：HTSeq-FPKM)和相應(yīng)的臨床樣本數(shù)據(jù)(共548例)均從TCGA官網(wǎng)上下載(https：//cancergenome.nih.gov/)。用散點圖表現(xiàn)NKAIN1在23例正常內(nèi)膜組織及552例子宮內(nèi)膜癌組織之間的表達(dá)差異。用箱線圖對比目標(biāo)基因在不同臨床參數(shù)間的表達(dá)。最后聯(lián)合基因測序表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床樣本數(shù)據(jù)做更進(jìn)一步的分析。

1.2 方法

GSEA是一種電腦計算方法，用于確定一組預(yù)先定義的基因在兩種生物狀態(tài)之間是否存在統(tǒng)計上顯著的、一致的差異[7]。在本研究中，GSEA首先根據(jù)所有基因與NKAIN1表達(dá)的相關(guān)性生成了一個有序的基因列表，并通過GSEA來闡明NKAIN1高、低表達(dá)組之間存在顯著的生存差異。每個分析進(jìn)行1 000次基因組排列。以NKAIN1的表達(dá)水平作為表型標(biāo)簽。利用歸一化富集評分(normalized enrichment score,NES)對各表型中富集的途徑進(jìn)行排序。

1.3 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均采用R 語言(3.6.1)。Wilcox(或Kruskal)檢驗和Logistic回歸分析NKAIN1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。Cox回歸和Kaplan-Meier法分析TCGA患者的臨床病理特征與總生存期的關(guān)系。Cox多因素分析比較NKAIN1表達(dá)與其它臨床特征(如分期、分級、腫瘤狀態(tài)、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、手術(shù)方式、是否有殘留病灶及腹水細(xì)胞學(xué)等)對生存的影響。NKAIN1表達(dá)的截斷值由其中位數(shù)決定。

2 結(jié) 果

2.1 患者特征

于2019年10月從TCGA官網(wǎng)下載同時具有臨床及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的原發(fā)子宮內(nèi)膜癌樣本共548例。其中I期的子宮內(nèi)膜癌患者342例(62.4%)，II期52例(9.5%)，III期124例(22.6%)，IV期30例(5.5%)。其中18.5%的組織樣本是高分化(G1)，22.6%是中分化(G2)，58.9%是低分化(G3)。有426例為無瘤狀態(tài)(84.5%)和78例帶瘤狀態(tài)(15.5%)。根據(jù)組織學(xué)類型，可將樣本分為子宮內(nèi)膜樣腺癌(endometrioid endometrial adenocarcinoma,EEA)、漿液性腺癌(serous endometrial adenocarcinoma,SEA)以及漿液性與子宮內(nèi)膜樣混合型腺癌(mixed serous and endometrioid,MSE)，其中EEA有405例(74.9%)，MSE有22例(4.1%)，SEA有114例(21.1%)。另外，86.6%的樣本存在盆腔或腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。38.7%的患者行微創(chuàng)手術(shù)，14%的患者的腹腔沖洗液中找到瘤細(xì)胞以及90.7%的患者術(shù)后未見殘留病灶(表1)。

表1 TCGA子宮內(nèi)膜癌患者的臨床特征

Table 1. Characteristics of Endometrial Carcinoma Patients Based on Data from TCGA

aEEA: Endometrioid endometrial adenocarcinoma; MSE: Mixed serous and endometrioid; SEA: Serous endometrial adenocarcinoma.

2.2 NKAIN1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫中共有575個子宮內(nèi)膜相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，其中正常內(nèi)膜組織樣本23個，子宮內(nèi)膜癌組織樣本552個，子宮內(nèi)膜癌組織樣本中NAKIN1的表達(dá)水平明顯高于正常內(nèi)膜組織樣本(P<0.001)(圖1)。

圖1NKAIN1基因表達(dá)情況

Figure 1. The Expression ofNKAIN1in Normal Tissue and Endometrial Cancer

在552個子宮內(nèi)膜癌組織樣本中，有548個樣本同時具有轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及患者臨床資料數(shù)據(jù)。NKAIN1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌分期，分級，腫瘤攜帶狀態(tài)，腹水細(xì)胞學(xué)及腫瘤組織類型有關(guān)，對于期別高、分化低、腹水中可找到瘤細(xì)胞及組織類型屬于SEA的患者，NKAIN1表達(dá)水平明顯增高(P<0.001)(圖2A-E)。

邏輯回歸單因素分析發(fā)現(xiàn)NKAIN1表達(dá)量與不良預(yù)后相關(guān)的臨床病理參數(shù)有關(guān)(表2)。以548份樣本NKAIN1表達(dá)量的中位數(shù)進(jìn)行劃分，NKAIN1高表達(dá)組與腫瘤高級別(OR=2.41，G2/G3vsG1)、晚期(OR=2.04，III/IVvsI/II)、攜瘤狀態(tài)(OR=2.11)、腹水找到瘤細(xì)胞(OR=3.29)及較差的組織學(xué)類型(OR=3.49，MSE/SEAvsEEA)有關(guān)(P值均小于0.05)。這些結(jié)果提示NKAIN1高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者相比NKAIN1低表達(dá)的患者預(yù)后更差。

2.3 生存結(jié)局和多因素分析

Kaplan-Meier生存分析表明NKAIN1高表達(dá)組總生存時間低于NKAIN1低表達(dá)組(P<0.001)(圖2F)。單因素分析表明NKAIN1高表達(dá)與不良生存預(yù)后相關(guān)(HR：1.04；CI：1～1.08；P=0.016)。其他與生存預(yù)后可能相關(guān)的臨床病理特征包括腫瘤分期、分級、攜瘤狀態(tài)、是否有殘留病灶、腹水中是否可找到腫瘤細(xì)胞、淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織學(xué)類型等。進(jìn)一步多因素分析發(fā)現(xiàn)，NKAIN1還可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子與總體生存期相關(guān)(HR：1.05；CI：1.01～1.1；P=0.013)(表3)。

圖2NKAIN1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Figure 2. Relationship betweenNKAIN1Expression and Clinicopathologic Features

A: Stage; B: Grade; C: Status; D: Peritoneal cytology; E: Histological type; F: Impact ofNKAIN1expression on overall survival in EC patients in TCGA cohorts.

EEA: Endometrioid endometrial adenocarcinoma; MSE: Mixed serous and endometrioid adenocarcinoma; SEA: Serous endometrial adenocarcinoma; TCGA: The Cancer Genome Atlas.

表2NKAIN1的表達(dá)*與臨床病理特征的關(guān)系(邏輯回歸)

Table 2. The Relationship betweenNKAIN1Expression*and Clinicopathological Characteristics (Logistic Regression)

ClinicopathologicalcharacteristicTotal(n)ORinNKAIN1expressionPStage(III/IVvsI/II)5482.04(1.39-3.01)0.003Grade(G2/G3vsG1)5302.41(1.53-3.87)<0.001Status(withtumorvstumorfree)5042.11(1.29-3.54)0.004Histology(MSE/SEAvsEEA)5413.49(2.31-5.38)<0.001Lymphnodes(NxvsN0)5230.62(0.37-1.04)0.070Surgicalapproach(openvsminiinvasive)5191.15(0.81-1.64)0.440Peritonealwash(positivevsnegtive)4073.29(1.79-6.33)<0.001Residualtumor(R1/R2vsR0)4091.13(0.58-2.22)0.720

*Categorical dependent variable, greater or less than the median expression level.

Abbreviations as indicated in Figure 2.

2.4 GSEA確定的與NKAIN1相關(guān)的信號通路

為查找子宮內(nèi)膜癌中哪些通路被激活，我們以NKAIN1的表達(dá)量做為表型，分為高表達(dá)組及低表達(dá)組，完成GSEA。以MSigDB數(shù)據(jù)庫中c2.cp.kegg.v5. 2. symbols. gmt 數(shù)據(jù)集作為功能基因集，按NES進(jìn)行排序，在高表達(dá)及低表達(dá)組中分別選擇FDR-q值<0.05且FWER-p值<0.05的基因富集通路。結(jié)果表明NKAIN1高表達(dá)組主要富集在細(xì)胞周期及剪接體兩種通路中，提示NKAIN1可能通過以上方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，影響患者的預(yù)后(圖3)。

表3 單因素與多因素分析NKAIN1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌總生存期的關(guān)系

Table 3. Univariate Analysis and Multivariate Analysis of the Correlation betweenNKAIN1Expression and Overall Survival of Endometrial Carcinoma Patients

VariableUnivariateCoxMultivariateCoxHR95%CIPHR95%CIPAgeStage1.032.30.99-1.061.71-3.10.118<0.0011.380.93-2.050.111Race1.190.83-1.690.340Grade1.941.16-3.240.0121.420.78-2.590.250Status8.754.55-16.84<0.0016.252.75-14.19<0.001Peritonealwash5.913.02-11.57<0.0011.480.6-3.640.398Residualtumor2.441.59-3.75<0.0010.840.5-1.420.513Surgicalapproach0.720.36-1.430.344Lymphnodes0.460.21-0.970.0420.640.26-1.570.335Pathology1.511.07-2.130.0201.160.76-1.790.491NKAIN11.041-1.080.0161.051.01-1.10.013

HR: Hazard Ratio;CI: Confidence Interval.

圖3NKAIN1基因高表達(dá)樣本相關(guān)富集基因集

Figure 3. Enrichment Plots of GSEA Results

A: Cell cycle; B: Spliceosomes are differentially enriched inNKAIN1-related EC.

GSEA: Gene set enrichment analysis; NES: Normalized enrichment score; FDR: False discovery rate; FWER: Family-wise error rate; EC: Endometrial carcinoma.

3 討 論

本文利用TCGA提供的子宮內(nèi)膜癌高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,證明子宮內(nèi)膜癌中NKAIN1表達(dá)增高與進(jìn)展期的臨床病理參數(shù)相關(guān)(如III/IV期、高級別、腹水中找到腫瘤細(xì)胞以及癌組織類型為SEA等)。生存分析及單因素、多因素分析也提示NKAIN1高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，且NKAIN1的表達(dá)可作為獨(dú)立的指標(biāo)預(yù)測患者結(jié)局。為了進(jìn)一步探討NKAIN1在子宮內(nèi)膜癌中可能的作用機(jī)制，我們又完成了GSEA，結(jié)果顯示若以NKAIN1表達(dá)量作為表型，細(xì)胞周期及剪接體通路明顯地富集在NKAIN1高表達(dá)組中。

NKAIN是一種可與Na,K-ATP酶β亞基相互作用的新型跨膜蛋白家族[5]。Na,K-ATP酶作為一種跨膜蛋白復(fù)合體存在于所有高等真核生物中，它的作用是利用能量泵維持細(xì)胞內(nèi)外離子和滲透壓平衡。由于Na,K-ATP酶抑制劑可增加心肌收縮力，故其主要用于治療心力衰竭。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Na,K-ATP酶抑制劑在很多惡性腫瘤如前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、肺癌[10]及白血病[11]等中具有抗癌作用，而且Na,K-ATP酶抑制劑已作為藥物進(jìn)入臨床前及早期臨床試驗階段[11]。人們在腫瘤細(xì)胞株及組織中發(fā)現(xiàn)Na,K-ATP酶的亞基表達(dá)量或定位發(fā)生改變[12-16]可能與其抑制劑的抗癌作用有關(guān)。我們推測NKAIN可能通過與Na,K-ATP酶β亞基相互作用，改變β亞基的表達(dá)量或定位，從而改變子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)行為。

NKAIN最初是由Svetlana Gorokhova等利用生物信息學(xué)在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，NKAIN家族由4個進(jìn)化保守的膜蛋白組成(NKAIN1、2、3和4)。研究者通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)現(xiàn)NKAIN 4個家族成員在鼠腦的中樞神經(jīng)元中高表達(dá)，其C端結(jié)構(gòu)域可與Na,K-ATP酶的β1亞基相互作用并與Na-K-ATP酶調(diào)節(jié)子共同形成復(fù)合體。若將果蠅NKAIN表達(dá)減低會顯現(xiàn)熱敏表型，即當(dāng)把果蠅放置在38℃時，會變得嚴(yán)重不協(xié)調(diào)，表現(xiàn)出癲癇樣的運(yùn)動，并在10分鐘內(nèi)癱瘓[5]。NKAIN2位于人第6號染色體上，作為一種抑癌基因常常在某些腫瘤中(如前列腺癌[17]、淋巴瘤及白血病[18]等)因基因重排而缺失[16]。人們對于NKAIN1研究僅限于酒精依賴性疾病[19]，其與腫瘤的關(guān)系尚無人研究。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)NKAIN1在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)增高，高表達(dá)NKAIN1與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后呈正相關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

我們還發(fā)現(xiàn)NKAIN1表達(dá)增高與細(xì)胞周期及剪接體有關(guān)。mRNA前體的剪接是幾乎所有人類mRNA成熟所必需的，而且是調(diào)節(jié)許多基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。選擇性剪接是指通過剪接位點的選擇，將一個mRNA前體加工成不同的mRNA成熟體，從而使單個基因產(chǎn)生多種不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。雖然由可變剪接產(chǎn)生的大多數(shù)異構(gòu)體的功能尚不清楚，但人們發(fā)現(xiàn)有些特異性異構(gòu)體能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[20]。在某些情況下，特定的剪接被剪接位點附近反復(fù)出現(xiàn)的點突變促進(jìn)或抑制，通過誘導(dǎo)編碼腫瘤的抑制基因發(fā)生錯誤剪接而促進(jìn)癌癥的發(fā)生[21]，或者通過使編碼核心剪接體蛋白和相關(guān)的RNA剪接因子發(fā)生突變也能促進(jìn)或抑制腫瘤的生長[22]。NKAIN1可能通過參與上述兩種途徑促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。

綜上所述，NKAIN1的表達(dá)水平可能成為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后結(jié)局的潛在的分子標(biāo)志物，細(xì)胞周期及剪接體可能是NKAIN1發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路。本文的不足在于，由于是基于TCGA數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)，對照組樣本量僅23例，且由于用轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)預(yù)測蛋白表達(dá)量還不夠準(zhǔn)確[23]，另外，僅用GSEA推測與NKAIN1可能相關(guān)的通路有一定的局限性，后續(xù)還需要組織、細(xì)胞及動物實驗進(jìn)一步驗證。

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