基于mt DNA COⅠ設(shè)計種特異性引物快速鑒定具條實蠅

黃 振，郭瓊霞，陳韶萍，3

(1.福州長樂機場海關(guān)，福建 福州 350209； 2.福州海關(guān)檢驗檢疫技術(shù)中心福建 福州 350001； 3.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002)

具條實蠅(Bactrocerascutellata(Hendel))為國際上主要檢疫性害蟲，也是我國進境植物檢疫性有害生物。具條實蠅隸屬實蠅科(Tephritidae)果實蠅屬(Bactrocera)[1]。近年來，隨著全球氣候變暖和果蔬進口的批量增多以及國內(nèi)果蔬的貿(mào)易流通，具條實蠅在我國發(fā)生為害的潛在危險性不斷增加，一旦傳入發(fā)生，不僅會嚴重危害果蔬生產(chǎn)，造成直接的經(jīng)濟損失，還將影響我國果蔬的對外貿(mào)易和國際聲譽，產(chǎn)生許多不利影響[2]。具條實蠅的形態(tài)與其同屬的近緣種極其相似，而且現(xiàn)行進境的水果中截獲到的均為卵、幼蟲和蛹，需通過飼養(yǎng)為成蟲后再行鑒定，如此，加上飼養(yǎng)周期、飼養(yǎng)條件和蟲態(tài)等因素的限制，在口岸短時間里無法做到快速鑒定，也勢必影響進境果蔬快速通關(guān)，因此開展關(guān)于實蠅的快速鑒定識別的技術(shù)研究迫在眉睫。具條實蠅主要分布在越南[3]、印度[4]、緬甸[5]、老撾[6]、日本[7-8]及韓國[9]；我國在廣東、福建、廣西、浙江、江西、海南、四川、貴州、云南、湖北、陜西和臺灣等地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)[4，7]。具條實蠅主要危害茄科植物、瓜類和芒果等具有經(jīng)濟價值的果蔬，近年來，具條實繩在我國的分布范圍急劇擴大，對我國經(jīng)濟造成很大影響，在我國的部分地區(qū)如安徽、陜西、河南等，具條實蠅危害果蔬已上升為主要的實蠅類的害蟲之一[10-12]。

本文基于種特異引物PCR-SS-PCR技術(shù)，研究了一種采用設(shè)計目標物種特異性引物的快速鑒定方法，能夠快速、準確鑒定截獲的實蠅的卵、蛹、幼蟲、成蟲等不同蟲態(tài)，甚至殘體等，解決傳統(tǒng)形態(tài)學分類方法難以解決的問題[13-14]，并在口岸檢疫截獲中得到驗證和應用，為實蠅的疫情監(jiān)測和口岸果蔬的快速通關(guān)提供參考。

1 供試蟲樣

本試驗供試的實蠅種類有：具條實蠅、瓜實蠅(B.cucurbitae(Coquillett))、黑顏實蠅(B.diaphora(Coquillett))、顏帶實蠅(B.cilifer(Hendel))、何氏華實蠅(B.hochii(Zia))、銹實蠅(B.rubigina(Wang & Zhao))、番石榴實蠅(B.correcta(Bezzi))、楊桃實蠅(B.carambolaeDrew & Hancock)、桔小實蠅(B.dorsalis(Hendel))、瘤脛實蠅(B.tuberculata(Bezzi))、辣椒實蠅(B.latifrons(Hendel))、南瓜實蠅(B.tau(Walker))、黑膝實蠅(B.scutellaris(Bezzi))、近黑顏實蠅(B.parater(Zhao & Lin))、瑞麗果實蠅(B.ruiliensis(Wang，Long et Zhang))、滇寡鬃實蠅(B.modica(Hardy))、五指山實蠅(B.wuzhishana(Lin et Yang))、瓜棍腹實蠅(Dacuslongicornis(Wiedemann))、棗實蠅(Carpomyavesuviana(Costa))和腿端黑實蠅(B.atrifemur(Drew & Hancock))等20種實蠅，以上均隸屬于《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名單》之中的檢疫性有害生物。蟲樣來自口岸截獲和邊境監(jiān)測。

2 試驗方法

2.1 DNA提取和質(zhì)量檢測

2.1.1 DNA提取 本試驗采用試劑盒法(E.Z.N.A.TM Insect DNA Kit)提取基因組DNA[15]。

2.1.2 DNA質(zhì)量檢測 利用上游LCO 1 490(序列為5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’)和下游HCO 2 198(序列為為5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)1對通用引物對供試的20實蠅蟲樣提取的DNA模板質(zhì)量進行檢測。具體步驟為將實蠅或是身體部分(如翅或足)或是幼蟲、蛹放置于2 mL的離心管中，加入一定量的液氮研磨后，按照試劑盒說明書的指南進行操作，再將提取得到的基因組DNA模板樣品置于冰箱(-20 ℃)備用，PCR反應在定量梯度PCR儀上進行。

2.2 引物設(shè)計

通過數(shù)據(jù)庫(NCBI)查找具條實蠅已公布登錄的序列與已知其它種類的實蠅序列進行比對，選定登錄號為KF660107的基因序列(mt DNA COⅠ)，應用BLAST程序檢查與數(shù)據(jù)庫中提供的同源序列，確定設(shè)計具條實蠅特異性引物的實蠅種類和登錄號為：具條實蠅B.scutellataKF660107.1、普通果實蠅B.caudateGQ154089.1、瓜實蠅B.cucurbitaeGQ154098.1、黑膝實蠅B.scutellarisKF660082.1、銹實蠅B.rubiginaKF659744.1、南瓜實蠅B.tauKF660144.1、五指山實蠅B.wuzhishanaKM024416.1、辣椒實蠅B.latifronsKJ753915.1等8種實蠅，下載8種實蠅登錄號對應序列的FASTA格式，利用數(shù)據(jù)庫(NCBI)中的Primer-Premier 5.0、Oligo 6.44，分別進行人工設(shè)計引物、引物評定，并進行ClustalW多重比對，篩選出種特異性引物JF’190和JR’386，再利用NCBI數(shù)據(jù)庫，將設(shè)計的JF’190和JR’386引物，通過Primer-BLAST程序，進行同源序列檢查，最終將正向引物JF’190的第1、16個堿基T轉(zhuǎn)換成C，第3、7、20個堿基A轉(zhuǎn)換成G，確定出引物JF190和JR386。

2.3 引物種特異性測試

對篩選確定的引物JF190和JR386進行種特異性測試，其步驟為：選用具條實蠅為陽性對照，其余的19種實蠅蟲樣作為陰性對照，設(shè)計本試驗的反應體系和反應條件，采用凝膠成像分析儀分析篩選確定的引物是否能擴增出預期大小的目標片段，測試驗證本試驗所設(shè)計引物的種特異性。

2.4 引物靈敏度的測試

選取不同蟲態(tài)的具條實蠅蟲樣提取基因組DNA，將其DNA模板濃度按10-1、10-2、10-3倍3種梯度稀釋，再采用核酸蛋白分析儀檢測種特異性引物JF190和JR386的靈敏度。

2.5 應用與驗證

采用口岸進口截獲的實蠅(幼蟲已飼養(yǎng)到成蟲，并經(jīng)專家鑒定復核，確認為具條實蠅)的幼蟲、卵、蛹以及成蟲的不同蟲態(tài)和成蟲的部分腿、翅膀等蟲體組織作為蟲樣，提取基因組的DNA，用具條實蠅的種特異性引物JF190和JR386，應用SS-PCR技術(shù)方法進行PCR擴增檢測，驗證該技術(shù)方法和種特異性引物的穩(wěn)定性與準確性。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA質(zhì)量檢測結(jié)果

本實驗選用整只實蠅的蛹、幼蟲、成蟲，或是實蠅的一條腿，或是一片翅膀，作為實驗材料，根據(jù)試劑盒的說明書操作步驟進行提取，將得到基因組DNA，利用通用引物LCO1490和HC02198進行PCR擴增，結(jié)果是供試的20種實蠅的基因組DNA，均能在長度約700 bp的位置擴增出一條清晰透明的條帶(圖1)。

橫線部分為種特異性引物JF’190和JR’386的序列位置圖1 8種果實蠅的ClustalW多重比對的部分結(jié)果圖

3.2 引物的選擇

利用Bioedit對已下載的KF660107.1、KF660082.1、KM024416.1、GQ154089.1、KF660144.1、GQ154098.1、KJ753915.1和KF659744.1等8種實蠅序列，采用ClustalW多重比對方法，篩選出種特異性引物JF’190為5’-TAATTGATTAGTACCTTTAATACTCGG-3’；JR’386為5’-GATCAACAGATGCTCCTCCATGGG-3’(圖2)。種特異性引物JF190和JR386由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

M為50 bp DNA Ladder，1為具條實蠅，2為銹實蠅，3為番石榴實蠅，4為桔小實蠅，5為瑞麗果實蠅，6為楊桃實蠅，7為瘤脛實蠅，8為瓜實蠅，9為南瓜實蠅，10為辣椒實蠅，11為顏帶實蠅、12為近黑顏實蠅，13為滇寡鬃實蠅，14為黑膝實蠅，15為何氏華實蠅，16為瓜棍腹實蠅，17為棗實蠅，18為腿端黑實蠅，19為五指山實蠅，20為黑顏實蠅，21為空白對照圖2 對20種實蠅提取的DNA模板采用通用型引物LCO1490和HCO2198進行質(zhì)量檢測的結(jié)果

3.3 引物種特異性

將具條實蠅作為陽性對照，其余19種供試實蠅作為陰性對照，結(jié)果顯示僅具條實蠅在約197 bp位置擴增出一條單一的清晰透明的條帶外，其余的19種陰性實蠅樣本均未發(fā)現(xiàn)任何的條帶。引物的種特異性試驗重復3次，所得結(jié)果一致(圖3)，表明該種特異性引物JF190和JR386的特異性和穩(wěn)定性強。

將所獲得的PCR產(chǎn)物進行測序(由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司)，利用NCBI數(shù)據(jù)庫，將得到的序列進行BLAST，其結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的具條實蠅序列完全一致。

(M為100 bp DNA Ladder，1為具條實蠅，2為顏帶實蠅，3為銹實蠅，4為番石榴實蠅，5為桔小實蠅，6為瑞麗果實蠅，7為楊桃實蠅，8為瘤脛實蠅，9為瓜實蠅，10為南瓜實蠅，11為辣椒實蠅，12為滇寡鬃實蠅，13為黑膝實蠅，14為近黑顏實蠅，15為腿端黑實蠅，16為何氏華實蠅，17為瓜棍腹實蠅，18為五指山實蠅，19為黑顏實蠅，20為棗實蠅，21為空白對照圖3 引物JF190和JR386的種特異性驗證

M為100 bp DNA Ladder，1為10°倍，2為10-1倍，3為10-2倍，4為10-3倍，5為空白對照 圖4 引物JF190和JR386的靈敏度驗證

3.4 引物的靈敏度

采用核酸蛋白分析儀檢測已提取的具條實蠅DNA模板，質(zhì)量濃度為28.89 ng·μL-1。取3種梯度的DNA模板測定最低閾值濃度，結(jié)果是隨著模板濃度逐漸降低，所擴增出的條帶逐漸變淡，在稀釋10-3倍后，條帶還仍可發(fā)現(xiàn)(圖4)。說明該方法所獲取的種特異性引物具有較高的靈敏度。

3.5 應用與驗證

將本實驗方法應用于具條實蠅的實際鑒定工作中。將進口水果中截獲的印度、日本、老撾、泰國等不同國家的具條實蠅(經(jīng)專家鑒定復核)的蟲樣共20份，其中包括不同蟲態(tài)的具條實蠅蟲樣，再將瓜實蠅、南瓜實蠅等作為陰性對照，共22份，應用種特異性引物進行驗證。結(jié)果表明為具條實蠅的20份樣本，均發(fā)現(xiàn)有目標條帶，而對照則沒有，說明SS-PCR技術(shù)方法鑒定結(jié)果不僅能快速準確，而且具有較好的穩(wěn)定性，可以應用于具條實蠅的實際鑒定工作(圖5)。

4 討論

4.1 SS-PCR檢測鑒定方法靈敏度高

目前，以分子生物學技術(shù)進行檢疫性害蟲的鑒定研究在開展與應用中，在對具條實蠅的分子鑒定方面，Mun等[9]利用ApaI，NheI和SacI等限制性內(nèi)切酶，鑒別具條、桔小、南瓜以及地中海等4種實蠅；吳佳教等[17]應用PCR-RFLP技術(shù)對常見的具條、桔小等9種實蠅開展研究。張紅梅等[18]針對陜西省常見的4種實蠅，采用RAPD技術(shù)對其基因組DNA進行多態(tài)性研究。而本實驗主要是選用mt DNA COI基因的 DNA條形編碼技術(shù)，采用mt DNA COⅠ作為標記基因，設(shè)計種特異性引物進行鑒定。因為mt DNA COⅠ基因進化速率比核DNA快，很少存在插入和缺失，保守性較強，易被通用引物擴增，不同物種之間又存在足夠的變異能夠?qū)⑵浞珠_，所以選用mt DNA COⅠ作為標記基因建立的SS-PCR方法，檢測到的DNA模板濃度可低至2.889×10-4ng·μL-1，設(shè)計的特異性引物具有較強的特異性和較高的靈敏度，適用于種間鑒別[19]。

M為100 bp DNA Ladder，1～5為印度具條實蠅，6～10為日本具條實蠅，11～15為泰國具條實蠅，16～20為老撾具條實蠅，21為南瓜實蠅，22為瓜實蠅，23為空白對照圖5 應用種特異性引物SS-PCR技術(shù)快速鑒定具條實蠅的驗證

4.2 建立的SS-PCR方法可滿足口岸快速鑒定的需求

本實驗選用具條實蠅作為陽性對照，其它20個種類實蠅作為陰性對照，利用本實驗設(shè)計的特異引物，采用從印度、日本、泰國、老撾進境的水果中截獲的具條實蠅及其瓜實蠅和南瓜實蠅等進行混合實驗，僅具條實蠅成蟲的不同部分的組織和不同蟲態(tài)共20個樣品，能特異性并穩(wěn)定性地擴增出長度約197 bp的清晰且單一的目標條帶，因此，建立SS-PCR方法，具有很強的特異性，能特異快速鑒定出具條實蠅。本方法在應用于口岸果蔬進境截獲到具條實蠅的鑒定中，將其幼蟲進行飼養(yǎng)，用不同蟲態(tài)進行檢測驗證，結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致；同時進一步驗證了本實驗所設(shè)計引物的特異性。此外，本方法操作簡便快捷，鑒定快速準確，可應用于實際檢疫工作，解決了口岸快速鑒定的需求，并具有較好的應用價值。