督脈電針聯(lián)合康復訓練對脊髓損傷模型大鼠NGF、bFGF、BDNF 表達的影響

吳金隆 楊 堃 金永喜 葉必宏 毛顯禹 楊迎民

脊髓損傷是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，影響肢體的感覺、運動、括約肌和反射功能，具有較高的致殘率，單純西藥治療難以達到預期效果[1]。研究表明，軸突再生是脊髓損傷后運動和神經(jīng)功能恢復的基礎和目標[2]。督脈電針能增強神經(jīng)營養(yǎng)因子表達、促進軸突再生[3]?？祻陀柧毻ㄟ^改善損傷脊髓局部血液循環(huán)、誘導神經(jīng)肌肉的塑性、促進軸突再生和營養(yǎng)因子表達，積極促進損傷脊髓功能恢復[4]。二者聯(lián)合治療研究較少，為明確督脈電針與康復訓練相結(jié)合的方法對脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復的影響，本研究觀察督脈電針聯(lián)合康復訓練對脊髓損傷模型大鼠神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表達的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 64 只成年健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量190～210g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2015-0001]提供，經(jīng)倫理委員會審核，對動物處置方法符合相關倫理要求。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心[動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009]，環(huán)境溫度22～25°C，相對濕度40%～60%，分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。

1.2 試劑與儀器 硫酸慶大霉素注射液（瑞陽制藥有限公司，規(guī)格8 萬U，批號17050711），兔源性NGF單克隆抗體、兔源性BDNF 單克隆抗體、兔源性甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（上海碧云天生物技術公司，批號AF1411、AF1423、AF1186），兔源性bFGF 單克隆抗體（Sino Biological 公司，批號R013），蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號SW2020），一次性無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格0.25mm×13mm，批號20162270970），低頻電子脈沖治療儀購自上海華誼醫(yī)用儀器有限公司（型號G6805-2A）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 SD 大鼠腹腔麻醉后俯臥位固定，常規(guī)備皮、消毒，以T11 棘突為中心作后正中切口，逐層分離暴露，用血管鉗除去T11 棘突，暴露椎弓板，予切除，暴露脊髓，用溫生理鹽水沖洗傷口。虹膜刀于T12 節(jié)段沿脊髓中線垂直插入至椎管腹側(cè)壁，并向右切開脊髓，保證右側(cè)半脊髓完全橫斷，用冰生理鹽水局部沖洗。術后大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙后肢及軀體抽搐并回縮撲動，呈現(xiàn)弛緩性癱瘓，提示造模成功。所有大鼠術后予以輔助排尿直至排尿反射恢復，予以慶大霉素8 萬U 每天1 次腹腔注射以預防感染，共4 天。

2.2 分 組 將大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分成四組：對照組、督脈電針組、康復訓練組、督脈電針聯(lián)合康復訓練組，每組再按照治療期為4 周或8 周而分成4 周、8 周兩個亞組，共八組，每組8 只。

2.2.1 對照組 僅如上制備，不行電針及康復訓練。

2.2.2 督脈電針組 術后第4 天開始，參照《實驗針灸學》[5]選擇兩組督脈穴位：（1）兩個阿是穴，分別位于脊髓損傷處上、下約兩個脊髓段的椎體棘突之間；（2）腰俞穴和長強穴。將大鼠固定于柔性大鼠固定器上，無菌針灸針進針深度為穿皮后再進針約2mm，留針30min。采用低頻電子脈沖治療儀進行電針刺激，頻率為2Hz，持續(xù)30min，刺激強度以大鼠耐受為主，逐步增加，從1V 開始，每10min 增加1V，終強度為3V。每天1 次，每周治療5 天。

2.2.3 康復訓練組 術后第4 天開始，將6 個特制塑料瓶（塑料瓶內(nèi)徑0.5cm，長22cm，管口端呈圓錐形；大鼠右后肢伸出孔3.2cm×2.2cm，孔前緣距瓶10.5～20cm 以適應不同身長的大鼠；孔緣的瓶壁反折并固定，以減小摩擦；大鼠尾巴伸出孔2.5cm×1.7cm，位于瓶底的下部；大鼠進瓶入口位于瓶底上部；大鼠鼻孔可從瓶口伸出自由呼吸）并排固定在一塊木板上，后方為訓練大鼠的旋轉(zhuǎn)平臺，將大鼠固定于塑料瓶內(nèi)，使其右后肢的腳掌固定在旋轉(zhuǎn)平臺上。旋轉(zhuǎn)平臺帶動大鼠右后肢做直徑4cm 的環(huán)轉(zhuǎn)運動，18r/min，30min/次，每天1 次，每周訓練5 天。

2.2.4 督脈電針聯(lián)合康復訓練組 將上述兩組實驗方法結(jié)合，治療間隔為30min。

2.3 取 材 各組大鼠在相應時間點予以處死，麻醉后固定大鼠，開胸暴露心臟，左心室插管灌注生理鹽水，取包括損傷段的脊髓5mm，漂洗脫干后-80°C冰箱保存。

2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot，WB） 已制備脊髓標本加細胞裂解液研磨，提取總蛋白。經(jīng)制膠，蛋白變性電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2h，洗膜3 次，加NGF、bFGF、BDNF、GAPDH 一抗，4°C 孵育過夜，洗膜4次，加二抗，37°C 孵育1h，洗膜后顯影。采用Alpha Ease FC 軟件對圖像進行分析，結(jié)果以NGF、bFGF、BDNF 和內(nèi)參GAPDH 平均光密度值的比值表示蛋白相對表達水平。

2.5 行為學評分 采用Basso，Beattie and Bresnahan（BBB）行為評分法評分[6]，選擇固定的3 人分別觀察記錄，1 周1 次，時間設于早晨8∶00-9∶00，均對雙側(cè)后肢分別進行評分，取平均值。統(tǒng)計分析相應時間點4 周、8 周BBB 評分。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 軟件包統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（） 表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 實驗動物情況 因麻醉意外、腹脹等原因，實驗過程中對照組、督脈電針組各死亡1 只大鼠，康復訓練組、督脈電針聯(lián)合康復訓練組各死亡2 只大鼠，均發(fā)生于造模5 天內(nèi)，均及時補充大鼠并完成實驗。

3.2 BBB 評分情況 造模前，各組大鼠BBB 評分均為21 分。造模后，與對照組比較，督脈電針組、督脈電針聯(lián)合康復訓練組（4 周組、8 周組）BBB 評分均明顯升高（P＜0.05），且8 周組高于相應4 周組（P＜0.05）；康復訓練組8 周組BBB 評分明顯高于對照組8 周組（P＜0.05）；督脈電針聯(lián)合康復訓練組8 周組BBB 評分均高于督脈電針組、康復訓練組8 周組（P＜0.05）。見表1。

3.3 各組神經(jīng)營養(yǎng)因子表達情況 與對照組比較，督脈電針組、督脈電針聯(lián)合康復訓練組（4 周組、8 周組）及康復訓練組8 周組大鼠脊髓NGF、bFGF、BD－NF 表達明顯上調(diào)（P<0.05）；督脈電針聯(lián)合康復訓練組8 周組大鼠脊髓NGF、bFGF、BNDF 表達高于督脈電針組、康復訓練組同一亞組（P<0.05）。見表2、圖1。

表1 各組脊髓損傷模型大鼠BBB 評分比較（分，）

表1 各組脊髓損傷模型大鼠BBB 評分比較（分，）

注：對照組不行電針及康復訓練；督脈電針組行電針；康復訓練組行康復訓練；督脈電針聯(lián)合康復訓練組行電針聯(lián)合康復訓練；BBB 評分為Basso,Beattie and Bresnahan 行為評分法；與對照組同亞組比較，aP＜0.05；與同組內(nèi)4 周組比較，bP＜0.05；與康復訓練組8 周組比較，cP＜0.05；與督脈電針組8 周組比較，dP＜0.05

表2 各組脊髓損傷模型大鼠脊髓NGF、bFGF、BDNF 表達比較（）

表2 各組脊髓損傷模型大鼠脊髓NGF、bFGF、BDNF 表達比較（）

注：對照組不行電針及康復訓練；督脈電針組行電針；康復訓練組行康復訓練；督脈電針聯(lián)合康復訓練組行電針聯(lián)合康復訓練；NGF 為神經(jīng)生長因子；bFGF 為堿性成纖維細胞生長因子；BDNF 為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；與對照組同亞組比較，aP＜0.05；與康復訓練組同亞組比較，bP＜0.05；與督脈電針組同亞組比較，cP＜0.05；與同組內(nèi)4 周組比較，dP＜0.05

4 討論

脊髓損傷后，局部組織將出現(xiàn)缺血、缺氧、水腫，細胞變性，神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏，導致神經(jīng)元細胞損傷、神經(jīng)傳導通路阻斷，并伴隨膠質(zhì)增生、炎癥反應、自由基誘導的凋亡和多種炎性過程介導的二次損傷，從而引起一系列功能障礙[7]。其恢復需通過神經(jīng)干細胞的分化使神經(jīng)元和軸突再生，但這種再生具有局限性，需要神經(jīng)營養(yǎng)因子支持[8]。

圖1 各組脊髓損傷模型大鼠脊髓NGF、bFGF、BDNF 表達

NGF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子典型代表，通過抑制細胞凋亡、抑制毒性氨基酸及自由基釋放等途徑保護神經(jīng)元，并積極促進神經(jīng)元的生長發(fā)育及軸突的重構(gòu)再生，修復被破壞的神經(jīng)回路[9]。BDNF 是一種廣譜神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要通過激活全長型酪氨酸受體激酶B（full-length tyrosine receptor kinase B，TrkB）發(fā)揮生物學作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，BDNF-TrkB 通路可發(fā)揮神經(jīng)保護、炎性因子調(diào)節(jié)、突觸可塑性等作用[10]。bFGF 對于中胚層和神經(jīng)外胚層源細胞具有顯著的促增殖作用，通過營養(yǎng)神經(jīng)元、促進受損神經(jīng)再生、抑制脊髓損傷區(qū)細胞凋亡來修復脊髓損傷[11]。

中醫(yī)認為，外傷性截癱的實質(zhì)為督脈受損，肢體筋脈失養(yǎng)，針刺督脈可直達病灶，疏通經(jīng)氣、培補真陽，使之上下陽氣貫通，氣血筋脈得以濡養(yǎng)，故治癱首取督脈。研究表明，電針督脈經(jīng)穴通過調(diào)控神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)及信號通路等，保護神經(jīng)元，促進神經(jīng)纖維再生和功能修復[12]。另有學者研究發(fā)現(xiàn)，夾脊電針可改善膠質(zhì)細胞、血管等神經(jīng)元周圍微環(huán)境、協(xié)同骨髓基質(zhì)間質(zhì)干細胞的分化促進神經(jīng)元的再生與成長[13]。張麗等[3]通過不同部位督脈取穴發(fā)現(xiàn)，背部督脈電針組在脊髓損傷恢復和神經(jīng)營養(yǎng)因子表達方面優(yōu)于頭皮督脈組。本實驗對脊髓損傷模型大鼠局部NGF、bFGF、BDNF 的表達進行評估，探討督脈電針、康復訓練對脊髓損傷修復的可能機制。選取的阿是穴、腰俞穴、長強穴均屬背部督脈，且腰俞穴配伍長強穴，可調(diào)任督之氣，疏通氣血。研究結(jié)果顯示，督脈電針4 周組、8 周組NGF、bFGF、BDNF 表達增強，BBB 評分升高，大鼠運動功能較前恢復，且8 周組改變更明顯。

近年研究表明，康復訓練可促進受損脊髓功能恢復，是脊髓損傷后肢體功能恢復的重要手段，李惠蘭等[14]通過減重步行訓練SCI 大鼠發(fā)現(xiàn)，脊髓內(nèi)NGF、生長相關蛋白-43 的分泌表達增加，使脊髓內(nèi)步行中樞模式發(fā)生器神經(jīng)元再生和軸突出芽，促進其運動功能恢復。孫鵬等[15]發(fā)現(xiàn)，跑臺訓練通過下調(diào)Notch1、發(fā)狀分裂相關增強子1 的表達，抑制Notch信號通路，促進SCI 的功能恢復。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，康復訓練組治療4 周療效不明顯，8 周后療效明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可能與運動訓練對損傷脊髓再生起效較緩、需長期反復訓練刺激有關。

本實驗結(jié)果顯示，對照組脊髓損傷大鼠BBB 評分有所升高，考慮與自發(fā)性脊髓可塑性及創(chuàng)傷所致局部神經(jīng)營養(yǎng)因子表達增加相關，但這種再生能力有限，與既往同類研究結(jié)果一致[14]。部分研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達1 周時開始升高，2～4 周達高峰，后期逐漸下降，但實驗時間設計多為4 周左右，缺乏長療程研究數(shù)據(jù)[16]。本實驗中對照組8 周神經(jīng)營養(yǎng)因子表達與4 周差別不大，而康復訓練組、督脈電針組、聯(lián)合治療組8 周組較4 周組明顯升高，可能與持續(xù)治療促進營養(yǎng)因子表達有關，具體機制有待進一步深入研究。督脈電針聯(lián)合康復訓練組大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子表達、運動功能恢復優(yōu)于單一治療組，同李靈玲等[17]研究結(jié)果一致。

綜上所述，督脈電針、康復訓練可能通過增強神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達促進脊髓損傷模型大鼠運動功能的恢復，且二者聯(lián)合具有協(xié)同效應，隨著時間累積療效更明顯。