高效液相色譜法測定小鼠血漿中苯并三唑類紫外線吸收劑UV-327和UV-328

朱梅青，崔 蓉

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

苯并三唑類紫外線吸收劑能廣泛吸收280～400 nm波長范圍的紫外線(ultraviolet, UV)，被廣泛應(yīng)用于化妝品、洗護用品等生活用品[1]，以及塑料制品、涂料、汽車擋風(fēng)玻璃、金屬防銹劑、緩蝕劑等工業(yè)用品。目前，苯并三唑類紫外線吸收劑是我國用量最大、品種最多、效果最好[2]的一類光穩(wěn)定劑，在長期、大量的使用過程中可進入生態(tài)環(huán)境，進而影響鳥類、海洋生物及人類的健康，現(xiàn)已成為新興的一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。苯并三唑類紫外線吸收劑中，2-(2′-羥基-3′,5′-二叔丁基苯基)-苯并三唑(UV-320)、2-(2-羥基-3′,5′-二叔丁基苯基)-5-氯苯并三唑(UV-327)和2-(2′-羥基-3′,5′-二叔戊基苯基)苯并三唑(UV-328)是常用的、關(guān)注度較高的3種[2]。研究表明，UV-320和UV-327的生物富集系數(shù)相對較高[3]，容易在高營養(yǎng)級生物中累積，在海洋食物鏈中具有較強的持久性和生物累積性[4]。毒性實驗研究結(jié)果表明，短期和長期暴露于UV-327或UV-328后，大鼠的肝、腎、甲狀腺和脾的血液指標(biāo)和組織病理學(xué)均發(fā)生顯著變化[5-7]。

鑒于苯并三唑類紫外線吸收劑的持久性、高遷移性、低生物降解性[1]，在環(huán)境中不易降解，且具有一定毒性，日本、美國、歐洲等多個國家和地區(qū)已開始禁止生產(chǎn)或限制使用UV-327和UV-328[8]。我國《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB9685—2008)[9]中規(guī)定，食品容器、包裝材料中UV-327的最大殘留量不得超過30.0 mg/kg。

目前，已報道的苯并三唑類紫外線吸收劑檢測樣品多為食品或飲料包裝材料、電子電器塑料部件、紡織品、水體和沉積物等非生物樣品，僅有少量研究報道了生物樣品中苯并三唑類紫外線吸收劑的測定方法[10-11]。因生物樣品中有機物含量高，基質(zhì)相對復(fù)雜，因此，樣品測定前需進行必要的提取和凈化處理，以去除基體干擾、提高檢測方法的靈敏度。然而，已報道的樣品前處理方法多復(fù)雜繁瑣，耗時較長，或需要特定的處理設(shè)備，測定苯并三唑類紫外線吸收劑的含量則多采用色譜法與質(zhì)譜法聯(lián)用，分析成本較高[12-14]。目前國內(nèi)外尚未見小鼠生物樣品中UV-327和UV-328測定方法的報道。本研究以UV-320為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜測定方法，擬建立小鼠血漿中UV-327和UV-328含量測定的新方法，以為UV-327和UV-328在機體內(nèi)的代謝、毒性等相關(guān)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀(包括Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 717 plus Autosampler，Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector)購自美國Waters科技有限公司，F(xiàn)A(N)/JA(N)系列電子天平購自上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司，BF2000氮氣吹干儀購自北京八方世紀(jì)科技有限公司，旋渦混合儀MX-S購自美國Scilogex公司，TGL-16G離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠。

UV-320(純度98%)購自上海畢得醫(yī)藥科技有限公司，UV-327、UV-328(純度98%)購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司，甲醇(純度≥99.9%)購自美國Mreda Technology Inc.(HPLC級)，丙酮、正己烷(分析純)購自北京市通廣精細(xì)化工公司，生理鹽水購自北京愛特蒙科技有限公司。

1.2 測定方法

1.2.1色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry?C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為100%甲醇，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長340 nm，室溫24 ℃進樣，進樣量10 μL。

1.2.2樣品采集 小鼠摘眼球取血，血液采集至抗凝離心管中，搖勻，13 560×g離心5 min。

1.2.3樣品預(yù)處理 取50 μL小鼠血漿，加入正己烷-丙酮溶液(體積比1 ∶1)1.0 mL，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)入干凈管中，50 ℃氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇溶解，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm尼龍過濾器過濾，待測。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取UV-320、UV-327及UV-328各10 mg，甲醇溶解、定容至100 mL容量瓶，配制UV-320、UV-327及UV-328標(biāo)準(zhǔn)儲備液(質(zhì)量濃度均為100 mg/L)。

用甲醇逐級稀釋UV-320標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制質(zhì)量濃度為0.40 mg/L的UV-320溶液。用甲醇逐級稀釋UV-327及UV-328標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制質(zhì)量濃度分別為0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、10.0、20.0 mg/L的UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.4 工作曲線的繪制

取空白小鼠血漿50 μL，分別加入UV-320溶液(0.40 mg/L)和不同濃度的UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，按照1.2.3小節(jié)所述方法處理樣品。以UV-327或UV-328的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其與UV-320的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。以3倍和10倍噪聲水平對應(yīng)的UV-327或UV-328的濃度確定方法的檢出限和定量限。

1.5 特異性

考察6個不同個體空白小鼠血漿色譜圖、空白小鼠血漿加內(nèi)標(biāo)色譜圖、空白小鼠血漿加UV-327或UV-328和內(nèi)標(biāo)的色譜圖，以及空白小鼠血漿加UV-327、UV-328和內(nèi)標(biāo)的色譜圖，確定樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)是否會干擾被測物質(zhì)的測定。

1.6 準(zhǔn)確度與精密度

在50 μL空白小鼠血漿中加入UV-320溶液(0.40 mg/L)和一定濃度的UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，制備低、中、高(0.50、1.00、2.00 mg/L)3種濃度的質(zhì)量控制樣品(質(zhì)控樣品)，每種濃度做6個平行樣，按照1.2.3小節(jié)所述方法處理樣品，連續(xù)測定3 d。準(zhǔn)確度用質(zhì)控樣品的加標(biāo)回收率表示，加標(biāo)回收率應(yīng)在85%～115%范圍內(nèi)。精密度用質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示，RSD應(yīng)小于15%。

1.7 提取回收率

取空白小鼠血漿50 μL，分別于氮氣吹干前后加入UV-320溶液(0.40 mg/L)和不同濃度的UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，使得制備的加標(biāo)樣品中UV-327和UV-328最終質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00、2.00 mg/L，每種濃度做6個平行樣，按照1.2.3小節(jié)所述方法處理樣品。氮氣吹干前加標(biāo)測得的UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比記為A，氮氣吹干后加標(biāo)測得的UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比記為B，提取回收率=A/B×100%。

1.8 穩(wěn)定性

在50 μL空白小鼠血漿中加入不同濃度的UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與0.4 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液各100 μL，使UV-327和UV-328的質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00、2.00 mg/L，每種濃度取6個平行樣，分別于室溫下放置6 h和-40 ℃下保存15 d，考察小鼠血漿樣品中UV-327和UV-328的穩(wěn)定性。

1.9 實際樣品測定

雄性健康的SPF級ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供。小鼠灌胃前適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，自由攝食飲水。將UV-327或UV-328溶于玉米油中，配制質(zhì)量濃度為1.8 g/L的混懸液。小鼠分別灌胃UV-327或UV-328(36 mg/kg)，于2 h后摘眼球取血，迅速收集血液于抗凝離心管中，搖勻，13 560×g離心5 min，取血漿于-40 ℃冰箱保存，待測。

2 結(jié)果

2.1 工作曲線的線性范圍、檢出限與定量限

在0.05～10.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，UV-327或UV-328質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)UV-320(0.20 mg/L)的峰面積比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：y=4.723x+0.038，r=0.999 7；y=5.577x+0.519，r=0.999 7。UV-327和UV-328的檢出限均為0.01 mg/L，定量限為0.03 mg/L。

2.2 特異性

特異性結(jié)果顯示，UV-327、UV-328和內(nèi)標(biāo)UV-320可完全分離，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾UV-327、UV-328和內(nèi)標(biāo)UV-320的測定(圖1)。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度

準(zhǔn)確度和精密度分析結(jié)果顯示，本研究方法的準(zhǔn)確度和精密度可滿足分析測定的要求，空白小鼠血漿中未檢出UV-327、UV-328和UV-320(表1)。

2.4 提取回收率

3種加標(biāo)濃度UV-327和UV-328的提取回收率結(jié)果顯示，樣品前處理方法對目標(biāo)物質(zhì)的提取效率高，方法的準(zhǔn)確度好(表2)。

2.5 穩(wěn)定性結(jié)果

3種加標(biāo)濃度UV-327和UV-328的小鼠血漿樣品穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，小鼠血漿樣品室溫下至少可以放置6 h，-40 ℃冰箱中可以保存15 d(表3)。

2.6 實際樣品測定

灌胃給藥2 h小鼠血漿中UV-327和UV-328的色譜圖結(jié)果見圖2，UV-327和UV-328測得的平均濃度為4.98 mg/L和2.87 mg/L。

3 討論

通常生物樣品中苯并三唑類紫外線吸收劑的含量較低，多為μg/g[10]、ng/g[11]甚至pg/g[14]級，同時混雜著大量的內(nèi)源性成分。在復(fù)雜基體中分離和測定低濃度的目標(biāo)物質(zhì)，必須采用可靠、高效的樣品前處理方法，若前處理方法不當(dāng)，可能導(dǎo)致樣品中被測物質(zhì)的回收率較低，直接影響其定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 小鼠血漿中UV-327和UV-328準(zhǔn)確度與精密度實驗結(jié)果

RSD, relative standard deviation.

表2 小鼠血漿中UV-327和UV-328提取回收率結(jié)果(n=6)

Peng等[15]采用超聲提取、固相萃取柱凈化提取和富集水生魚類中的UV-327和UV-328等4種紫外線吸收劑。Kim等[12]以正己烷-丙酮為溶劑，采用加速溶劑萃取、硅膠柱凈化的方法對魚類中UV-320、UV-327和UV-328等苯并三唑類紫外線吸收劑進行富集和提取。Nakata等[10]在測定日本西部海域江豚脂肪組織中UV-320、UV-327和UV-328時，選用二氯甲烷和正己烷的混合物(8 ∶1)為萃取劑，利用索氏裝置提取5 h，以50%(體積分?jǐn)?shù))己烷與二氯甲烷的混合物為流動相進行凝膠滲透色譜法洗脫脂質(zhì)，后經(jīng)5%(體積分?jǐn)?shù))失活硅膠柱去除干擾，最終用5%(體積分?jǐn)?shù))乙醚-己烷溶液洗脫目標(biāo)化合物。Lee等[11]采用液-液萃取法提取母乳樣品中的苯并三唑類紫外線吸收劑，母乳樣品中加入8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))草酸鉀溶液、乙醇和乙醚混合溶液機械振蕩提取母乳樣品，己烷萃取兩次，再使用生物珠S-X3對提取液進行凝膠滲透層析以及硅膠柱層析。上述已報道的樣品前處理方法可滿足分析測定的需要，但操作方法較復(fù)雜或耗費的時間過長，且分析成本較高，亟需簡化操作步驟，縮減分析時間，進一步提高分析效率。

表3 小鼠血漿中UV-327和UV-328穩(wěn)定性實驗結(jié)果(n=6)

UV-320、UV-327和UV-328屬不同取代基的苯并三唑類紫外線化合物，均為弱極性或非極性物質(zhì)[16]，不溶于水，易溶于丙酮、苯、甲苯等有機溶劑，且在苯、甲苯中的溶解性較強。鑒于苯和甲苯毒性較強，本研究未予以考慮。根據(jù)相似相溶原理，同時參考了以往文獻報道，本研究分別考察了以甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、正己烷-丙酮(體積比1 ∶1)作為提取劑時，小鼠血漿中UV-327和UV-328的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以正己烷-丙酮萃取時，目標(biāo)物分離良好，雜峰較少，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，萃取效果最佳，因此本研究選擇以正己烷-丙酮(體積比1 ∶1)作為提取劑。

根據(jù)UV-320、UV-327和UV-328的紫外-可見吸收光譜可知[17]，各組分在340 nm處均有較強的吸收，因此本研究選擇檢測波長為340 nm。已報道的文獻中，苯并三唑類紫外線吸收劑通常采用梯度洗脫以獲得完美峰形，同時達到縮短分析時間和提高分離效果的目的。本研究分別以甲醇+水、甲醇+20%乙腈-水溶液、95%甲醇-乙腈溶液+水、甲醇+0.1%甲酸水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液作為流動相，梯度洗脫，觀察目標(biāo)物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UV-327峰形不理想或基線不穩(wěn)定，之后改用等度洗脫，分別以甲醇、甲醇+水、乙腈、乙腈+水以及乙腈+0.1%甲酸作為流動相考察被測組分的分離度，結(jié)果顯示，當(dāng)流動相為100%甲醇時，各組分分離良好，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響目標(biāo)物質(zhì)的測定。色譜柱溫度對組分的保留值及分離度有一定影響。本研究比較了不同色譜柱溫(室溫、30 ℃、35 ℃、40 ℃)對分析結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，室溫下各組分即可分離良好，因此，本研究色譜條件最終確定為流動相為100%甲醇，流速1.0 mL/min，檢測波長340 nm，室溫24 ℃下進樣分析，在此條件下，各組分可完全分離，色譜峰對稱性良好，且峰型尖銳。

綜上所述，本研究建立了小鼠血漿中UV-327和UV-328的高效液相色譜測定方法，該方法簡便快速，具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，可滿足小鼠血漿中UV-327和UV-328定性、定量分析的要求。