長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR靶向調(diào)控miR-206對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

周賢靜, 柳秀芳, 李亞軒, 李 皓, 戴曉榮,>黃 震, 唐 娟, 成宏偉,

(蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院, 1. 消化內(nèi)科; 2. 內(nèi)鏡中心; 3. 科研實(shí)驗(yàn)中心, 江蘇 泰興, 225400)

胃癌屬消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，中國(guó)每年死于胃癌的病例在全球同期胃癌總死亡病例中占比超過(guò)40%, 其發(fā)病率和病死率仍居癌癥前列[1-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類存在于真核生物體內(nèi)且長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA，但不具備編碼蛋白質(zhì)的功能。近年來(lái)研究[4]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可通過(guò)表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種方式參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程。HOTAIR是一種與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，Jiang D等[5]發(fā)現(xiàn)在胃癌中HOTAIR呈高表達(dá)狀態(tài)，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-454-3p上調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)/細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)蛋白(STAT3/Cyclin D1)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。Ding W等[6]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，HOTAIR可通過(guò)負(fù)向調(diào)控微小RNA-206(miR-206)上調(diào)Bcl-w蛋白表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在多種消化道腫瘤中，抑癌基因miR-206呈低水平表達(dá)，可調(diào)控多種抗凋亡蛋白表達(dá)水平。Deng M等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-206在胃癌中可負(fù)向調(diào)控靶基因MUC1的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。研究[8]報(bào)道，過(guò)表達(dá)miR-206可下調(diào)靶蛋白CDK9的表達(dá)水平，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。目前尚無(wú)研究表明HOTAIR可靶向調(diào)控miR-206表達(dá)來(lái)影響胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡能力。本研究通過(guò)下調(diào)HOTAIR的表達(dá)，探討HOTAIR對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡能力、對(duì)抗凋亡蛋白CDK9的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人胃腺癌細(xì)胞(AGS)購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RPMI 1640、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司, Trizol、Lipofectamine 2000、青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、1%結(jié)晶紫染液、熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司, CCK-8試劑盒、胰酶、RIPA裂解液、實(shí)驗(yàn)所用二抗均購(gòu)自上海碧云天生物公司, si-RNA HOTAIR(si-HOTAIR)、miR-206抑制劑購(gòu)自蘇州吉瑪公司，實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，將AGS細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。將細(xì)胞分為對(duì)照組、si-HOTAIR組、si-HOTAIR+miR-206抑制劑組。將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于六孔板中，按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行定量分析后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，而后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量(以2-△△CT法表示)。HOTAIR上游引物為5′-GGGACAGAAGGAAAGCCCTC-3′, 下游引物為5′-TTGAGAGCACCTCCGGGATA -3′; 內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-GGAGTCCACTGGCGTCTT-3′, 下游引物為5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′; miR-206上游引物為5′-GCGCGTGGAATGTAAGGAAGT-3′, 下游引物為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; 內(nèi)參U6上游引物為5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′, 下游引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。

1.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)HOTAIR與miR-206的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增回收特異性結(jié)合片段并插入到熒光素酶報(bào)告酶載體中，構(gòu)建HOTAIR野生型(HOTAIR-wt)質(zhì)粒，再通過(guò)定點(diǎn)誘變?cè)噭┖袑?duì)二者結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建HOTAIR突變型(HOTAIR-mut)質(zhì)粒。將miR-206模擬物(miR-206 mimics)與HOTAIR-wt或HOTAIR-mut共轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞中，24 h后測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢

利用CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，分別在0、24、48、72、96 h分別加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育3 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(OD值)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組胃癌細(xì)胞，胰酶消化后以每孔100個(gè)的密度接種于六孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)約2周，待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)終止。PBS浸洗后加入4%甲醛固定15 min，再用1%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，清洗晾干后拍照，計(jì)數(shù)每孔克隆形成數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞以每孔5×105個(gè)的密度平鋪于六孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。次日取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗3次后，加入結(jié)合緩沖液將細(xì)胞密度混懸至1×105個(gè)/mL, 取100 μL懸液加入5 μL Annexin V、10 μL碘化丙啶(PI)溶液于試管中混勻。室溫條件下避光孵育20 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。取50 μg樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 電泳后電轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉液封閉2 h, 一抗4 ℃下孵育過(guò)夜后用PBS漂洗，再加入二抗室溫孵育1 h后PBS進(jìn)行漂洗，最后加入化學(xué)發(fā)光顯色液并采集圖像，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用重復(fù)檢測(cè)方差分析或t檢驗(yàn)。采用Graph-Pad Prism 7軟件繪制圖片。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 下調(diào)HOTAIR的表達(dá)能促進(jìn)miR-206表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常人胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)相比, AGS細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)量顯著增高(P<0.001), miR-206的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01), 見(jiàn)圖1。與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR的AGS細(xì)胞中的HOTAIR表達(dá)量顯著降低(P<0.01), miR-206表達(dá)水平顯著增高(P<0.01), 見(jiàn)圖2, 提示HOTAIR能抑制miR-206的表達(dá)。

與GES-1比較, ??P<0.01, ???P<0.001。圖1 正常人GES-1細(xì)胞與人胃癌AGS細(xì)胞中HOTAIR及miR-206表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較, ??P<0.01。圖2 對(duì)照組與si-HOTAIR組HOTAIR及miR-206表達(dá)水平比較

2.2 miR-206是HOTAIR的靶基因

生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, HOTAIR與miR-206序列上存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí), miR-206 mimics能顯著降低HOTAIR-wt質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01), 而對(duì)于結(jié)合位點(diǎn)突變后的HOTAIR質(zhì)粒, miR-206 mimics則無(wú)明顯影響，提示HOTAIR能靶向結(jié)合miR-206。見(jiàn)圖3。

與對(duì)照組比較, ??P<0.01。圖3 對(duì)照組與miR-206 mimics組HOTAIR-wt質(zhì)粒及HOTAIR-wt質(zhì)粒表達(dá)水平比較

2.3 下調(diào)HOTAIR的表達(dá)可抑制AGS細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比, si-HOTAIR組OD值顯著降低, 2組24、48、72、96 h的組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 與si-HOTAIR組相比, si-HOTAIR+miR-206抑制劑組的生長(zhǎng)速度顯著增快, 2組48、72、96 h的組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示, si-HOTAIR組的克隆形成數(shù)顯著少于對(duì)照組(P<0.01), si-HOTAIR+miR-206抑制劑組的克隆形成數(shù)顯著多于si-HOTAIR組(P<0.05), 見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組比較, ???P<0.001; 與si-HOTAIR組比較, ##P<0.01。圖4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況

與對(duì)照組比較, ??P<0.01; 與si-HOTAIR組比較, #P<0.05。圖5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況

2.4 下調(diào)HOTAIR的表達(dá)可誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-HOTAIR組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01); 與si-HOTAIR組相比，si-HOTAIR+miR-206抑制劑組的細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6、7。

A: 對(duì)照組細(xì)胞凋亡情況; B: si-HOTAIR組細(xì)胞凋亡情況; C: si-HOTAIR+miR-206抑制劑組細(xì)胞凋亡情況。圖6 各組細(xì)胞凋亡情況流式圖

2.5 下調(diào)HOTAIR的表達(dá)抑制AGS細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá)

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-HOTAIR組抗凋亡蛋白CDK9的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.001); si-HOTAIR+miR-206抑制劑組的CDK9蛋白表達(dá)較si-HOTAIR組顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖8。

與對(duì)照組比較, ??P<0.01; 與si-HOTAIR組比較, #P<0.05。圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率情況

A: 各組CDK9蛋白免疫印跡圖; B: 各組CDK9蛋白相對(duì)表達(dá)水平。與對(duì)照組比較, ???P<0.001; 與si-HOTAIR組比較, ##P<0.01。圖8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞CDK9蛋白表達(dá)情況

3 討 論

近年來(lái)，研究[11]表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA在惡性腫瘤生物學(xué)行為中起著重要的調(diào)控作用，其異常表達(dá)影響著疾病的進(jìn)程和預(yù)后。長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR[12]位于哺乳動(dòng)物染色體12q13的HOXC基因位點(diǎn)上，可與各種染色質(zhì)修飾復(fù)合物相互作用，充當(dāng)分子支架以改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，是最早被報(bào)道具有反式基因調(diào)控表達(dá)功能的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。HOTAIR在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，被認(rèn)為是一類促癌基因，多項(xiàng)研究[13-15]報(bào)道HOTAIR在胃癌細(xì)胞及臨床腫瘤組織中表達(dá)均明顯增高，抑制HOTAIR的高表達(dá)可延緩胃癌的惡性生物學(xué)進(jìn)程，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，但其具體機(jī)制仍有待研究。本研究首先檢測(cè)了HOTAIR分別在正常胃上皮GES-1細(xì)胞與胃癌AGS細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)HOTAIR在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量較正常胃上皮細(xì)胞顯著增高，并用AGS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

研究[16-17]顯示miRNA是一類長(zhǎng)度在19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，單個(gè)miRNA可以靶向多個(gè)mRNA, 并影響功能互作網(wǎng)絡(luò)中的許多基因的表達(dá)，亦可為靶基因提供miRNA應(yīng)答元件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其中miR-206是一類在多種腫瘤中低表達(dá)的miRNA, 可負(fù)向調(diào)控胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。研究[18]報(bào)道上調(diào)miR-206可靶向調(diào)控CyclinD2阻滯胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和集落形成能力。Chen Z等[19]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-206表達(dá)可通過(guò)靶向抑制促分裂素原活化蛋白激酶3(MAPK3)的表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究下調(diào)AGS細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-206的表達(dá)水平顯著增高，提示HOTAIR可能抑制miR-206的表達(dá)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明, HOTAIR與miR-206在基因序列上存在連續(xù)的特定結(jié)合位點(diǎn)，而雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示miR-206 mimics能明顯抑制HOTAIR熒光素酶活性，而對(duì)序列突變后的HOTAIR熒光素酶活性的抑制作用減弱，進(jìn)一步證明HOTAIR能靶向抑制miR-206的表達(dá)。

細(xì)胞的無(wú)序增殖及緩慢凋亡是惡性腫瘤的特征之一，也是臨床上放化療等治療手段主要針對(duì)的病理過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HOTAIR的表達(dá)后, AGS細(xì)胞的增殖速度顯著降低，細(xì)胞凋亡水平顯著增高，并抑制相關(guān)凋亡蛋白CDK9的表達(dá)；而miR-206抑制劑能顯著減弱si-HOTAIR對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用。CDK9[20]是一類抗凋亡蛋白，能與細(xì)胞周期蛋白T結(jié)合形成P-TEFb復(fù)合物調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程，影響細(xì)胞的凋亡。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制HOTAIR的表達(dá)能通過(guò)上調(diào)miR-206的表達(dá)進(jìn)一步抑制AGS細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述, HOTAIR通過(guò)靶向調(diào)控miR-206促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡，為臨床胃癌的治療及預(yù)后提供新的思路及理論依據(jù)。