白芷炮制前后紅外光譜分析及歐前胡素的含量測(cè)定

劉麗軍呼謐允馬鳳朵王金梅王培卿*

1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院,河南 開(kāi)封 475000;2.開(kāi)封市功效成分研究與保健食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 開(kāi)封 475004;3.河南省藥食兩用資源功能研究國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,開(kāi)封,475004

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formvsana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。其味辛、性溫,歸胃、大腸、肺經(jīng),具有解表散寒,燥濕止痛,消腫排膿的功能。用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等癥[1]?，F(xiàn)代研究[2]表明,白芷主要含有香豆素、揮發(fā)油、苷類(lèi)和微量元素等,具有解熱、鎮(zhèn)痛、解痙、降壓、平喘、興奮運(yùn)動(dòng)、呼吸中樞、抑制脂肪細(xì)胞合成、抗菌、光敏性等方面的藥理作用[3]。白芷經(jīng)醋炙之后可加強(qiáng)其消腫作用,并且醋具有通淋作用。金潔[4]等研究發(fā)現(xiàn),歷史上白芷的炮制品種大致有16種,主要分為凈制、焙、煨、清炒、加輔料炒、浸、與藥物同用等7個(gè)方面,但白芷炮制發(fā)展至今,只有生白芷被沿用,并且被各地方標(biāo)準(zhǔn)和藥典收載。趙恒[5]考察了曬干、硫熏、80℃烘干、石灰埋藏等不同方法處理后白芷質(zhì)量的比較;李衛(wèi)敏[6]等采用HPLC法對(duì)經(jīng)過(guò)規(guī)范化炮制和經(jīng)過(guò)常規(guī)炮制后的白芷中歐前胡素含量進(jìn)行測(cè)定;袁子民[7]等采取HPLC法建立生品和酒燉品的指紋圖譜,比較炮制前后化學(xué)成分的變化。以上這些研究方法中,所采用的觀察指標(biāo)過(guò)于單一,容易因偶然因素造成結(jié)果的偏差。

現(xiàn)代紅外光譜技術(shù)可以對(duì)復(fù)雜混合物體系進(jìn)行整體性的分析和鑒定,以高信噪比的一維紅外光譜為鑒定的基礎(chǔ),結(jié)合有較高分辨率的二階導(dǎo)數(shù)譜,達(dá)到對(duì)復(fù)雜體系樣本的分析與鑒定[8]。傅立葉紅外光譜法是一種快速簡(jiǎn)便而非破壞性的分析方法,被廣泛應(yīng)用于中藥品質(zhì)的快速鑒別中[9]。近年來(lái),紅外二階導(dǎo)數(shù)譜技術(shù)的擴(kuò)展,使紅外光譜圖的分辨率提高,能獲得更多的光譜信息,這將成為中藥的分析鑒定的一種快速有效的新方法[10-11]。本文采用紅外光譜法對(duì)白芷炮制前后的成分變化進(jìn)行分析,找出生品及炮制品的紅外譜圖特征,并采用高效液相色譜法對(duì)白芷炮制前后歐前胡素的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Affinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);BT125D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京有限公司));600Y型多功能粉碎機(jī)(鉑歐五金廠);島津高效液相色譜儀LC-20AT(DGU-20A5R在線脫氣機(jī)、LC-20AT輸液泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器);LC-Solution色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(日本島津公司);AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,140903);甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠,色譜純);乙腈(美國(guó)Fisher公司,色譜純);溴化鉀、其他試劑為分析純;純凈水(杭州娃哈哈百利食品有限公司)。

白芷飲片于2016年9月購(gòu)于河南禹州,經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室李昌勤教授鑒定為傘形科植物白芷A.dahurica的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芷的炮制

白芷:取白芷飲片,大小分檔,除去雜質(zhì),備用。

醋白芷:取白芷生品,加一定量米醋拌勻,燜潤(rùn),待醋被吸收盡后,置炒制容器內(nèi),用文火炒至規(guī)定的程度時(shí),取出放涼。每100 kg白芷用米醋20 kg[12]。

2.2 樣品制備

分別取白芷生品及醋炙品,干燥后打粉,過(guò)100目篩,60℃干燥至恒重,置干燥器中備用。

2.3 方法學(xué)考察

取白芷生品,粗制品各3 mg,精密稱(chēng)定,加溴化鉀后,分別置于瑪瑙研缽中研磨均勻,經(jīng)壓片機(jī)壓制成厚度均勻的薄片。對(duì)壓片進(jìn)行掃描,獲得各樣品的一維紅外光譜,并計(jì)算其二階導(dǎo)數(shù)圖譜。

掃描條件:光譜測(cè)定范圍4 000～400 cm-1,掃描次數(shù)為20次,掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除水和二氧化碳的干擾。

2.3.1 精密度試驗(yàn)

將同一白芷生品壓片連續(xù)掃描5次,將得到圖譜進(jìn)行相似度比較,見(jiàn)圖1。相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、0.999 7、0.999 6、0.999 3、0.999 2,RSD=0.03%。結(jié)果表明,該儀器具有較好的精密度。

圖1 白芷紅外光譜精密度對(duì)比圖

2.3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取白芷生品,按照相同的制備方法進(jìn)行壓片,重復(fù)壓片5次,分別進(jìn)行紅外掃描測(cè)定,對(duì)所得圖譜進(jìn)行相似度比較,見(jiàn)圖2。相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、0.997 2、0.998 9、0.996 8、0.998 2,RSD=0.13%,結(jié)果表明,該方法具有較好的重現(xiàn)性,符合要求。

圖2 白芷紅外光譜重現(xiàn)性對(duì)比圖

圖3 白芷紅外光譜圖穩(wěn)定性對(duì)比圖

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一白芷生品樣品壓片,將樣品壓片放入真空干燥器中保存,每隔0.5 h測(cè)定一次,對(duì)3 h內(nèi)所測(cè)得圖譜進(jìn)行相似度比較,見(jiàn)圖3?；疽恢?圖譜間的相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、0.998 6、0.997 4、0.997 3、0.997 2、0.996 4、0.995 5,RSD=0.15%。結(jié)果表明,樣品在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品檢測(cè)

白芷生品、醋炙品,干燥后,粉碎,過(guò)100目篩。取各樣品2.0 mg,按2.2.2項(xiàng)下方法檢測(cè)。

2.5 白芷炮制前后有效成分含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備

取歐前胡素對(duì)照品0.3 mg,精密稱(chēng)定,置50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成濃度0.005 875 mg/m L的對(duì)照品溶液,保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 供試品溶液的制備

稱(chēng)取白芷粉末(過(guò)40目篩)0.4 g,置50 m L容量瓶中,加入色譜純甲醇45 m L,超聲處理(功率:300 W,頻率:50 k Hz)1 h,取出放冷,加色譜純甲醇至50 m L刻度線,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液即得,制成8 mg/m L的供試品溶液,保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3 色譜條件

采用InertSustainRP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm,流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%冰乙酸水溶液(B))進(jìn)行梯度洗脫(0～20 min,11%～22%A;20～40 min,22%～34%A;40～44 min,34%～38%;44～60 min,38%～39%A;60～65 min,39%～42%A;65～75 min,42%～43%A;75～85 min,43%～45%A;85～108 min,45%～65%A),流速1.0 m L·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)312 nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量30μL。各樣品所得圖譜見(jiàn)圖4、圖5、圖6。

圖4 對(duì)照品溶液色譜圖

圖5 白芷生品溶液色譜圖

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖6 醋白芷溶液色譜圖

精密吸取0.005 875 mg/m L的歐前胡素對(duì)照品溶液,按照上述色譜條件,依次進(jìn)樣10、20、30、40 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定歐前胡素的峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程Y=2.19×106X-2487,r=1.000 0。表明歐前胡素在0.058 75～0.235μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取歐前胡素對(duì)照品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄測(cè)得歐前胡素的峰面積。峰面積的RSD=0.12%(n=6),表明該方精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取白芷樣品6份,分別按照2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制成供試品溶液,進(jìn)樣10μL,測(cè)定歐前胡素峰面積,計(jì)算含量,其RSD=0.32%(n=6)。試驗(yàn)結(jié)果表明白芷中歐前胡素的含量測(cè)定重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取白芷樣品,按照2.3項(xiàng)下制備方法制成供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL,依次測(cè)定歐前胡素峰面積,結(jié)果歐前胡素的RSD=1.64%(n=6),表明供試品中的歐前胡素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.4 加樣回收試驗(yàn)

稱(chēng)取已知?dú)W前胡素含量的白芷生品粉末(過(guò)40目篩)6份,加入一定量的歐前胡素對(duì)照品,按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液,并測(cè)定其含量,進(jìn)行分析,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.7 含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)取白芷生品和醋炙品樣品粉末,按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液,測(cè)定并計(jì)算兩樣品中歐前胡素的含量。

2.8 結(jié)果

2.8.1 白芷生品及醋炙品的一維紅外光譜分析

盡管白芷生品與醋白芷的紅外光譜較為相似,但在各吸收峰的強(qiáng)度、形狀和位置上都有一定的區(qū)別,見(jiàn)圖7。從白芷生品圖譜整體上來(lái)看,165 3.64、293 0.80 cm-1分別為香豆素類(lèi)及揮發(fā)油類(lèi)成分的特征峰,101 8.41、108 0.14、124 2.16 cm-1為內(nèi)脂環(huán)產(chǎn)生的吸收峰,進(jìn)一步確定了以?xún)?nèi)脂環(huán)為母核結(jié)構(gòu)的香豆素類(lèi)成分的存在。經(jīng)醋炙之后,紅外圖譜最明顯的變化是在373 4 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)小的吸收峰。此外,醋炙后293 0.80 cm-1處峰強(qiáng)度明顯減弱,這可能與白芷醋炙之后揮發(fā)油成分有所損失有關(guān)。從總體上看,所有峰的強(qiáng)度均明顯減弱。

圖7 白芷生品和醋炙品的紅外光譜對(duì)比圖

2.8.2 白芷生品及炮制品的二階導(dǎo)數(shù)圖譜分析

見(jiàn)圖8所示,圖中標(biāo)記的1處的峰,在白芷生品中不太明顯,醋炙之后1處出現(xiàn)兩個(gè)明顯的單峰;與生品相比,醋炙品2處的單峰強(qiáng)度明顯減弱;另外從圖9可以看出,生品的二維圖譜在3處有一小單峰,經(jīng)醋炙后,該單峰幾乎消失;白芷經(jīng)醋炙后,在4處出現(xiàn)了一個(gè)小的單峰,而生品中沒(méi)有。此外,白芷生品中6處單峰含右肩峰,經(jīng)醋炙之后,肩峰消失;醋炙品與生品相比,5處和7處幾個(gè)強(qiáng)的單峰強(qiáng)度都明顯減弱;在醋炙品中,8處出現(xiàn)一個(gè)肩峰。上述的這些變化均可以作為通過(guò)紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)圖譜判斷白芷是否經(jīng)醋炙的重要標(biāo)志。

表1 白芷中歐前胡素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

圖8 白芷生品和醋炙品的二階導(dǎo)數(shù)圖譜(對(duì)比)

圖9 白芷生品和醋炙品的二階導(dǎo)數(shù)圖譜(2 000～200 cm-1波段)

2.8.3 白芷炮制前后歐前胡素的含量測(cè)定結(jié)果

白芷炮制前后歐前胡素的含量分別為0.05%和0.04%。

3 討論

紅外光譜法從樣品制備到紅外測(cè)定的過(guò)程中,研磨是否充分均勻以及研磨環(huán)境是否充分干燥都可能對(duì)壓片造成影響,從而造成掃描得到紅外圖譜的差異性,最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn),確定白芷粉末3 mg加100 mg KBr研磨混合均勻后,掃描得到的紅外圖譜重復(fù)性良好。

白芷生品及醋炙品均具有較明顯的紅外“指紋”特征,紅外光譜法快捷、簡(jiǎn)便、易操作,可作為快速鑒別原藥材及其炮制品的重要工具。另外,二階導(dǎo)數(shù)圖譜可提高圖譜的分辨率,更直觀地反映出各樣品的紅外光譜特征,將各樣品圖譜間的差異放大化,更便于比較。