高效液相色譜法測定納他霉素假陽性結(jié)果的原因及其對策分析

李月月 賀亞如 磨家佳

摘 要：分析了高效液相色譜法測定月餅中納他霉素時產(chǎn)生假陽性的原因，并給出了相應(yīng)的對策建議。市場抽檢的30個月餅樣品中過半出現(xiàn)疑似目標(biāo)峰，通過加標(biāo)實驗、改變流動相比例、更換色譜柱及采用二極管陣列檢測器（DAD）光譜分析定性等方法排除假陽性。結(jié)果表明，采用DAD的光譜分析法佐以加標(biāo)實驗可以有效排除假陽性。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;納他霉素;DAD;假陽性

納他霉素是一種由多種鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的天然抗真菌化合物，屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類[1]，可以廣泛有效的抑制各種霉菌的生長，延長食品的保質(zhì)期而不影響其口味和外觀[2]，在食品工業(yè)中有一定的應(yīng)用價值[3]。納他霉素雖然是國家允許使用的防腐劑，但過量食用，納他霉素可中和抗體，損害身體健康[4]。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21915-2008中規(guī)定可用高效液相色譜（配紫外檢測器）法來測定食品中的納他霉素，但對于一些復(fù)雜樣品如糕點，基質(zhì)復(fù)雜，前處理難以消除部分基質(zhì)的干擾，容易出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象[5]，直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此如何排除假陽性顯得非常關(guān)鍵。

1 實驗過程

1.1 試劑

納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.0%）;納他霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（準(zhǔn)確稱取0.005 0 g納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液）;甲醇（色譜純）;乙腈（色譜純）;冰乙酸（優(yōu)級純）。

1.2 儀器

天平（0.000 1 g，梅特勒）;高效液相色譜儀—配紫外檢測器（島津LC-2030C）;高效液相色譜儀—配二極管陣列檢測器（賽默飛UltiMate3000）。

1.3 實驗步驟

準(zhǔn)確稱取5.00 g月餅皮，置于離心管中，加入30 mL甲醇提取30 min，加水10 mL，搖勻后置于離心機中以3 500 r/min離心5 min，取上清液過膜后上機測定。

2 結(jié)果與討論

本次實驗中的30個月餅樣品中過半出現(xiàn)了目標(biāo)峰，因此首先考慮假陽性問題。實驗過程中出現(xiàn)假陽性的原因有很多：樣品受到了污染、樣品基質(zhì)復(fù)雜或存在其他干擾組分。根據(jù)以上原因分析，需要對假陽性峰進(jìn)行逐一篩除。色譜中確認(rèn)和排除假陽性峰的方法有：加標(biāo)確認(rèn)、改變色譜條件、方法比對、質(zhì)譜確認(rèn)等。

2.1 樣品受到污染

在實驗前處理過程中，如果樣品受到污染，結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。處理方法是按照同樣的方法，對樣品進(jìn)行重新取樣、制樣、稱樣，使用清潔的容器重新進(jìn)行前處理操作，并同時做空白試驗。結(jié)果顯示空白樣品中未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰，而重新處理后的樣品目標(biāo)峰仍然存在，這樣就排除了樣品在前處理中代入污染物和容器被污染的可能性。

2.2 樣品中存在干擾物

當(dāng)樣品中存在干擾物時，首先考慮對該樣品進(jìn)行加標(biāo)。選取一個出現(xiàn)疑似目標(biāo)峰的樣品793（圖1a）進(jìn)行加標(biāo)，檢測結(jié)果如圖1b所示，加標(biāo)樣品中的納他霉素峰與疑似目標(biāo)峰完全重合在一起。

為分離793加標(biāo)樣品中加標(biāo)峰和干擾峰，首先考慮調(diào)整流動相，將甲醇變?yōu)橐译妫⒏淖兞鲃酉啾壤?，隨著有機相的減少，出峰時間推后，目標(biāo)峰出現(xiàn)分離，但沒有完全分離。然后更換色譜柱，出峰時間推遲，但仍然與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致，無法判斷是否為假陽性。

2.3 儀器原因

2.3.1 紫外檢測器

納他霉素的檢測一般使用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀，從保留時間來判斷目標(biāo)峰是否為納他霉素。但是對于復(fù)雜基質(zhì)樣品，現(xiàn)有前處理手段無法排除所有干擾，假陽性問題無法徹底排除。圖2為納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品（圖2a）與樣品793（圖2b）的色譜圖，從圖中可以看出，樣品793的目標(biāo)峰與標(biāo)準(zhǔn)品中的納他霉素峰保留時間十分接近，可以判定為陽性樣品。但是由于過半樣品檢測出相似的目標(biāo)峰，因此，首先考慮假陽性問題。

2.3.2 二極管陣列檢測器

二極管陣列檢測器（DAD）不僅可檢測純度，也可隨色譜峰的流出自動采集峰頂光譜圖，與計算機譜庫貯存的標(biāo)準(zhǔn)光譜圖進(jìn)行對比檢索[6]，大大提高了定性的可信度。

從圖3可以看出樣品793目標(biāo)峰的光譜圖（圖3b）與納他霉素標(biāo)品（圖3a）的光譜圖的最大吸收波長與峰型走勢都不同，而加標(biāo)樣品的納他霉素峰（圖3c）與納他霉素標(biāo)品的光譜圖基本一致，因此可以判定樣品793為假陽性。

3 結(jié)論

液相色譜法定性需要謹(jǐn)慎，保留時間接近或一致也可能不是同一種物質(zhì)，當(dāng)出現(xiàn)可疑數(shù)據(jù)時，應(yīng)經(jīng)過多方驗證加以排除。實驗表明，DAD光譜分析法佐以加標(biāo)實驗，可以有效排除糕點中納他霉素檢測的假陽性問題，此法簡單快速，適用于大部分假陽性問題的判斷，是解決假陽性問題的理想方法。

參考文獻(xiàn)

[1]WANG S H， LIU F， HOU Z W， et aL. Enhancement of natamycin production on streptomyces gilvosporeus by chromosomaL integation of the vitreosciLLa hemogLobin gene（vgh）[J].Word J MicrobioL BiotechnoL， 2014，30（4）：1369-1376.

[2]DONG X H， GAO W J， HE X P. AntifungaL efficacy of natamycin in experimentaL fusarium soLani keratitis[J].Int J OphthaLmoL，2012，5（2）：143-146.

[3]徐寶興，王艷芬，孫冬梅，等.納他霉素的特性及研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（22）：7426-7428.

[4]Repizo， L.M.， Martinez， L.D.， OLsina， R.A. et aL. A noveL and rapid method for determination of natamycin in wines based on ultrahigh-performance Liquid chromatography coupLed to tandem mass spectrometry：vaLidation according to the 2002/657/EC European decision[J].AnaL BioanaL Chem，2012，402：965-973.

[5]莫紫梅.高效液相色譜法測定糕點中納他霉素的含量[J].糧食與飼料工業(yè)，2016，8（16）：66-68.

[6]丁濤，徐錦忠，李建忠，等.高效液相色譜-二極管陣列檢測及電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺[J].色譜，2008，6（1）：6-9.